Ctrp4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物的应用的制作方法

Ctrp4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物的应用。本发明的上述应用可以制备有效地治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物。
【专利说明】CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病 的药物的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及人类CTRP4蛋白质的新应用，具体地本发明涉及CTRP4蛋白质作为制 备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物的应用。

【背景技术】
[0002] 本案 申请人:于2010年7月16日向中国专利局提交了发明名称为"人类CTRP4基 因、其编码的蛋白质及它们的应用"的发明专利申请，该申请于2012年2月1日公开，公开 号为CN102337268A。该专利申请公开了人类CTRP4基因、其编码的蛋白质及它们的一部分 应用。
[0003] 本案发明人基于此，对CTRP4蛋白质的应用进行进一步研究。尤其？深入研究其 作为制备治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物的应用。
[0004] LPS是革兰氏阴性细菌外壁层特有的化学成分，主要有类脂A、核心多糖和0-抗 原三部分组成。机体固有免疫系统对LPS的识别具有两套不同的反应体系，细胞膜表面模 式识别受体TLR4/MD2复合物可特异性识别被LPS结合蛋白（LPS binding protein，LBP) 和⑶14转运至细胞膜表面的LPS，并向胞内传递跨膜信号，通过依赖MyD88和非依赖MyD88 途径活化下游NFk B、MAPK和JNK等信号通路，产生固有免疫应答；体液固有免疫分支中 具有糖识别结构域的可溶性模式识别分子，如补体Clq、collectins (MBL、SP-A、SP-D)、 pentraxins (CRP、SAP、PTX3)和ficlins等，也可以有效识别并结合LPS，防止LPS继续扩散 诱发LPS毒性并介导LPS的清除。
[0005] 内毒素休克（endotoxic shock)是由短时间大量LPS诱发严重的内毒素血症所 致，给予足量的液体复苏仍无法纠正持续性低血压，并伴有器官低灌流状态和血管微循环 障碍（DIC)，最终大多死于多器官功能衰竭（multiple organ failure, M0F)。尽管现在的 抗生素治疗和生命体征支持疗法都得到长足的发展，但是内毒素血症一旦发展为内毒素性 休克，死亡率还是高达20%?80%。大量文献报道，固有免疫应答过强和后继的适应性免疫 应答下降分别是内毒素性休克早期和晚期死亡的主要原因。而早期固有免疫应答过程开始 于机体模式识别受体与病原体的识别后诱发的级联炎症反应。
[0006] 补体成分在固有免疫系统中发挥着举足轻重的作用。现已知有三条不同的补体活 化途径：经典活化途径、旁路活化途径和凝集素活化途径，涉及30多种蛋白质分子。Clq是 补体经典活化途径中的第一个成员，是由A、B和C三个亚基组成的异源18聚体。每个亚基 都是由N-端信号肽、可变区、胶原样结构域(活化补体成分Clr等）和C-端C1Q球状结构 域(识别免疫复合体等)组成。研究发现，除了免疫复合物之外，C1Q球状结构域还可以识别 许多其他性质的配体，如聚集的IgG、IgM、HIV-l中gp21多肽、β-淀粉样蛋白、细菌细胞壁 成分LPS、凋亡细胞和急性时相反应蛋白等。由于C1Q球状结构域的广谱的配体识别域，补 体Clq分子表现出广泛而多样化的免疫调节功能，除了结合免疫复合体活化补体经典途径 之外，还具有调节凋亡细胞清除诱导免疫耐受、中和病毒、局限并清除细菌、介导吞噬和细 胞之间的粘附等[3CH32]。现有研究证实，补体Clq分子可直接与LPS结合，并可在多种细胞 中调节LPS诱导的细胞因子分泌。CTRPs超家族成员分子均具有C1Q球状结构域，目前虽没 有具体数据证明该家族中C1Q球状结构域与LPS之间的相互作用，但是作为该家族分子的 种内同源分子脂联素可通过其C1Q球状结构域与LPS发生明显的相互作用，并可体外抑制 LPS诱导的NF-κ B活化及细胞因子分泌，另外，CTRP3虽然不能直接和LPS结合，但可能与 LPS特异性受体复合物TLR4/MD2发生相互作用，阻断LPS与TLR4/MD2的有效结合，发挥抵 抗LPS的生物学活性。
[0007] 现有技术已经公开的CTRP4是具有两个C1Q球状结构域CTRPs超家族成员，其C1Q 球状结构域与补体Clq分子高度同源。因此，为了深入探讨CTRP4在固有免疫系统中的生 物学功能，我们将CTRP4与LPS之间的关系作为研究重点，以期发现CTRP4在固有免疫应答 中可能发挥的作用。
[0008] 炎症是机体对损伤因子、因素产生的应激和防御反应。任何对机体有害的因素都 可以诱发炎症反应，如生物及理化因素引起的感染，组织与细胞损伤等。炎症反应是把双刃 剑，适度的炎症反应对机体清除病原感染，组织修复以及稳态的维持具有积极意义，但是过 度的或者持续不可控的慢性炎症反应会对机体造成严重的损害甚至危及生命，例如炎症性 肠病和SARS。炎症反应是多细胞和多因子共同参与的反应，其中，吞噬细胞是启动炎症反 应的重要细胞。吞噬细胞表面表达多种模式识别受体(甘露糖受体，葡聚糖受体，Toll样受 体)，能迅速识别入侵的外源性生物及内源性损伤信号，产生和释放大量促炎细胞因子，例 如IL-6, TNF-α，IL-1 β，IL-8等，这些炎症性细胞因子发挥多种功能，包括致炎，致热，趋 化炎性细胞，激活适应性免疫细胞等作用。单核巨噬细胞、中性粒细胞、ΝΚ细胞、Τ细胞、Β 细胞，上皮细胞等都参与炎症反应。因此，炎症是多细胞多因素参与的复杂过程，在研究炎 症的过程中利用动物模型能够更好的模拟炎症的真实性。
[0009] 转基因小鼠是指通过实验方法将特定外源基因导入早期胚胎细胞并整合至染色 体上，通过生殖细胞传递到子代，从而得到的小鼠。1980年Goden博士在实验室通过把重组 基因注射到小鼠的受精卵中，获得了第一只转基因小鼠，这一技术为研究哺乳动物基因在 体内的表达调空功能创造了一个非常有力的手段。1982年，Palmiter，R. D等人把金属硫蛋 白I的基因和大鼠的生长激素基因融合后，同样应用显微注射的方式注入到小鼠的受精卵 原核中，发现21只存活的小鼠中有6只体重大于同窝的小鼠，而这些转基因动物的血清中 生长激素和肝脏中的融合基因的表达水平都是升高的，这一研究结果又使转基因技术前进 了一步，提供了融合基因的转基因方法，为研究遗传性疾病的治疗提供了良好的开端。1988 年之后，这种把外源性基因转入到受精卵并且在机体内成功表达的模型已经达到了空前的 规模，应用范围扩展到了各种基因的功能研究，免疫系统，哺乳系统的发育等各个环节。例 如，使用肺脏组织特异性的启动子高表达IL-9时，IL-9转基因小鼠出现了自发性肺部炎症 反应；应用转基因技术研究人类慢性乙型肝炎已相当普遍。
[0010] 近些年来，我们国家对于炎症性肠病（IBD=inflammatory bowel disease)的重视 程度在上升，而从世界范围来看，我们对于炎症性肠病的认识也因为免疫学的发展和对肠 道内菌群研究的深入得到了很大的发展。现在关于炎症性肠病的病因学研究认为，是因为 多种因素导致的，包括遗传因素，环境因素，免疫系统的紊乱，还有肠道菌群的问题。
[0011] 另外，肺炎也是一种危害很大的炎症性疾病，包括细菌性肺炎和病毒感染引起的 肺炎或者急性严重肺损伤。因此期待本发明的CTRP4蛋白质能够在肺炎的治疗中发挥有效 的作用。
[0012] 葡聚糖硫酸钠（DSS)诱导的小鼠急性结肠炎模型，是通过在饮用水中加入DSS几 天，诱导出以血便，溃疡，炎症细胞浸润，体重减轻，腹泻等为特点的急性结肠炎，这种化学 药物是以其对基底隐窝的肠上皮细胞的直接毒害发挥作用的，因此影响了黏膜屏障的完整 性。由于其症状、病理变化与人类溃疡性结肠炎的临床症状和病理变化类似，常被用于研究 此病的发病机理，并且可以通过连续几个循环摄入DSS诱导慢性肠炎的发生。另外，与致癌 剂偶氮甲烷联用，可以制备慢性炎症到肿瘤的模型，对于临床炎症性肠病相关的结直肠癌 的机制研究也是非常重要的工具。
[0013] 此外，肥胖是21世纪人类面临的最严峻的公共卫生问题之一，随着都市化生活方 式普及，肥胖人群日益增多，而我国快速的城镇化建设则会加重这一现状。卫生部调查显 示，我国肥胖超重者近3亿，糖耐量受损者约1. 5亿，糖尿病患者超过9000万。糖尿病已成 为威胁我国人民健康的突出问题，同时对医疗保障体系和社会福利制度提出了严峻挑战。
[0014] 20世纪90年代初已有人发现一些促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子TNF-α、白细 胞介素、干扰素等在多种组织中影响葡萄糖浓度的稳定性。近年来炎症反应在糖尿病发生 发展中的作用及与其他糖尿病危险因素关系问题的研究受到越来越广泛关注。2010年以 来，Cell、Nature、Science期刊连续发表十余篇专题报道，从遗传因素、环境因素、基因信 号转导、机体肠道菌群等多方面阐述了肥胖与糖尿病发生发展机制及调控现状，并提出一 系列解决思路。肥胖和糖尿病常常同时存在，肥胖与糖尿病不仅是一个高血糖的疾病，也是 一种炎症性疾病，而炎症反应是连接它们之间的纽带。肥胖患者体内存在慢性、低度炎性反 应，其脂肪组织中的T细胞和巨噬细胞明显增加，二者通过影响前脂肪细胞和脂肪细胞的 功能导致炎性因子的上调。但是这与典型的炎性反应不同，肥胖患者体内虽然有许多炎性 介质升高，但没有典型的红、肿、热、痛炎性反应。因此，有学者把这种反应称为"代谢性炎性 反应"。促炎因子IL-UIL-6和TNFa等细胞因子不仅由免疫活性细胞产生，也可由脂肪和 肌肉细胞产生。不仅参与机体的炎症反应过程，还是能量代谢平衡的重要调节因子。它们 能够阻断体内胰岛素的生物学功能，使胰岛素敏感性下降，导致胰岛素抵抗的发生。人体总 IL-6的30%来自脂肪组织，所以肥胖者脂肪组织分泌的IL-6可明显增加。长期过度分泌 IL-6可导致胰岛β细胞分泌功能受损及产生胰岛素抵抗。而高血糖又可促进胰岛细胞分 泌IL-6,大量的IL-6可促进Β淋巴细胞分化，产生过量的IgG，该作用和其他细胞因子产生 的细胞毒作用结合，可引起胰岛β细胞凋亡。TNF-a在胰岛素抵抗的病理过程中起了重要 的作用，肥胖者脂肪细胞产生的过量的TNF-a抑制肌肉组织胰岛素受体酪氨酸激酶活性， 降低胰岛素作用。TNF-a还能降低PPAR mRNA的表达而减少PPAR的产生，PPAR在免疫细胞 和血管壁细胞中表达具有抗炎和促凋亡作用；TNF-a又可引起胰岛内巨噬细胞活化释放 IL-UIL-6等，因此，长期高浓度的炎症因子刺激可导致胰岛细胞分泌功能受损及产生胰岛 素抵抗。对炎症因子与肥胖和糖尿病之间关系的研究或许可以提供新的更有效的诊断、预 防和治疗手段。
[0015] TLR4是一种重要的模式识别受体，在肥胖与高血糖的发生、发展中也起了重要作 用。它几乎在所有人体细胞表达，并有实验证实在胰岛β细胞上也存在TLR4的表达，而 且TLR4的配体种类多样，可以是细菌胞壁，内毒素，也可以是非细菌的配体，如饱和脂肪酸 (棕榈酸）。细菌性炎症免疫应答需要TLR4参与和活化；游离脂肪酸也能够活化TLR4引起 炎症免疫反应。营养过剩，肥胖，导致胰岛素抵抗的发生需要TLR4的参与，TLR4激活后，其 胞浆区通过募集接头蛋白MyD88引起下游转录因子NFKB，IRF3和MAP激酶的激活。通过 MyD88依赖的通路引起的NFKB和MAPKs的激活促炎症因子释放。
[0016] CTRP4是C1QTNF相关蛋白质家族成员。C1QTNF (CTRP)家族是一类新发现的主要 来自脂肪组织的脂肪细胞因子，以其高度保守的C端补体C1Q球状结构域为特征而命名。发 明人初期的体外研究表明CTRP4在肝癌细胞系可以活化NFk B，上调IL-6的表达以及促进 STAT3的磷酸化，相关的文章发明人发表在CANCER LETTER上。继续的研究发现，对髓系来 源的细胞CTRP4显示了明显的抗炎的作用；而不同的动物模型研究在体内也均显示了抗炎 作用。根据已有报道，很多CTRP家族的成员均在脂代谢中发挥了很重要的作用，那么CTRP4 在脂代谢中起了什么作用呢？ CTRP4会不会通过抑炎而抑制肥胖呢？之前的实验已经证 明，CTRP4能够抑制TLR4与LPS的结合，从而可以抑制LPS引起的内毒素性休克。因此，我 们的假设是：CTRP4是通过抑制TLR4,抑制STAT3而抑制炎症细胞因子的产生从而抑制肥胖 和胰岛素抵抗，进而抑制了高血糖的发生。我们希望通过实验验证我们的假设。阐明CTRP4 的作用机制具有重要的理论意义与实用价值，理论上阐明它的作用机制对肥胖与糖尿病的 发病机制的研究将是一种重要贡献；应用上，CTRP4是一种分泌蛋白，已经证明其重组蛋白 具有生物学活性，因此CTRP4具有潜在的临床应用价值。肥胖与代谢综合征糖尿病不仅是 一个高血糖的疾病，也是一种炎症性疾病，肥胖患者体内存在慢性、低度炎性反应。其脂肪 组织中的T细胞和巨噬细胞明显增加，二者通过影响前脂肪细胞和脂肪细胞的功能导致炎 性反应因子的上调。但是这与典型的炎性反应不同，肥胖患者体内虽然有许多炎性反应介 质升高，但没有典型的红、肿、热、痛炎性反应。因此，有学者把这种慢性炎性反应称为"代谢 性炎性反应"。IL-UIL-6及TNF α可能均参与糖尿病发病，长期过度分泌的IL-1及TNF α 可导致胰岛Β细胞分泌功能受损及产生胰岛素抵抗。
[0017] 自身免疫病性疾病的病因之一在于机体无法清除自身所产生的凋亡细胞，本发 明已经在体内外证明，CTRP4蛋白可以明确促进吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬和清除，因此， CTRP4可以应用于治疗自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮的药物制备。


【发明内容】

[0018] 本发明的目的是提供CTRP4蛋白质在作为制备治疗炎症性疾病和自身免疫性疾 病的药物中的应用。
[0019] 为此，本发明提供了一种CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病的药物的应用。 其中所述炎症性疾病选自下列的一种或多种：LPS所引起的内毒素性休克；急、慢性结肠 炎；肺炎；肥胖和1?血糖。
[0020] 本发明也提供了 CTRP4蛋白质在作为制备促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞的药物的 应用。
[0021] 本发明也提供了 CTRP4蛋白质作为制备治疗自身免疫性疾病的药物的应用。
[0022] 本发明也提供了 CTRP4蛋白质作为制备治疗系统性红斑狼疮的药物的应用。
[0023] 本发明的上述应用可以制备有效地治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物。

【专利附图】

【附图说明】
[0024] 图1是CTRP4F1代转基因小鼠66号小鼠的PCR鉴定。
[0025] 图2是CTRP4F2代CTRP4转基因小鼠65号的鉴定。
[0026] 图3是F2代纯合子小鼠的鉴定。
[0027] 图4是Western Blotting检测纯合子小鼠中各个CTRP4的表达。
[0028] 图5是CTRP4_His融合蛋白与LPS之间的结合作用。
[0029] 其中 1 :PBS ;2 :1%BSA ;3 :煮沸 15 分钟的 CTRP4(2ug/ml)(目的是为证明 CTRP4 的作用不是由于残留的 LPS 所致）；4 :VSTM-1-V2-HIS(1. 4ug/ml) ;5 :CTRP4(0. lug/ml) ;6 : CTRP4(0. 5ug/ml) ;7 :CTRP4(2ug/ml) ;8 :LPS(20ug/ml)+CTRP4(2ug/ml)。
[0030] 图6是THP1细胞中TLR4的mRNA表达。
[0031] 图7A-D是FITC-LPS与THP1细胞的结合。
[0032] 其中（A) CTRP4-His融合蛋白与FITC-LPS同时处理THP1细胞，CTRP4-His融合 蛋白的高、中、低剂量浓度分别为l〇〇ng/ml，lug/ml，10ug/ml ; (B) CTRP4-His融合蛋白与 FITC-LPS先37°C孵育30min再加入处理THP1细胞，CTRP4-His融合蛋白的高、中、低剂量浓 度分别为l〇〇ng/ml，lug/ml，10ug/ml ; (C)多粘菌素 B与FITC-LPS同时处理THP1细胞，多粘 菌素 B的高、中、低剂量浓度分别lug/ml，10ug/ml，100ug/ml ; (D)未标记的LPS与FITC-LPS 同时处理THP1细胞，游离LPS的高、中、低剂量浓度分别lug/ml，10ug/ml，100ug/ml。灰底 峰代表阴性对照，黑线白底代表FITC-LPS组，彩色白底代表实验组。
[0033] 图8是CTRP4抑制LPS诱导的细胞因子表达。
[0034] 其中（A)lug/mlLPS或者lug/mlLPS与不同浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理 THP1细胞6小时后，IL-6、TNF- α和IL-10的mRNA水平的变化；（B) lug/mlLPS或者lug/ mlLPS与不同浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理THP1细胞6小时后，IL-6的蛋白水平的变 化；(C) lug/mlLPS或者lug/mlLPS与不同浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理THP1细胞后 细胞培养上清中TNF-α含量的时间变化广代表P < 〇. 〇1，_代表P < 〇. 〇〇1。
[0035] 图9是野生型小鼠和CTRP4转基因小鼠诱导内毒素休克后的生存曲线。
[0036] 其中野生型C57BL/6小鼠（η=16)和CTRP4转基因 C57BL/6小鼠（η=11)腹腔注射 30mg/kg来自菌株E. coli055: Β5的LPS诱导内毒素休克后，每2h观察1次。数据来自2次 独立实验的联合数据，#代表P< 〇.〇1。
[0037] 图10表示在急性结肠炎模型中CTRP4转基因小鼠的结肠长度比对照组长。A图为 模型构建后牺牲小鼠的结肠长度情况。B图为A图的统计图。P=0. 0021
[0038] 图11表示转基因 CTRP4小鼠的腹泻情况减轻。在DSS诱导的急性结肠炎模型中 CTRP4转基因小鼠和阴性对照组小鼠腹泻程度的比较，**代表P〈0. 01。
[0039] 图12表示转基因 CTRP4小鼠的血便情况减轻。在DSS诱导的急性结肠炎模型中 CTRP4转基因小鼠和阴性对照组小鼠的血便评分情况。**代表P〈0. 01。
[0040] 图13表示转基因 CTRP4小鼠的体重变化情况。在DSS诱导的急性结肠炎模型中 转基因 CTRP4小鼠和阴性对照组小鼠体重的比较。**代表P〈0. 01.
[0041] 图14表示转基因 CTRP4小鼠在结肠炎模型中结肠病理情况减轻。图为代表性的 显微镜图片，放大倍数为200倍。
[0042] 图15表示通过组织学评分CTRP4转基因小鼠在结肠炎模型中炎症程度减轻。反 应肠炎严重程度的组织学评分显示转基因小鼠的评分比阴性对照组低。
[0043] 图16表示转基因 CTRP4小鼠在急性结肠炎模型中的生存率明显提高。在葡聚糖 硫酸钠诱导的急性结肠炎模型中转基因 CTRP4小鼠和对照组小鼠的生存曲线横坐标为DSS 诱导的天数，纵坐标为小鼠的死亡百分比，CTRP4组n=8, WT组n=8. WT小鼠在第7、8、9、10 天每天死亡一只小鼠，而CTRP4小鼠在11天未见死亡。
[0044] 图17表示CTRP4转基因小鼠结肠中细胞因子TNF-α的表达量明显降低。急性结 肠炎模型中结肠匀浆上清检测TNF- a的数值，P=〇. 0026。
[0045] 图18表示CTRP4转基因小鼠的糖耐量实验。CTRP4转基因鼠糖耐量比野生型鼠有 明显差异，转基因鼠的血糖水平较野生鼠明显降低。
[0046] 图19和图20表不商脂喂养的结果。
[0047] 图21表示高脂喂养16周后，CTRP4基因鼠体重较野生鼠的体重明显减低，具有统 计学意义。
[0048] 图22表示CTRP4与凋亡细胞的识别。
[0049] 其中（A) Jurkat细胞凋亡状态。Jurkat细胞UV照射1. 2min (早期凋亡）和5min (晚期凋亡)，用AV-PI双染方法流式细胞术分析凋亡状态；（B)、（C)活细胞、早期凋亡和晚 期凋亡Jurkat细胞与FITC-BSA、FITC-CTRP4室温孵育30min后流式细胞术分析FITC荧光 强度。
[0050] 图23A-B表示CTRP4可以与小鼠腹腔巨噬细胞结合。
[0051] 图24A-B表示THP1细胞用PMA(10ng/ml)处理2天使其分化成巨噬细胞，用（5ug/ ml)FITC-CTRP4孵育60分钟进行检测。
[0052] 图25A-D表示CTRP4促进体内凋亡细胞的清除。

【具体实施方式】
[0053] 实施例1 :制备：CTRP4转基因小鼠
[0054] 真核细胞表达质粒pcDNA3. 1-Myc/HisB (-)(本论文中简称PO)B)购自Invitrogen 公司，制备PCAGGS-CTRP4转基因质粒。具体过程如下：真核细胞表达质粒pcDNA3. 1-Myc/ HisB (-)(本论文中简称PCDB)购自Invitrogen公司，pCAGGS-CTRP4质粒的构建方案如图所 示。其基本过程如下：设计包含Xhol酶切序列的CTRP4基因特异性引物，以pcDNA3. 1-Myc/ HisB(-)质粒为模板，克隆方案中，上下游引物具体序列分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ：
[0055] PCR扩增得到的片段连同真核表达载体pcDNA3. 1-myc/his (-)B采用同样的限制 性内切酶进行酶切。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，切胶回收目的条带。回收的 载体和PCR片段用T4DNA连接酶进行连接，16°C，12小时。将连接产物进行转化。
[0056] 以下为转化过程：缓慢抽吸50 μ 1感受态大肠杆菌XL1-BLUE到连接产物中，在冰 上放置30分钟，在42°C水浴中热激90秒钟，迅速放到冰上，经过5分钟的恢复后，加入LB 的培养基400 μ 1，后37°C培养45分钟让细菌恢复状态并表达抗性，离心8000rpm，2分钟， 弃上清，留400 μ 1重悬，涂布于LA平皿上，30°C倒置培养过夜。挑取克隆扩增培养，提取质 粒进行鉴定。鉴定是否有插入片段、插入片段的大小、片段插入的方向。对符合目的要求的 阳性克隆进行质粒测序，测序结果与NCBI标准数据库中的CTRP40RF序列进行比对，准确 无误后进行质粒大量提取，质粒线性化，定量除菌后通过商业付费委托给中国医学科学院 医学实验动物研究所(地址：北京市朝阳区潘家园南里5号院，邮编：100021)制作转基因小 鼠。由其提供合格的CTRP4转基因小鼠。
[0057] 1.提取鼠尾基因组DNA
[0058] 1)在剪取鼠尾的前一天配制鼠尾裂解液(商购）；
[0059] 2)编号并剪去小鼠的尾巴0. 5cm左右，放入EP管中；
[0060] 3)在每个EP管中加入上述的裂解液500ul并加入0. lmg/ml的蛋白酶 K (Proteinase K)放入55°C水浴锅里过夜；
[0061] 4)第二天，加入300 μ 1饱和的NaCl (35. 2g NaCl定容至100ml)，颠倒混匀6-8次， 冰浴15分钟；
[0062] 5) 12000rpm，，室温离心 15 分钟；
[0063] 6)转移400 μ 1上清液至另一新的离心管，加入700 μ 1的异丙醇，颠倒直至形成絮 状沉淀；
[0064] 7) 12000rpm 室温离心 15 分钟；
[0065] 8)弃掉上清，加入lml70%乙醇洗涤沉淀，弃掉乙醇并晾干；
[0066] 9)根据得到的沉淀（S卩DNA)的量加入50ul，65°C的双蒸水溶解。
[0067] 2.PCR鉴定CTRP4转基因小鼠
[0068] (1)引物：根据pCAGGS载体的启动子序列小鸡β-肌动蛋白，使用中国医学科学 院医学实验动物研究所设计的引物序列和扩增条件如下：
[0069]

【权利要求】
1. CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病的药物的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述炎症性疾病选自下列的一种或多种： LPS所引起的内毒素性休克；急、慢性结肠炎；肺炎；肥胖和高血糖。 3. CTRP4蛋白质作为制备促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞的药物的应用。 4. CTRP4蛋白质作为制备治疗自身免疫性疾病的药物的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的自身免疫性疾病是系统性红斑狼 疮。
【文档编号】A61P3/04GK104208658SQ201310213305
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月31日 优先权日:2013年5月31日
【发明者】王露, 马大龙, 马壮, 那达翔, 王兰兰, 罗阳, 张颖妹 申请人:北京大学