一种骨整合性改良的医用复合材料的制作方法

一种骨整合性改良的医用复合材料的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种骨整合性改良的医用复合材料，具体地，本发明的医用复合材料具有基体以及涂覆于基体上的涂层，其中所述的涂层为Ta涂层。本发明的医用复合材料具有良好的机械性能和骨整合性，因而非常适合用于医用移植物的制备，具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种骨整合性改良的医用复合材料

【技术领域】
[0001]本发明涉及复合材料领域，具体地，本发明提供了一种骨整合性改良的医用复合材料及其制法和用途。

【背景技术】
[0002]金属假体的作用已被越来越多的临床研究及临床前研究所检验。理想的假体材料应该具有恰当的弹性模量，优良的抗腐蚀性，良好的生物相容性及骨锚定性。但是绝大多数医用假体材料并不能同时满足上述特性。所以人们开发了多种不同种类的假体涂层来提高承重材料的骨相容性和骨诱导性。羟基磷灰石(HA)涂层就是这些涂层的优秀代表之一。HA涂层的钛(Ti)合金假体同时具有HA良好的生物活性及Ti合金的优异机械性能，从而在骨外科手术中被广泛的应用为骨组织的替代材料。但是HA及其他种类的陶瓷涂层脆性都相对较大，很容易从承重假体上脱落下来，这些缺点阻碍了 HA及其他陶瓷涂层的更广泛应用。所以医用移植物仍然需要具有良好的生物相容性，骨诱导性，化学稳定性，并能和基材牢固结合的新型涂层材料。
[0003]钽(Ta)是一种非常具有前景的医用假体涂层材料。Ta (原子序号73)是一种过渡稀有金属，在体内具有极高的抗腐蚀性和惰性。从上世纪中叶开始，Ta开始应用于医学实践并表现出良好的医学生物相容性和安全性。由于其优良的化学稳定性，体液抗性，生物相容性及和骨组织的生物结合的固定性，Ta被认为是一种非常有前景的生物材料。但是，Ta明显的高弹性模量及和骨组织机械不相容性使其不适合作为整块的医用假体材料。通过在假体表面制造多孔Ta涂层可能会提高Ta的医疗应用前景，这些多孔材料提供了较低的弹性模量，较高的表面阻力特性以及优良的骨整合性(比如，生物活性，生物相容性及骨长入性)。但是Ta相对较高生产成本和其复杂的生产工艺(需要在惰性环境进行，不可焊接，磨削困难及较高的溶解温度等)，限制了其在医疗实践中的广泛应用。
[0004]综上所述，本领域尚缺乏一种具有良好的机械性能和骨整合性的医用复合材料。


【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种适用于制备骨组织移植物的医用复合材料。
[0006]本发明的第一方面，提供了一种复合材料，所述复合材料包括:
[0007](a)基体，其中所述的基体为金属基体；和
[0008](b)涂覆于基体上的涂层，所述的涂层为Ta涂层。
[0009]在另一优选例中，所述的复合材料为医用复合材料。
[0010]在另一优选例中，所述基体表面全部或部分带有涂层。
[0011]在另一优选例中，所述的涂层具有选自下组的一个或多个特征:
[0012]所述涂层为多孔结构；和/或
[0013]所述的涂层厚度为30?500微米；和/或
[0014]所述涂层是通过真空等离子喷涂形成的。
[0015]在另一优选例中，所述的涂层厚度为40?300微米，较佳地为100?250微米。
[0016]在另一优选例中，所述的金属基体选自下组:Ti金属基体、Ti合金基体、不锈钢基体、Co合金基体，或其组合。
[0017]在另一优选例中，所述的基体是钛铝合金基体。
[0018]在另一优选例中，所述的基体是T1-6A1_4V基体。
[0019]在另一优选例中，所述的基体是T1-6Al_7Nb基体。
[0020]本发明第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的医用复合材料的用途，用于制备医用移植物。
[0021]在另一优选例中，所述的复合材料用于制备选自下组的移植物:人工骨、人工关节、脊柱内固定，牙齿种植体，下颌骨移植物，骨钉，骨板，外伤修复，髓内钉，或其组合。
[0022]在另一优选例中，所述人工关节包括:肩关节，髋关节，膝关节，肘关节。
[0023]本发明第三方面，提供了一种医用移植物，所述移植物包括:
[0024](a)基体，其中所述的基体是金属基体；和
[0025](b)涂覆于基体上的涂层，所述的涂层为Ta涂层。
[0026]在另一优选例中，所述的金属基体选自下组:Ti金属基体、不锈钢基体、Fe金属基体、Co合金基体，或其组合；
[0027]在另一优选例中，所述基体表面全部或部分带有涂层；和/或；
[0028]所述涂层位于所述移植物与骨接触的部位。
[0029]在另一优选例中，所述的涂层具有选自下组的一个或多个特征:
[0030]所述的涂层为多孔结构；和/或
[0031]所述的涂层厚度为30?500微米；和/或
[0032]所述涂层是通过真空等离子喷涂法制备。
[0033]在另一优选例中，所述的涂层厚度为40?300微米，较佳地为100?250微米。
[0034]在另一优选例中，所述的移植物用于与骨接触部位的移植。
[0035]在另一优选例中，所述的移植物用于骨质部位的移植。
[0036]在另一优选例中，所述的移植物用于选自下组的医用移植:人工骨、人工关节、脊柱内固定、牙齿种植体、下颌骨种植物、骨钉、骨板、外伤修复、骨髓内钉，或其组合。
[0037]在另一优选例中，所述人工关节包括:肩关节，髋关节，膝关节，肘关节。
[0038]在另一优选例中，所述复合材料通过真空等离子喷涂法制备。
[0039]在另一优选例中，所述的制备方法包括步骤:
[0040](i)提供一基材；
[0041](ii)通过真空等离子体喷涂技术，在所述基材上喷涂钽涂层。
[0042]在另一优选例中，所述基材为医用金属基材或医用金属合金基材。
[0043]在另一优选例中，所述基材是用选自下组的材料制备的:T1、Co、Fe、Ti合金、不锈钢、Co合金,或其组合。
[0044]在另一优选例中，在所述步骤(ii)中，所述的等离子体气体为Ar、H2和粉末载气的混合气体。
[0045]在另一优选例中，所述等离子体气体Ar的流量为35?50SLM (Standard LiterPer Minute);和 / 或
[0046]所述的等离子体气体H2流量为8?18SLM ;和/或
[0047]粉末载气流量为1.5?3.5SLM。
[0048]在另一优选例中，所述等离子体气体的喷涂距离为80?380mm。
[0049]在另一优选例中，所述真空等离子体喷涂技术中喷涂电流为500?700A ;和/或
[0050]送粉速率为10?30g/min。
[0051]本发明的第四方面，提供了一种制品，所述的制品具有本发明第一方面所述的复合材料或由本发明第一方面所述的复合材料所制成。
[0052]在另一优选例中，所述的制品包括医用制品。
[0053]在另一优选例中，所述的医用制品包括移植物。
[0054]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

【专利附图】

【附图说明】
[0055]图1流式细胞仪检测分离得到的hBMSC的表面标志分子，结果表明分离得到的hBMSC 为 CD29+，CD34' CD105+，CD44+，CD45' and CD90+ ；
[0056]图2hBMSC谱系分化:成骨细胞(ALP染色)，和成脂(Oil Red O染色)；
[0057]图3Ta涂层和Ti涂层的XRD图谱；
[0058]图4多孔Ta涂层表面和多孔Ti涂层表面的接触角
[0059]图5多孔Ta涂层表面和多孔Ti涂层表面的接触角(t检验，假设方差不等，误差线代表土SD，n=3 ；Ti 涂层，131.917±5.10882 ;Ta 涂层，130.455±5.55294 ;概率 > 111，
0.7125，表示无显著区别)；
[0060]图6SEM观测多孔Ta和Ti涂层的表面形态图，放大倍率:300X，500X，1000X，和3000 X ；
[0061]图7SEM观测两种涂层表面培养的骨髓间充质干细胞形貌图像倍率500X和800 X ；
[0062]图8hBMSC F-肌动蛋白细胞骨架在两种涂层表面形态培养3小时和24小时的激光扫描共聚焦显微镜图像(红，F-actin，蓝色，DAPI的细胞核)；
[0063]图9DRAQ5染色在Ta和Ti涂层表面上培养48h的hBMSCs的细胞量检测(t检验，假设方差不等，误差线代表土SD，n=3 ;Ti 涂层，65.377±18.2972 ;Ta涂层，164.80±46.1212 ；概率 >|t|，0.0498*)；
[0064]图lOPrestoBlue法检测各表面上hBMSCs的细胞存活率；(t检验，假设方差不等，误差条块代表土SD，n=3 ;在普通表面上hBMSCs的细胞存活率作为对照组)；
[0065]图1lhBMSCs在涂层表面培养48h的死活细胞活力实验；活细胞为绿色，死细胞为红色，黑色为未有细胞生长的涂层表面；
[0066]图12DAPI染色的hBMSCs在涂层表面培养48h的anti_Ki67实验；
[0067]图13hBMSCs在涂层表面培养7日的CFSE荧光情况直方图；其中，各曲线的意义如下:
[0068]黄色表示第O天的未种植于涂层表面的CFSE标记的hBMSC的荧光情况，hBMSC还没有分裂，CFSE的量没有因细胞分裂而减弱；
[0069]红色表示种植于Ta涂层表面5天后的CFSE标记的hBMSC的荧光情况，hBSMC内的CFSE由于细胞分裂而逐次减半递减，hBMSC的CFSE荧光信号都减弱，大部分hBMSC均发生了增殖，增殖活跃；
[0070]蓝色表示种植于Ti涂层表面5天后的CFSE标记的hBMSC的荧光情况，相对于种植于Ta涂层表面的hBMSC更多的hBMSC的CFSE荧光没有减弱，说明Ta涂层表面的hBMSC相对于Ti涂层表面的hBMSC增殖更加活跃；
[0071]绿色表示种植于表面涂有胶原蛋白的培养皿表面5天后的CFSE标记的hBMSC的荧光情况，CFSE荧光减弱明显；
[0072]图14实时PCR检测涂层表面成骨诱导液诱导培养21日的hBMSCs的RUNX2的mRNA表达。GAPDH作为参照(t检验，假设方差不等，误差条块代表土SD，n=3 ;Ti涂层，1±0.1404 ; Ta 涂层，1.9678±0.2370 ;概率 >|t|，〈0.01*)；
[0073]图15免疫荧光检测涂层表面培养6日和12日的hBMSCs的ALP蛋白表达；
[0074]图16ALP染色检测涂层表面培养3，7，15，21日的hBMSCs ；
[0075]图17新骨在体内植入的Ta和Ti涂层表面形成图，Van Gieson’ s Picric -Fuchsin对植入物周围形成的新骨进行染色；红色表示3个月内在植入物周围生长的新骨，双荧光标记用于表示新骨形成的矿化沉积率；绿色与白色箭头表示在3个月内的钙黄绿素的荧光标记；
[0076]图183个月内，体内涂层植入物周围形成的新骨量，(t检验，假设方差不等，误差条块代表土SD，n=3 ；Ti 涂层，14.0741 ±6.46293 ; Ta 涂层，32.6501 ±0.9072 ;概率 >|t|，
0.0358*)。

【具体实施方式】
[0077]本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，通过在Ti合金的医用材料表面喷涂Ta涂层，能够使材料保持优良的机械属性的通式，显著改善其骨整合性。基于上述发现，发明人完成了本发明。
[0078]术语
[0079]如本文所用，术语“医用移植物”或“医用种植物”(简称为“移植物”或“种植物”)指在临床上用于植入生物体内的医用假体，如人造骨骼、人造器官等、骨钉等。
[0080]术语“真空等离子喷涂法”、“真空等离子喷涂技术”、“真空等离子体喷涂技术”均可互换使用，均指在气氛可控的负压密闭容器内进行的等离子喷涂过程。
[0081]术语“金属基体”指金属或合金材质制成的基体，如Ti金属基体、Ti合金基体、铁(Fe)金属基体、不锈钢基体、钴(Co)合金基体等。特别地，在本发明中，所述的金属基体不是Ta金属基体。
[0082]医用复合材料
[0083]本发明提供的医用复合材料，包括:
[0084](a)基体，其中所述的基体为金属基体，包括(但并不限于)选自下组的基体:Ti金属基体、Ti合金基体、铁(Fe)金属基体、不锈钢基体、钴(Co)合金基体等。
[0085](b)涂覆于基体上的涂层，所述的涂层较佳地为Ta涂层。
[0086]在另一优选例中，所述的基体是钛铝合金基体，如T1-6A1_4V或T1-6Al_7Nb等，以提高复合材料的机械性能。
[0087]所述的涂层可以位于基体的全部或部分表面，较佳地，位于基体的部分表面，更佳地，位于与骨组织接触的部位，如白杯、髌骨假体、胫骨假体、股骨柄假体、肩关节盂和肱骨假体等。
[0088]所述的涂层可以是多孔结构，以改良涂层的表面阻力特性，弹性模量等机械性能。所述的涂层厚度没有特别限制，在本发明的优选例中，如本发明第一方面所述的复合材料，其特征在于，所述的涂层厚度为30?500微米，较佳地为40?300微米，更佳地为100?250微米。
[0089]所述的涂层可以通过各种常规手段制备，如化学沉积法、气相沉积法等。较佳地，所述的涂层可以通过真空等离子喷涂法制备。
[0090]在本发明的优选例中，所述的医用复合材料可以用于制备医用移植物。
[0091]在另一优选例中，所述的复合材料用于制备选自下组的移植物:人工骨、人工关节(如肩关节，髋关节，膝关节，肘关节等)、脊柱内固定，牙齿种植体，下颌骨种植物，骨钉，骨板，外伤修复，骨髓内钉。
[0092]医用移植物
[0093]本发明还提供了一种医用移植物，所述移植物包括:
[0094](a)基体，其中所述的基体包括(但并不限于)=Ti基体、Co基体、Fe基体、不锈钢基体、Ti合金基体，或其组合；
[0095](b)涂覆于基体上的涂层，所述的涂层为Ta涂层。
[0096]在另一优选例中，所述的基体是钛铝合金基体，如医用T1-6A1_4V等，以提高移植物的机械性能。
[0097]其中，所述涂层位于所述基体的全部或部分表面，较佳地，可以位于与骨组织接触的部位，如白杯、髌骨假体、胫骨假体、股骨柄假体、肩关节盂和肱骨假体等。
[0098]所述的涂层可以是多孔结构，以改良涂层的表面阻力特性，弹性模量等机械性能。所述的涂层厚度没有特别限制，在本发明的优选例中，所述的涂层厚度为30?500微米，较佳地为40?300微米，更佳地为100?250微米。
[0099]所述的涂层可以通过各种常规手段制备，如化学沉积法、气相沉积法等。较佳地，所述的涂层可以通过真空等离子喷涂法制备。
[0100]所述的移植物用于与骨细胞接触部位的移植，如骨钉、颌骨再造、腿骨移植等。
[0101]在另一优选例中，所述的移植物用于骨质部位的移植。
[0102]在另一优选例中，所述的移植物用于选自下组的医用移植:人工骨、人工关节(肩关节，髋关节，膝关节，肘关节)、脊柱内固定，牙齿种植体，下颌骨种植物，骨钉，骨板，外伤修复，骨髓内钉。
[0103]医用复合材料的制备
[0104]本发明还提供了一种医用复合材料的制备方法，所述复合材料通过真空等离子喷涂法制备。
[0105]较佳地，所述的制备方法包括步骤:
[0106](i)提供一基材；
[0107](ii)通过真空等离子体喷涂技术，在所述基材上喷涂钽涂层。
[0108]其中，基材可以是医用金属或医用金属合金，如T1、Co、Fe、Ti合金；或不锈钢、Co
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[0109]在本发明中，真空等离子体喷涂技术的各项工艺参数没有特别限制。一种优选的工艺包括以下的一个或多个特征:
[0110]所述的等离子体气体为Ar、H2和粉末载气的混合气体；
[0111]其中，所述等离子体气体Ar的流量为35?50SLM(Standard Liter Per Minute)；和/或
[0112]所述的等离子体气体H2流量为8?18SLM ;和/或
[0113]粉末载气流量为1.5?3.5SLM。
[0114]所述等离子体气体的喷涂距离为80?380mm。
[0115]所述真空等离子体喷涂技术中喷涂电流为500?700A ;和/或
[0116]送粉速率为10?30g/min。
[0117]在另一优选例中，所述制备工艺如下:
[0118]真空等离子体喷涂技术在基材上制备钽涂层，等离子体气体Ar流量35?50SLM(Standard Liter Per Minute),等离子体气体H2流量为8?18,粉末载气流量为1.5?
3.5SLM，喷涂距离为80?380_，喷涂电流为500?700A，送粉速率为10?30g/min。
[0119]本发明的主要优点
[0120](I)首次提供了一种具有良好的机械性能(弹性模量低、表面阻力特性高、抗腐蚀性能好)和骨整合性(生物相容性、生物活性、骨长入性)的医用复合材料；
[0121](2)首次提供了一种具有良好的机械性能和生物相容性的的医用移植物；
[0122](3)提供了一种新的医用复合材料制备方法。通过本发明方法制备的复合材料涂层结合牢固，脆性小，不易脱落；
[0123](4)本发明的制备方法成本低、生产工艺较现有工艺更为简单、因而非常适合用于工业化生产。
[0124](5)本发明的医用复合材料具有良好的骨相容性，相较于现有技术的Ti合金材料，本发明提供的具有Ta涂层的Ti合金材料能够使骨髓干细胞表现出更好的铺展状态，并有利于成骨过程。细胞增殖速度快、凋亡少。在体内骨整合实验中，也表现出了更好的新骨成型率，具有极大的应用价值。
[0125]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0126]伦理学声明
[0127]本实验已被上海交通大学附属医学院第九人民医院独立伦理委员会及上海交通大学附属医学院第九人民医院实验动物伦理委员会审核通过(沪科动伦
[2012]5)。实验所有兔实验动物从上海交通大学附属医学院第九人民医院动物房获取(SCXK2007-0007)。所有对动物的处理均按造上海交通大学附属医学院第九人民医院的规定进行。
[0128]实施例1复合材料的制备
[0129]Ta 及 Ti 涂层通过 VPS 系统(Sulzer, Winterthur, Switzerland)进行制备。医用T1-6A1-4V做为涂层的基材。检测BMSC体外增殖和分化的样本为1mmX 1mmX 2mm长方体及.033画乂201?11圆柱体。检测体内骨整合和新骨形成的样本为02mm X I Omra的圆柱体。
[0130]实施例2材料表面形貌检测
[0131]涂层表面形貌特性通过以下仪器进行:检测X光衍射仪(XRD，D/max2550v,Rigaku, Japan ；MDIJade6.5),接触角分析仪(SL200, Kino, Shanghai, P.R.China),扫描电镜(SEM，JSM6700F, JEOL, Akishima, Tokyo, Japan),电子探针(EPMA，JXA-8100，JEOL,Akishima, Tokyo, Japan)
[0132]实施例3BMSC的分离纯化及成骨成脂诱导
[0133]本实验所需试剂配制及主要仪器设备
[0134](I)磷酸缓冲液(PBS):9gNaCl, 1.44gNa2HP04.7Η20，0.25gKH2P04.2H20，用 1000ml超纯水配置，pH值调到7.2，高温灭菌后备用；
[0135](2) a-MEM 培养基(Hy c I one, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；
[0136](3)胎牛血清(FBS, Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；
[0137](4) 0.25%Trypsin_EDTA 溶液(GibcoTM, Invitrogen)；
[0138](5)DMSO(Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA)；
[0139](6) a -MEM培养液:a -MEM培养基入10%的胎牛血清，再加入100U/ml青霉素和100mg/l 链霉素(Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA),放于 4°C备用；
[0140](7)细胞冻存液:90%FBS，10%DMS0,放于 4°C备用；
[0141](8) 5% 二氧化碳培养箱:HerAcel1150 (Heraeus, Germany)；
[0142](9)超净工作台；
[0143](10)p!Uf(METTLERT0LED0320，Switzerland)；
[0144](11)电动吸引器(YB.DX.23D，上海)；
[0145](12)细胞计数仪(Invitrogen, Carlsbad, CA)；
[0146](13)台式水平离心机(5810R, Eppendorf, Germany);
[0147](14)电子分析天平(METTLERT0LED0，AB204-ESwitzerland);
[0148](15)纯水器(MilliporeUS);
[0149](16)液氮罐(BCBSCRY0 SYSTEMS,47/1IUS)；
[0150](17) CO2 培养箱(MCO-18AIC, SAVYO, Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan)；
[0151](18)六孔细胞培养板(Corning, Corning, NY, USA)；
[0152](19)成骨诱导液:a -MEM培养基，10%FBS, 50 μΜ抗坏血酸/维生素C(L-ascorbicacid2-phosphate, Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA),1mM -甘油憐酸钠能(β -glycerophosphate, Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA), 10nM 地塞米松(dexamethasone, Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA), lOOU/mL 青霉素，lOOmg/L 链霉素
[0153](20)成脂诱导液:a -MEM培养基，10%FBS, I μ M dexamethasonephosphate, 200 μ MIndomethin (Sigma - Aldrich, St.Louis, MO,USA),10 μ g/m Linsulin (Sigma - Aldrich,St.Louis, MO, USA),0.5mM3-1sobutyl-l-methylxanthine (IBMX, Sigma - Aldrich,St.Louis, MO, USA), lOOU/mL 青霉素，lOOmg/L 链霉素
[0154](21)成脂维持液:a -MEM 培养基，10%FBS, 10 μ g/mL insulin, lOOU/mL 青霉素，lOOmg/L链霉素
[0155](22) 4% 多聚甲醛；
[0156](23) 0.5%油红O:0.5g油红O粉剂加入10ml异丙醇，搅拌溶解，滤纸过滤后室温备用，避光保存。
[0157]3.1BMSC的分离纯化方法
[0158]将临床上获取的人骨髓抽吸物和a -MEM培养液(ImL抽吸物:20mL培养液)吹打混匀后接种0 [OOram培养皿；于5%C02培养箱中37° C孵育培养，48h全量换液除去未贴壁的杂细胞，以后每3天全部换液一次；当细胞生长达85%汇合时，吸取原有培养液后用PBS清洗一次，再用0.25%Trypsin-EDTA消化2min左右，500g，5min室温离心收取细胞，用适量37°C新鲜培养液重悬后，细胞计数，按照2X105/cm2传代，成为第一代细胞(Pl);再经过两次传代(一般比例为1:3)后，大部分细胞于液氮罐中冻存，留少量细胞进行试验。
[0159]冻存的程序为:消化细胞 >> 使用冻存液重悬细胞 >> 调整细胞浓度 >> 程序冻存盒一 70° C过夜》移至液氮罐。
[0160]3.2成骨诱导
[0161]种植BMSCs到六孔板(5X 104cells/well)，a -MEM培养液培养，融合后加入成骨诱导液，每 3 天换液一次，7 天后通过 BCIP/NBT ALP Color Development Kit (Beyotime,P.R.China)进行染色。
[0162]3.3成脂诱导
[0163]种植BMSCs到六孔板(2X 105cells/well)，a -MEM培养液培养，融合后加入成脂诱导液2天，然后成脂维持液培养I天。反复上述过程到14天进行油红O染色。
[0164]3.4油红O染色
[0165]吸弃培养基后以PBS清洗2次；
[0166]以4%的多聚甲醛固定细胞20min ；
[0167]双蒸水漂洗3次后空气晾干；
[0168]新过滤0.5%的油红O室温染色I小时；
[0169]70%乙醇漂洗3次后镜下观察油红染色阳性的细胞。
[0170]实施例4细胞活力及细胞骨架
[0171]本实验所需试剂配制及主要仪器设备
[0172](1)24 孔培养板(Corning, Corning, NY, USA)；
[0173](2)DRAQ5 (Danvers, MA, USA)；
[0174](3)Odyssey near-1nfrared scanner (L1-COR B1sciences, Millipore,Billerica, MA, USA)；
[0175](4)PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Life Technologies,Carlsbad, CA, USA)；
[0176](5)microplatereader (InfiniteM200pro, TECAN, Switzerland)；
[0177](6)LIVE/DEAD Cell Viability Assays (Invitrogen, Life Technologies,Carlsbad, CA, USA)；
[0178](7)Phalloidin-TRITC (Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA)；
[0179](8)Ant1-Ki67 抗体(Abeam, Cambridge, UK)；
[0180](9)DAPI (Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA)；
[0181](9) a-MEM 培养基(Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；
[0182](10) a -MEM培养液:a -MEM培养基入10%的胎牛血清，再加入100U/ml青霉素和100mg/l 链霉素(Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA),放于 4°C备用；
[0183](Il)CO2 培养箱(MC0-18AIC (UV), SAVYO, Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan)；
[0184](12)共聚焦显微镜(LSM510, CarlZeissAG, Oberkochen, Germany)
[0185]4.1检测细胞活力及细胞骨架实验方法
[0186]1mmX 1mmX 2mm 样本放入 24 孔培养板加入 BMSCs (2X 104cells/well), a -MEM培养基培养24h，将样本放入新的24孔培养板。用DRAQ5进行DNA的荧光染色。样本通过Odyssey near-1nfrared scanner进行扫描检测涂层表面的增殖情况。Presto Blue CellViabilityReagent用于检测细胞活力，并使用microplatereader检测570and650nm的吸光度。死活细胞染色通过LIVE/DEAD Cell Viability Assays进行。F-actin通过荧光标记的鬼笔环肽进行检测。Ant1-Ki67抗体用来检测BMSC的Ki67表达情况，DAPI用来标记BMSC的细胞核。最后使用共聚焦显微镜进行观察。CFSE标记实验使用CFDA-SE (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)对hBMSC进行标记，CFDA-SE进入细胞后被非特异性的脂酶切除乙酸基后形成CFSE，可与细胞内多肽及蛋白质发生非特异性不可逆稳定的共价键结合。经标记的hBMSC种植于放置于六孔板(Corning, NY, USA)中的0 33臟X 2 mm的样本上，24小时后样本转入新的六孔板继续培养。培养5天后，使用流式细胞仪(FranklinLakes, NJ, USA)对标记的hBMSC进行检测。
[0187]4.2涂层表面BMSC的ALP染色
[0188]033mmX 2.2mm的样本放入六孔板(Corning，NY, USA)加入 BMSC (5X 14Cells/well), a -MEM培养基培养24小时后转入新的六孔板再培养24h，然后用成骨诱导液培养，每 3 天换液一次。使用 BCIP/NBT ALP Color Development Kit (Beyotime, P.R.China)进行染色，并用 Odyssey near-1nfrared scanner (L1-COR B1sciences, Millipore,Billerica, MA, USA)及普通扫描仪(Cannon, Tokyo, Japan)进行扫描。
[0189]4.3In_Cell Western
[0190]4% 多聚甲醒用于固定，Odyssey Blocking Buffe (L1-COR B1sciences,Millipore, Billerica, MA, USA)用于封闭和抗体稀释，ALP antibody (SantaCruzB1technology, SantaCruz, CA, USA)用于检测涂层表面BMSC的ALP蛋白表达。孵育后Infra-Red Secondary Antibody IRDye (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville,PA, USA)做为二抗，最后通过 Odyssey Infrared Imaging System (L1-COR B1sciences,Millipore, Billerica, MA, USA)进行检测。
[0191]实施例5多孔Ta涂层上BMSC成骨分化的基因表达
[0192]本实验所需试剂配制及主要仪器设备
[0193](I)DEPC水的配制:将Iml DEPC加入I升Mill1-Q超纯水中，搅拌过夜；高温灭菌15min并失活DEPC后，室温储存备用；
[0194](2)反转录试剂盒(Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；
[0195](3)各 PCR 引物:Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA)合成，用 DEPC 水配成1mmoI/L 浓度，-20°C保存；
[0196]GAPDH:
[0197]正向引物(SEQID NO:1)GCACCACCAACTGCTTA
[0198]反向引物(SEQID NO:2)AGTAGAGGCAGGGATGAT
[0199]Runx2:
[0200]正向引物(SEQID NO:3)TGTTCTCTGATCGCCTCAGTG
[0201]反向引物(SEQID NO:4)CCTGGGATCTGTAATCTGACTCT
[0202](4)荧光定量 PCR 试剂盒(SYBRPremixExTaq, TaKaRa)；
[0203](5)TriPure Isolat1n Reagent (Roche, Basel, Switzerland),4°C保存；
[0204](6)氯仿(分析纯)；
[0205](7)异丙醇(分析纯)；
[0206](8) RealTime PCR 仪 Lightcycler480 (Roche, Basel, Switzerland)；
[0207](9)低温台式离心机(Eppendorf)。
[0208]实时定量PCR
[0209]通过TriPure Isolat1n Reagent 提取总 RNA ;等量 lug RNA 通过 Revert AidFirstStrand cDNA Synthesis Kit (Fermentas,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)进行反转录；每20μ I反应体系中加入I μ g的RNA，I μ I oligo(dT) 16和RNA-free的水至6.5 μ 1，混匀后在70°C孵育5min，迅速放在冰上；加入5X缓冲液4 μ 1，2.5mMdNTP8 μ I,混勻，加入 100 单位的 Revert Aid M-MuLV 反转录酶(0.5μ I) (Fermentas,Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA),混勻后 42°C 孵育 60min ；70°C 1min 后停止反应，样品放于_20°C保存；取反转录获得的cDNA作为模板检验成骨相关基因的表达，使用 SYBR Premix ExTaq? 系统(Takara, Otsu, Shiga, Japan) ;10μ I
[0210]反应体系如下:5μ I SYBR Premix ExTaq supermix+2pmo 1/1 正反引物+0.5 μ IcDNA模板,其余用水补齐。每个样品至少采用4个复孔；LightcycIer480 (Roche,Basel, Switzerland)进行实时 PCR 反应；
[0211]反应条件:95°C，10s_(95°C，10s ;60°C，20s，40 个循环)一溶解曲线一4°C ;采用Roche Lightcycler480software (Roche, Basel, Switzerland)进行数据分析；
[0212]实施例6体内植入实验研究
[0213]本实验所需试剂配制及主要仪器设备
[0214](I)在多孔Ta涂层假体材料直径2mm，长度10mm，由中国科学院上海硅酸盐研究所提供；
[0215](2)Technovit7200VLC (Exakt, Norderstedt, Hamburg, Germany)；
[0216](3)EXAKT400CS MicroGrinding System with AffI1controlIer (Exakt,Norderstedt, Hamburg, Germany)
[0217](4)EXAKT510Dehydrat1nand Infiltrat1n System (Exakt, Norderstedt,Hamburg, Germany)
[0218](5)EXAKT520Light Polymerizat1n System (Exakt, Norderstedt, Hamburg,Germany)
[0219](6)品红苦味酸染色液(VanGeison):1%酸性品红溶液10ml、苦味酸饱和水溶液10ml ；
[0220](7) 2%戊巴比妥钠溶液注射液；[0221 ] (8)直径2mm的钻头及电转；
[0222](9)全套的手术器械:主要包括，手术刀片，刀柄，剪刀，镊子，止血钳，持针器，缝针，缝线，拉钩，注射器等；
[0223](10)手术铺单与手术衣；
[0224](11)消毒液:碘伏，75%酒精；
[0225](12) I丐黄绿素(Sigma - Aldrich, St.Louis, MO, USA)；
[0226](13)硬组织切片机(Leica, SP1600Germany)；
[0227](14)荧光倒置显微镜(LEICADM4000B，German)；
[0228](15)图像分析软件(B1QUANT)
[0229]6.1动物模型构建
[0230]动物手术前一天准备手术用具，假体经高压消毒后烘干；手术器械高压消毒烘干；手术铺单等消毒烘干；麻醉药配置；手术室清洁紫外灭菌。
[0231]采用雄性新西兰大白兔(3月，2.8 - 3.0kg)制作股骨缺损假体模型，肌肉注射2%戊巴比妥钠溶液(20mg/Kg)麻醉；充分麻醉后固定，兔取仰位，下肢股骨髁术区备皮，常规消毒、铺巾；沿股骨髁纵向切开皮肤、皮下组织，应尽量避开肌肉群，肌间暴露股骨髁；推开骨膜检查股骨髁四周边界，确定钻洞位置；02mm钻头与骨面垂直钻洞，深度应以不钻透对侧皮质骨为宜，固定位置防止滑动；放入假体，保证材料表面不高于皮质骨；从内至外逐层缝皮；动物复苏恢复观察后放回动物房常规饲养。为避免伤口感染，术后3天每天青霉素注射一次。
[0232]6.2突光双标及标本获取
[0233]第一次标记于动物处死前10天注射，第二次标记于动物处死前3天注射。钙黄绿素(8mg/kg)双标。过量麻醉处死，获取其股骨髁与骨干部分。
[0234]6.3组织学观察
[0235]6.3.1标本包埋
[0236]标本固定:10%甲醛溶液固定10d，自来水冲洗过夜；
[0237]梯度酒精脱水:75%, 85%，90%, 95%，100%, 5个梯度对标本行脱水处理。
[0238]Technovit7200VLC (Exakt, Norderstedt, Hamburg, Germany)对标本进行真空渗透2d。
[0239]通过EXAKT520Light Polymerizat1n System (Exakt, Norderstedt, Hamburg,Germany)使 Technovit7200VLC 光聚合 10h。
[0240]6.3.2硬组织切片
[0241]米用Saw Microtome LeicaSP1600(Leica,Wetzlar,Germany)硬组织切片机切片，切片厚度为 100 μ m, EXAKT400CS Micro Grinding System with AffI1controIIer(Exakt,Norderstedt, Hamburg, Germany)打磨至 50 μ m,抛光。
[0242]6.3.3苦味酸一品红染色
[0243]超声洗片2min ；0.1%甲酸3min ;流水冲洗2min ；20%甲醇2h ;流水冲洗2min,擦干；60°C Stevenol蓝染色5_15min ;60°C蒸馏水洗；VG染液染色3_8min ；100%乙醇清洗；蒸馏水洗，晾干。
[0244]通用方法
[0245]组织形态计量
[0246]染色前后组织切片在显微镜(LEICA DM4000B，German)下拍摄，使用半自动分析软件(B10QUANT)进行计量分析。
[0247]统计分析
[0248]统计分析采用SAS JMP (Cary，NC，USA)进行。双样本均数比较才Aspin-Welch-Satterthwaite-Student’ s t-test,数据以均数土标准差表示，Ρ〈0.05为显著差异，以*标记。
[0249]实验结果
[0250]1.BMSC 鉴定
[0251]为了评估多孔钽涂层的生物相容性和骨诱导性，我们采用本研究材料和方法部分里所述方法提取纯化BMSC。通过流式细胞仪检测，分离得到的细胞表达MSC的表面标志⑶29，⑶105，⑶44和⑶90，但不表达造血表明标志⑶34及白细胞标志⑶45 (图1)，表明我们提取的BMSC的细胞特性和已知的BMSC细胞相类似。另外我们也通过ALP和油红O检测了 BMSC向成骨和成脂方向的分化能力(图2)。这些实验数据表明BMSC具有成骨和成脂分化的潜能，可以用于后续的实验。
[0252]2.涂层表面形貌
[0253]图3显示了 XRD图，实验结果表明，多孔Ti涂层表面主要成分为Ti，多孔Ta涂层表面主要为Ta及少量的Ta氧化物。多孔Ta涂层表面的氧化层(Ta2O5)在多种pH值下都很稳定。
[0254]如图4和图5所示，多孔Ta涂层表面和多孔Ti涂层表面的接触角检测未见明显区别(n=3 ；Ticoating, 131.917±5.10882 ；Tacoating, 130.455±5.55294 ；p=0.7125)。
[0255]如图6所示，我们通过SEM来观测多孔Ta和Ti涂层的表面形态(300 X，500 X，1000X，和3000X )，可见多孔Ta和Ti涂层的表面粗糙度相近。
[0256]3.多孔Ta涂层表面hBMSC细胞形态和细胞骨架张力
[0257]BMSC在多孔Ta涂层表面表现出相对Ti涂层更好的铺展状态(图7，图8)。SEM的实验结果表明在多孔Ta涂层表面的BMSC表现出扁平铺展的状态。F-actin细胞骨架染色(图8)也表明在多孔Ta涂层表面的BMSC表现出和多孔Ti涂层表面BMSC不同细胞骨架张力和扁平铺展的状态。
[0258]4.多孔Ta涂层表面BMSC的粘附和增殖
[0259]我们应用DRAQ5来检测涂层表面的BMSC的生长情况。图9表明BMSC在多孔Ta涂层表面有比多孔Ti涂层表面更快的增殖速度(48h，n=3 ；Ti coating, 65.377±18.2972 ；Ta coating, 164.80±46.1212 ；P<0.0498*)。
[0260]如图10所示，PrestoBlue的结果表明第4及6天后在多孔Ta涂层表面BMSC有比在多孔Ti涂层表面更快的增殖速度(n=3 ;第2天:Ti coating,0.45268±0.097954 ；Ta coating, 1.0767±0.495686，P=0.992 ；第 3 天:Ticoating，0.56950±0.089554，Tacoating, 1.26228±0.458399，Ρ=0.0620 ；第 4 天:Ti coating,0.90275±0.082739，Tacoating, 2.13239±0.699593，Ρ〈0.0390* ；第 6 天:Ti coating, 0.86752±0.089092，Tacoating, 1.68688±0.386935, P〈0.0233*)。
[0261]死活细胞活力实验(图11)以及anti_Ki67实验(图12)表明在多孔Ta涂层表面的BMSC不但增殖的更快，而且凋亡的更少。
[0262]CFSE实验(图13)表明BMSC在多孔Ta涂层表面相对更快的增殖速度/细胞活力不只是由于BMSC可以更好的粘附在多孔Ta涂层表面，其在多孔Ta涂层表面的更快生长速度也起到一定作用。
[0263]5.多孔Ta涂层表面的BMSC的ALP及RUNX2表达情况
[0264]对在多孔Ta涂层表面的BMSC通过成骨诱导液进行成骨诱导，可以检测到BMSC的RUNX2的mRNA表达在多孔Ta涂层表面的相对上调(n=3 ；Ti coating，I±0.1404 ;Tacoating, 1.9678±0.2370 ；P<0.01*)(图 14)。
[0265]通过免疫荧光(图15)和ALP染色(图16)表明在多孔Ta涂层表面BMSC具有更高的ALP的表达水平。上述结果表面多孔Ta涂层相对于多孔Ti涂层更有利于hBMSC的成骨过程。
[0266]6.多孔Ta涂层假体的体内骨整合
[0267]我们使用Van Gieson’ s Picric - Fuchsin染色的硬组织切片用来观察多孔Ta,Ti涂层假体的骨整合情况。新骨形成率通过钙黄绿素双标来进行检测。假体植入体内3个月后，组织形态学计量提示多孔Ta涂层周围的新生骨明显多于多孔Ti涂层假体(图17，图18，n=3;Ti coating，14.0741 ±6.46293 ;Ta coating，32.6501 ±0.90721 ;Ρ〈0.0358*)。钙黄绿素双标图17表明多孔Ta涂层假体周围相对多孔Ti涂层假体周围有更高的新骨形成率。
[0268]讨论
[0269]过去的20年来，许多不同种类的涂层及材料都被用来提高假体的生物牢固度。由于Ti合金具有优良可靠的机械属性，其是一种非常合适的承重的生物材料。但和其他大多数金属一样，Ti的成骨诱导性并不强。在生物金属材料里，Ta是一种越来越被大家所注意的新型生物材料。在体内，Ta表现出很强的抗腐蚀及优良生物活性，但相对高昂的制作费用及其自身的较难的加工性阻碍了 Ta的广泛应用。为了能够在承力假体发挥出Ta的优良的生物相容性能，本研究通过真空等离子喷涂技术在Ti的基材上制备了多孔Ta涂层。而后我们评估了通过真空等离子喷涂制备的Ta涂层的生物相容性及骨诱导性。
[0270]正如在SEM细胞形态学实验，F-actin细胞骨架染色实验以及PrestoBlue细胞活力实验中所见的，体外BMSC和材料相互作用结果明确提示多孔Ta涂层表面显著提高了BMSC的黏附和细胞增殖。假体表面材料的特性和生物相容性非常依赖于材料和细胞的相互作用，生物材料可以通过这种细胞材料的相互作用影响细胞的反应及行为。我们实验结果表明BMSC在多孔Ta涂层表面相对多孔Ti涂层表面具有好得多的细胞粘附及细胞增殖。这些结果提示Ta表面是具有生物相容性的，并可以显著影响BMSC的生物学行为。一般来讲，初始的粘附影响了后续的干细胞分化，从粘附而来的不同细胞骨架信号传递到细胞核，在那里它们可以改变基因信号的表达及更进一步的改变细胞分化过程。McBeath等证明细胞形态会调节BMSC的成骨成脂分化命运。比如，可以附着变平伸展的BMSC会进入成骨进程，而那些聚集浑圆的细胞会变为成脂细胞。在本研究中，F-actin细胞骨架蛋白染色揭示BMSC在多孔Ta涂层表面呈扁平伸展状。所以在在多孔Ta，Ti涂层表面不同的BMSC F-actin细胞骨架可以部分解释BMSC在多孔Ta涂层表面较高的成骨能力。进一步的，多孔Ta涂层相对多孔Ti涂层不但增加了 BMSC的粘附及增殖，同时在体外也更有利于干细胞的成骨分化。这些结论被ALP及RUNX2在多孔Ta涂层表面的BMSC的高表达所证实。一种可能的解释是弹性与骨近似的基底表面可能有利于骨的新生及BMSC的分化。这样，由于和骨小梁具有相近的弹性，多孔Ta涂层可能因此更有利于成骨。在体内实验，通过兔的股骨缺损模型，由于Ta具有较好的生物相容性和生物活性，所以相对多孔Ti涂层假体，多孔Ta涂层假体具有更好的骨整合性。另外，多孔Ta涂层的关键属性是其可以形成自钝化的表面氧化层。在体内这层表面氧化层发生水和作用生成Ta-OH，其和体内的Ca2+离子形成某种钙化钽，而后和磷酸根离子及后续的大量Ca2+离子和磷酸根离子形成磷灰石层，而这层表面在体内导致了骨样磷灰石的形成，从而使骨和纤维结构可以更容易的长入，并为后续骨-软组织快速大量附着提供调条件。我们体内的实验也表明在多孔Ta涂层相对于在多孔Ti涂层具有更高的新骨形成率。这和我们体外多孔Ta涂层上BMSC具有更高的细胞粘附增殖和成骨分化也是相符的。
[0271]这些结果表明多孔Ta涂层在体外具有支持干细胞分化为成骨细胞的能力，在体内具有支持成熟骨细胞的的能力。多孔Ta是一种在体内具有优异生物相容性和使用安全性的生物材料，是一种具有吸引力的临床应用选择。虽然仍然需要长期实验及临床研究来证明其优点和疗效，应用VPS的多孔Ta涂层作为骨科移植物涂层促进骨再生的应用前景已经被打开。
[0272]结论
[0273]我们通过VPS在Ti合金基材表面制备了多孔Ta涂层。多孔Ta涂层有效的减少了金属移植物和骨组织的机械不相容性。我们通过检测多孔Ta涂层假体的生物相容性骨诱导性及骨整合性，来确定多孔Ta涂层假体是否适合临床应用。在体外，结果表明在多孔Ta涂层表面BMSC的细胞粘附，增殖和成骨分化均较在多孔Ti涂层表面有所提高。更进一步的，体内兔股骨缺损假体实验模型表明多孔Ta涂层假体具有优良的骨整合和新骨形成率。我们的结果表明VPS制备的多孔Ta涂层是一种有希望的骨修复方式。
[0274]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种复合材料，其特征在于，包括: (a)基体，其中所述的基体为金属基体；和 (b)涂覆于基体上的涂层，所述的涂层为Ta涂层。
2.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述基体表面全部或部分带有涂层。
3.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述的涂层具有选自下组的一个或多个特征: 所述涂层为多孔结构；和/或 所述的涂层厚度为30?500微米；和/或 所述涂层是通过真空等离子喷涂形成的。
4.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述的金属基体选自下组:Ti金属基体、Ti合金基体、不锈钢基体、Co合金基体，或其组合。
5.如权利要求1所述的医用复合材料的用途，其特征在于，用于制备医用移植物。
6.一种医用移植物，其特征在于，所述移植物包括: (a)基体，其中所述的基体是金属基体；和 (b)涂覆于基体上的涂层，所述的涂层为Ta涂层。
7.如权利要求6所述的移植物，其特征在于，所述基体表面全部或部分带有涂层；和/或.所述涂层位于所述移植物与骨接触的部位。
8.如权利要求6所述的移植物，其特征在于，所述的涂层具有选自下组的一个或多个特征: 所述的涂层为多孔结构；和/或 所述的涂层厚度为30?500微米；和/或 所述涂层是通过真空等离子喷涂法制备。
9.如权利要求1所述的复合材料的制法，其特征在于，所述复合材料通过真空等离子嗔涂法制备。
10.一种制品，其特征在于，所述的制品具有权利要求1所述的复合材料或由权利要求1所述的复合材料所制成。
【文档编号】A61L27/04GK104127913SQ201310163527
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年5月3日 优先权日:2013年5月3日
【发明者】张晓玲, 谢有桃, 汤赜, 戴尅戎 申请人:中国科学院上海生命科学研究院