用于治疗损伤的谷氨酰胺的制作方法
【专利摘要】一种通过将在药学上可接受的载体中的单剂量的谷氨酰胺给予需要的患者以治疗与组织代谢有关的疾患的方法。还提供用于治疗与组织代谢有关的损伤和用于预防心脏细胞损伤的谷氨酰胺。还提供含有在药学上可接受的载体中的单剂量谷氨酰胺的治疗剂，用于治疗和预防细胞代谢损伤、预防心脏细胞损伤和增加热休克蛋白表达的治疗组合物。还提供通过给予在药学上可接受的载体中的单剂量的谷氨酰胺至需要的部位，以增加热休克蛋白表达的方法。
【专利说明】用于治疗损伤的谷氨酰胺
[0001]本申请是申请号为“200480032925.9”，发明名称为“用于治疗损伤的谷氨酰胺”的发明专利申请的分案申请。
[0002]发明背景
[0003]1.【技术领域】
[0004]本发明涉及损伤的治疗。更具体地说，本发明涉及治疗损伤的谷氨酰胺的应用。
[0005]2.相关领域的描述
[0006]为了增强体能和从由于疾患所导致的紧张中恢复，在患者中常使用营养疗法。多次推荐中仅仅包括关于碳水化合物、蛋白质和脂肪在总体膳食中的配比的膳食建议。更为先进的方法是推荐可辅助愈合和增强个体身体状况的关键营养素的补充剂。这样的营养配方可被称为“膳食补充剂”、“功能食品”或“医疗食品(药膳)”。为了配制有效的膳食补充剂和功能或医疗食品，重要的是理解支持关键成分的科学基础。针对膳食修正的有充分根据的建议一旦作出，将可能对身体健康不佳者的康复率产生强有力的影响。
[0007]经常地，那些认为自己身体好的具有良好营养状况的人实际上在参数和在发生某些疾病的风险的表现这两个方面均有些不尽人意。为了改善心血管功能而开发的膳食补充剂、功能或医疗食品也可作为心脏保护剂而有益于这些人群。
[0008]在医学上推荐的补充剂方面，多年来人工膳食起着关键的作用。手术后的几天内，典型的情况是患者的胃肠道不能完全地消化食物。在这样的情况下，给予患者包括葡萄糖或精心配比的盐、碳水化合物、氨基酸、脂肪酸和维生素的混合物在内的肠外营养是重要的。即使是在患者停止肠外营养之后，可以经口服或经饲管建立类似组合物的肠内营养，或者可将医疗食品肠内补充剂加到他或她的饮食中，以使患者需要的和接受的营养物的种类和数量达到最优。
[0009]对于改良的预防、康复和维持疗法的最紧迫的需求是在全球首位致死原因的心血管疾病领域。预计在美国有五分之一的人患心血管疾病。其中，心肌梗死造成了每年50万以上的病例死亡。此外，幸存者面临一定水平的发病率和随之而来的残疾，这影响了他们医疗、社会以及同样重要的经济地位。因此，虽在最初的心肌梗死急性发作中幸存下来，但留给患者多种挑战。这样的患者可留下诸如慢性局部缺血性疾病、充血性心力衰竭或外周血流减少的受损的心血管功能状态。
[0010]充血性心力衰竭可比其后的心肌梗死更加隐匿地发作。动脉粥样硬化可逐渐减少至心脏的血液循环或未受控制的高血压可使心肌变弱。其它的情况是，可由包括局部缺血、高血压或慢性感染诸多种因素引起的心肌病。不论什么原因，这些心血管疾病的类型可表现类似的临床特征并且引起如同心肌梗死那样的相同的治疗和维持难题。
[0011]外周血管性疾病与心血管疾病密切相关，由于同样的潜在的原因，动脉粥样硬化可削减流向骨骼肌、脑或肾的血液循环，影响它们的功能。对患有心血管疾病患者有益的营养补充剂也将对这些患者有益。
[0012]在过去的二十年中，心脏康复已经提供幸存者提高的生活品质。心脏康复计划在继续变化以符合那些受累患者的需求和期望。成功的康复的一个重要方面是在运动训练中逐渐地有计划地增加关注修正现有的心脏风险因子。任何心脏康复计划的最终目标是功能容量的改善、产生活动性(activity-produced)的症状的警示的减少、残疾的减轻和预防后续心血管事件的已知的冠状风险因子的修正，即提供心脏保护。许多患者强烈地感觉到，高品质的生活包括恢复患病前活动的能力(如果完全可能的话)。
[0013]当一般营养的补充是作为疾病处理方案的部分的治疗的标准模式时，更加专业的营养方案可具有更加明确的和更有力的利益。例如谷氨酰胺由于其能够增加流向肝脏的血流，在治疗的肝脏疾病中是有用的(美国专利号6，001，878)。谷氨酰胺在维持免疫系统上也是有效的。这体现在骨髓移植后的患者的较低水平的感染的研究中，其间他们的肠外营养方案是补充谷氨酰胺(Calder和Yapoobl999)。另一个例子是对心脏具有正性肌力作用和可用作治疗充血性心力衰竭的牛磺酸。在临床试验中，4周的牛磺酸补充导致非常显著地改善呼吸困难、心丨季、爆裂音(crackles)、水肿和纽约心脏协会功能分级(Azuma等1983)。然而，如何使用谷氨酰胺预防心脏损伤或谷氨酰胺在预防或治疗其它疾病上的潜在应用尚未公开。
[0014]在环手术期间(per1-operative period),心肌缺血/再灌注损伤(I/R)是一种最重要的、潜在可逆的紧张性刺激。由于缺乏成功的治疗方案，对于心肌的I/R损伤的手术前预防并不是临床常规程序。正如其中心肌的I/R损伤为不可避免的冠状动脉搭桥术(冠状动脉旁路移植术，CABG) —样，这在需要心肺旁路手术中是显著相关的。可实现保护心肌避免损伤的两个主要的机制，包括:1)应激蛋白质(即热休克蛋白)合成的刺激和2)在延长的局部缺血期间，防止三磷酸腺苷(ATP)损耗和限制酸中毒。
[0015]在传统上被认为是非必需氨基酸的谷氨酰胺(GLN)，现在看来是在严重损伤或病症期间的一种条件性必需营养素。严重的病症和损伤显示GLN被内脏、炎症细胞和肾脏增加利用。这些快速复制的细胞选择性地消耗谷氨酰胺为的是其合成核酸的基本功能以及在应激期间作为优选的能源。在身体健康时，GLN是血浆和骨骼肌中最丰富的氨基酸，但是在损伤、手术或感 染之后循环和组织浓度急剧下降。针对在病人中的CABG手术，先前的研究显示循环血浆GLN水平比CABG之前至少下降30%。额外的数据表明在经历CABG的患者心肺旁路后的心肌组织GLN也显著降低。
[0016]在体内和体外的广泛的研究表明，GLN补充能够防止细胞和器官损伤。而且还有可能，严重疾病或损伤后血浆中GLN的下降可能有害于包括心脏在内的多器官的功能。在人体的初步研究证实，GLN能改善许多患者群体的预后。GLN的在心肌上的保护作用的重要机制，可能与组织热休克蛋白合成的增强、组织代谢的支持和组织氧化还原状态的维持有关。
[0017]热休克蛋白(HSP)是一个涉及细胞保护的最基础的机制的高度保守的蛋白质家族。这些蛋白质在亚致死刺激后的表达可引起“应激耐受(stress tolerance) ”,并提供保护使其避免否则将是致死的后续应激。实验数据显示热应激反应前导可提供明显的保护以避免包括局部缺血/再灌注损伤的多种形式的细胞损伤。HSPs，尤其是HSP72(72指蛋白质的分子量)在保护心肌避免缺血/再灌注(I/R)损伤的作用已有广泛描述。具体地说，导致HSP72的过度表达的基因操纵已显示，在小鼠中限制(I/R)损伤的有害作用。这些结果表明，增强的HSP72表达可赋予对I/R损伤进行显著的保护。为了改善在人体疾病预后的HSPs的诱导尚未被开发使用，因为在实验室所用的诱导剂自身是有毒性的并且在临床上上非相关的。目如在实验室用于提闻HSP表达的试剂包括急性闻热和诸如亚神酸纳的重金属。伴随着它们的使用，这些HSP72强化的方法具有显著毒性，因此增强HSP72表达以保护心肌组织避免I/R损伤的临床相关的方法将是迫切需要的。
[0018] 因此，开发用于治疗和预防心脏损伤和其它细胞损伤并且无上述有害副作用的治疗剂将是有用的。开发增加HSPs在体内的生成而不用将HSPs给予患者的方法也将是有益的。
[0019]发明简述
[0020]依据本发明，这里提供通过将单剂量的在药学上可接受的载体中的谷氨酰胺给予需要的患者以治疗与组织代谢有关的疾患的方法。还提供用于治疗与组织代谢有关的损伤和用于预防心脏细胞损伤的谷氨酰胺。还提供用于治疗和预防细胞代谢损伤、预防心脏细胞损伤和增加热休克蛋白表达的治疗性组合物，其中治疗剂含有单剂量的在药学上可接受的载体中的谷氨酰胺。还提供通过将单剂量的在药学上可接受的载体中的谷氨酰胺给予需要的部位以增加热休克蛋白的表达的方法。
[0021]图的说明
[0022]本发明的其它的优点易于认识，当与附图结合起来考虑时，通过参考下文的详细描述将变得更易理解，其中:
[0023]图1是显示在冠状动脉旁路患者中，谷氨酰胺有益于心肌/再灌注损伤的机制的流程图；
[0024]图2A和B显示在未应激的大鼠的心和肺组织中GLN对HSP72表达的剂量反应影响；
[0025]图3A和B显示在LPS (大肠杆菌内毒素)损伤的大鼠的心脏上中GLN对HSP72表达的影响；
[0026]图4是显示谷氨酰胺(GLN)对细胞死于局部缺血/再灌注的影响的图；
[0027]图5A和B是显示谷氨酰胺(GLN)预处理对大鼠工作心脏模型(working heartmodel)局部缺血/再灌注损伤后的心脏指数的影响的图；
[0028]图6是显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织ATP/ADP比率的影响的图；
[0029]图7是显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织乳酸盐的影响的图；
[0030]图8是显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织底物(谷氨酸盐、谷氨酰胺和葡萄糖)的影响的图；
[0031]图9是显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织还原性谷胱甘肽含量的影响的图；
[0032]图10是显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织NAD(+)/NADH含量的影响的图；
[0033]图11是在大鼠工作心脏模型中，大鼠心肌组织暴露于局部缺血和再灌注损伤的1H-MRS 光谱；
[0034]图12显示谷氨酰胺经由HSP72的诱导保护肠上皮细胞的旁路；
[0035]图13A和B显示谷氨酰胺在心和肺组织诱导HSP70 ；
[0036]图14是显示谷氨酰胺增加从LPS损伤中生存的图；[0037]图15是显示在LPS损伤的大鼠组织中，谷氨酰胺增强HSP70表达的照片；
[0038]图16A和B是显示GLN对由LPS注射而释放TNF- a和IL-1 ^的影响的图；
[0039]图17是显示GLN增强肺HSP70表达的图；
[0040]图18是显示GLN增强肺HSF-1活性的图；
[0041]图19是显示谷氨酰胺提高在CLP后高能量磷酸盐含量的图；
[0042]图20是显示谷氨酰胺提高在CLP后高能量磷酸盐含量的图；
[0043]图21是显示谷氨酰胺提高盲肠结扎加穿孔后生存的图；
[0044]图22是显示心脏输出相对于灌注的图；
[0045]图23是显示谷氨酰胺提高I/R损伤后心肌谷胱甘肽含量的图；[0046]图24是显示在实验性中暑的大鼠模型中口服谷氨酰胺提高存活率的图；
[0047]图25是显示在GLN治疗后的病危患者的血清HSP70表达的图；
[0048]图26是显示与对照的患者比较，在接受谷氨酰胺I周时患者的HSP-70水平的图；
[0049]图27是显示与对照的患者比较，在接受谷氨酰胺I周时患者的HSP-70水平的图；
[0050]图28是显示与对照的患者比较，在接受谷氨酰胺I周时患者的HSP-70水平的图；以及
[0051]图29是显示与对照的患者比较，在接受谷氨酰胺I周时患者的HSP-70水平的图。
[0052]发明的描述
[0053]总的说来，本发明提供应用大剂量的谷氨酰胺(GLN)(—种条件性必需氨基酸)对损伤或疾病的治疗。更具体地说，本发明提供通过给予需要的患者在药学上可接受的载体中的GLN的单次推注剂量(single bolus dose)治疗,用于或者预防或者治疗损伤或疾病。
[0054]包括单次推注剂量的谷氨酰胺治疗剂可用于治疗急性病症、慢性疾症、疾病和损伤。急性病症、疾病和损伤的实例包括，但不限于局部缺血(包括心脏和肾脏)、移植、脓毒症、体温过低、肺损伤、局部和全身性炎性疾病、自身免疫性疾病、热休克、中暑以及再灌注损伤。本发明的治疗剂基于谷氨酰胺的能力起作用，以防止局部缺血和再灌注后的代谢功能紊乱，并且GLN是iNOS和eNOS抑制剂。这种谷氨酰胺的给药可改善诸如冠状动脉疾病、心脏病发作和心肺旁路术的心脏疾病的预后。再有，该治疗剂可用于治疗其它疾患，包括但不限于与组织代谢相关联的疾病和损伤，以及用于提高体内热休克蛋白或热休克因子-1的表达。
[0055]谷氨酰胺还可用于抑制或治疗皮肤/上皮/粘膜损伤。所述这样的损伤可作为UV辐射、烧伤、老化、化疗、放疗或其它形式的放射性损伤的结果而发生。在治疗此种类型的损伤中，GLN优选利用适合于该给药方法的可接受的载体局部给药。其它形式的给药方法也可被使用，可由负责该项治疗的医生决定。
[0056]为延长的时间段，谷氨酰胺可口服给药。可以以丸剂、胶囊剂、以液体的形式、或作为粉剂口服给药。粉剂可溶解于水或其它液体中，然后服用。可给予谷氨酰胺以充分地提高热休克蛋白(HSP)的生成。GLN可用于治疗和预防热相关病症，诸如但不限于热应激和中暑。
[0057]作为选择，GLN可以经静脉、局部、parentally，或以其它的本领域技术人员已知的产生相同结果的方法给药。适于这些给药方法的定量可基于本领域的专业人员已知的普通定量方法确定。[0058]另外，GLN或者口服或者以其它形式给予，可具有抗炎/抗细胞因子作用并且因而可用于治疗炎性病症，诸如，但不限于自身免疫紊乱诸如关节炎(包括骨关节炎和类风湿性关节炎)、狼疮、纤维肌痛症以及其它相关的自身免疫性疾病，克罗恩氏(Chrohn' s)病、肠易激惹综合征以及导致炎症或增加细胞因子产生的其它疾病。
[0059]此外，口服或者以其它形式给予GLN，可保护器官。换言之，GLN可给予患者并且如果该患者的器官被切除了，该器官在该患者体外可保持存活一个延长的时期。GLN还可给予器官、组织或细胞以对器官、组织或细胞提供保护。如此特性的好处是，如果器官在被切下后可存活较长的时期，则有极大的可能性可被提供给另一个需要同样器官的个体。这样的可被保护的器官的实例包括，但不限于肝脏、心脏、肺、肾脏以及其它可被切除的器官。同样地，GLN可用作与其它电解质合并的复生(resuscitation)液体或器官移植保存溶液的一部分。这样的液体/溶液的实例包括，但不限于林格氏(Ringer' s)乳酸盐溶液和本领域技术人员已知的其它类似的溶液。
[0060]在此使用的谷氨酰胺可包括本领域技术人员已知的任何形式的谷氨酰胺。例如，可以以丙氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-谷氨酰胺、亮氨酰-谷氨酰胺、缬氨酰-谷氨酰胺、异亮氨酰-谷氨酰胺和半胱氨酰-谷氨酰胺，或其为本领域技术人员已知的其它衍生物给予谷氨酰胺，或可作为三肽给予。优选地，可给予二肽，因为二肽可易于溶解并且在几个小时之内自全身体内清除，这样就消除了关于毒性的问题。然而，在不脱离本发明的精神下，可以以三肽或寡肽给予谷氨酰胺。如果应用寡肽，优选含有三个或多个氨基酸残基的寡肽。最优选含有多个谷氨酰胺残基的寡肽。所述多肽还包括一个酰化的末端氮。优选地，适于酰化的末端氮的酰化部分是乙酰基。
[0061]此外，可以以前药形式或作为副产物给予谷氨酰胺。换言之，可给予作为产生药理学活性代谢物的底物的谷氨酰胺，尽管所述代谢物不如葡糖亚胺(glucosimine)那样有活性。所给予的谷氨酰胺还可以为能够释放谷氨酰胺的组合物的形式。
[0062]谷氨酰胺的剂量基于本领域技术人员已知的使用药学上可接受的载体(为本领域技术人员熟悉的)正常的剂量。更具体地说，所述剂量依据谷氨酰胺具体的用法，以及给药的形式而定。优选地，药用载体可依据计划中的组合物的用途而改变。此外，所述载体可改变/控制组合物的吸收率或在体`内对患者、器官、组织或细胞的释放率。换言之，可修正所述载体以使其延长谷氨酰胺在治疗部位的释放。如此释放的好处是它能使所述部位的治疗期限延长。此外，为了达最佳的治疗结果，可改变释放以达到最佳的药物动力学和药效学。
[0063]当以单剂量给药时，GLN可改善包括上述疾患的预后，所述疾患包括，但不限于心脏的局部缺血和再灌注损伤。例如，于心肌损伤前18小时，将单剂量谷氨酰胺二肽(丙氨酰-谷氨酰胺)给予大鼠，可改善局部缺血和再灌注损伤后的心肌功能。这种保护是由于代谢和谷胱甘肽水平的维持。单剂量的丙氨酰-谷氨酰胺通过组织代谢(ATP含量等)的维持和组织谷胱甘肽水平的维持发挥作用。例如，在手术前可经大剂量IV推注给予GLN。剂量范围优选从每剂0.1克/kg至2克/kg的谷氨酰胺。如果需要，手术后可给予额外量的GLN以提供持续不变的保护。
[0064]可使用本发明组合物和方法将丙氨酰-谷氨酰胺或其它的谷氨酰胺二肽给予面临ER的患有心脏病发作的患者、面临心脏手术的患者、慢性心绞痛的患者或表现为上述公开的其它疾患的症状的患者。该项治疗的利益是巨大的，因为这种药是良性的并且是相对便宜的氨基酸。更进一步的利益是，如同以上所陈述的，GLN在几小时内自全身清除，因此，不用考虑毒性的问题。
[0065]在上述公开的治疗的更为具体的内容中，谷氨酰胺对于体外和体内的细胞和器官损伤进行保护。在此提供的数据证实谷氨酰胺预处理可在加强收缩功能恢复的同时，直接保护心肌细胞避免I/R诱导的心肌细胞死亡。此外，在应激和未应激动物的心脏中，谷氨酰胺均可提高为内在细胞保护因子的热休克蛋白72和27的表达。GLN预处理可保护I/R损伤后的心肌功能。心肌功能的GLN介导的保护被发现与改善I/R损伤后的心肌组织代谢标记包括改善的ATP/ADP比率、总ATP含量和总肌酸/磷酸肌酸含量相关。GLN预处理还导致I/R损伤前谷氨酰胺底物(在局部缺血性心肌中关键的底物)水平的提高和I/R损伤后的谷氨酸盐、谷氨酰胺和葡萄糖组织水平的提高。还证实这些组织的还原性谷胱甘肽和总NAD(+)/NADH含量增加，表明I/R损伤后的组织氧化剂生成的减少(改善的氧化还原状态)和对线粒体氧化磷酸化作用的保护。该研究提示在心肌I/R损伤的预防中对细胞代谢的保护。最后，近期的数据表明低剂量口服GLN可延迟已知稳定的慢性绞痛的患者局部缺血的发作。
[0066]此外，谷氨酰胺(GLN)降低内毒素导致的死亡率。然而，在盲肠结扎加重复穿孔(2CLP)(—种人脓毒症的临床更相关模型)后GLN的作用尚不清楚。还有，增加的白介素-18(IL-18)水平在细胞因子诱导的器官衰竭中似乎起关键作用并可预测脓毒症患者的死亡率。GLN处理后减少促炎(IL-18、11-6和1即-[1细胞因子表达，增强肺热休克蛋白72 (HSP72)表达以及改善2CLP后的生存。给Sprague-Dawley大鼠(250_300g)施行2CLP并于手术后I小时给予单剂量的GLN(0.75g/Kg) (n = 18)或平衡的盐溶液(对照)(n = 17)。监测五天的生存。在分组的动物中，在多个时间点抽血以分析细胞因子(IL-18、IL-6TNF_a和IL-10)表达。切 取肺组织用于分析HSP72。2CLP后I小时给予GLN显著减少2CLP后12、18和24小时时IL-18的表达(p < 0.05)。2CLP后6小时减少IL-6和TNF- a的表达(p < 0.05)。在2CLP后，与对照相比，GLN增强肺HSP72表达(p < 0.05)。最后，GLN将2CLP后的5天死亡率从78%降至42%(p <.04)。数据指出GLN可明显地改善自2CLP的生存。这种保护的可能机制包括促炎细胞因子表达的减少和肺HSP72表达的增强。还有，这是IL-18在2CLP模型中表达的首次描述。这些数据指出，作为后处理给予单剂量的GLN可减弱全身炎性反应综合征(SIRS)和预防死于多微生物性脓毒症。
[0067]还通过参考下列实验性实施例详细描述本发明。提供这些实施例仅是为了说明的目的，且不想被限制，除非另有指定。因此，本发明完全不应被解释为受限于下列的实施例，恰恰相反，应被解释为包括因在此提供的描述而变得显而易见的任何的和所有的变化。
实施例
_8] 治疗剂(化合物)的释放:
[0069]遵照优良的医学规范给予和定量本发明的化合物，把个体患者的临床疾病、给药的部位和方法、给药的时序安排、患者的年龄、性别、体重和医务人员已知的其它因素考虑进去。因而，为此目的的药学上“有效量”通过如同本领域已知的这样的考虑因素来确定。该量必须有效达到成以下改善，包括但不限于改善生存率或更快速地恢复，或改善或消除症状和其它的如本领域技术人员所理解的方法所选择的指标。[0070]在本发明的方法中，可以以多种不同的方式给予本发明的化合物。应该注意的是，它可作为化合物或药学上可接受的盐给予，并且可单独或作为与药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和媒介物联合的活性成分给予。该化合物可口服、经皮下或经包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内和鼻内给予的胃肠外途径给予以及椎管内给药和输注技术给药。植入该化合物也是有用的。接受治疗的患者是温血动物，特别是包括人的哺乳动物。药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和媒介物以及植入的载体一般指不与本发明的活性成分起反应的、惰性的、无毒的固体或液体填充剂、稀释剂或包囊材料。
[0071]需要注意的是，治疗人通常比治疗在此作为例子的小鼠或其它实验动物的时间长，其疗程与病程和药物效用的时间长度相当。剂量可为单剂量或跨越几天期间的多剂量，但是单剂量是优选的。
[0072]剂量可为单剂量或跨越几天期间的多剂量。治疗通常具有与病程和药物效用的时间长度以及被治疗的患者种属的疗程相当的时间长度。
[0073]当胃肠外给予本发明化合物，通常将其配制成可注射形式的单位剂量(溶液剂、混悬剂、乳剂)。适合于注射的药物制剂包括无菌水溶液或分散液和适于再配成无菌可注射的溶液或分散液的无菌粉剂。载体可为包含例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质、其适合的混合物和植物油。
[0074]例如通过使用包衣材料诸如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持必需的微粒大小以及通过表面活性剂,可维持适当的流动性。非水性媒介物诸如棉籽油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉米油、向日葵油或花生油以及酯，诸如十四烷酸异丙基酯，也可作为溶剂系统用于化合物组合物。此外，可加入增强组合物的稳定性、无菌性和等渗性的不同的添加剂，包括抗菌的防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。微生物作用的预防可通过不同的抗菌剂和抗真菌剂如羟基苯甲酸酯类(parabens)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等得到保证。在许多情况下，包含等渗剂，如糖、氯化钠等是需要的。通过使用延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶可产生可注射药剂的延长的吸收。然而，依照本发明，任何所使用的媒介物、稀释剂或添加剂必须与该化合物适配。
[0075]通过将在实施本发明中所使用的在所需量的适当溶剂中的化合物与各种其它的成分(如果需要的话)混合，可制备无菌可注射溶液。
[0076]本发明的药物制剂可以以可注射的制剂给予患者，所述制剂包含任何适配的载体诸如不同的媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂；或者在本发明中所用的化合物可以以缓慢释放的皮下植入物或靶向释放系统诸如单克隆抗体、载体释放、离子电渗疗法(iontophoretic)、聚合体基质、脂质体和微球体的形式经胃肠外给予患者。对本发明有用的释放系统专利公开的实例包括:5, 225，182 ;5，169，383 ;5，167,616 ;4，959，217 ；4，925，678 ;4，487，603 ;4，486，194 ;4，447，233 ;4，447，224 ;4，439，196 和 4，475，196。许多其它这样的植入物、释放系统和模块对本领域技术人员来说是熟悉的。
[0077]在本发明中所用的化合物药物制剂可口服给予患者。常规的方法诸如以片剂、混悬剂、溶液、乳剂、胶囊剂、散剂、糖浆剂等给予该化合物是可用的。将其口服或静脉内释放并保留生物学活性的已知的技术是优选的。
[0078]在一个实施方案中，本发明的化合物可最初通过静脉注射给予以使血药水平达到适合的水平。然后通过口服剂型维持患者的水平，尽管根据患者的情况和如上所指出的，可使用其它的给药形式。给药的量将依接受治疗的患者不同而异，且从每天100ng/kg体重至每天100mg/kg体重不等,优选将从每天10mg/kg至10mg/kg。
[0079]实施例1:
[0080]心肌缺血/再灌注(I/R)损伤是需要心肺旁路的外科手术过程不可避免的结果。由于缺乏成功的治疗方案，在需要心肺旁路的手术过程中，术前预防以避免心肌I/R损伤并非临床常规的程序。从本研究和其它实验室得来的初步数据表明谷氨酰胺(GLN)，一种条件性必需氨基酸，在体外和体内保护细胞和器官避免损伤。数据显示谷氨酰胺预处理在增强收缩功能的恢复的同时，可直接保护心肌细胞避免I/R所致的心肌细胞死亡。
[0081]另外，谷氨酰胺可增强应激和未应激动物的心脏中的热休克蛋白72和27(内源性细胞保护因子)的表达。由实验室来的随后的数据表明，在工作心脏模型中，用GLN对完整大鼠(intact rat)进行预处理可保护I/R损伤后的心肌功能。经发现这种GLN介导的心肌功能的保护与改善I/R损伤后的心肌组织代谢标记包括提高ATP/ADP比率、总ATP含量和总肌酸/磷酸肌酸含量有关。还有，GLN预处理导致I/R损伤前谷氨酰胺底物(在缺血心肌中的关键底物)水平的增加和I/R损伤后谷氨酸盐、谷氨酰胺和葡萄糖组织水平的增加。还证明增强组织还原性谷胱甘肽和总NAD(+)/NADH的含量，表明I/R损伤后减少组织中氧化剂产生(改善的氧化还原状态)和线粒体氧化磷酸化的保护。从另一个实验室来的数据已证实这些结果并且证明在大鼠工作心脏中经由灌注液给予GLN可改善来自I/R损伤的预后。研究提示在心肌I/R损伤的预防中细胞代谢物的保护。最后，近期的数据表明低剂量口服GLN可延迟已知稳定的慢性心绞痛的患者局部缺血的发作。因此，手术前GLN治疗可减少心肌损伤(如通过测量冠脉流出物)以及血浆肌钙蛋白和肌酸酐磷酸激酶释放。
[0082]GLN对心肌组织损伤的影响。于手术前将GLN给予经受CABG手术的患者，可减少心肺旁路后的心肌细胞损伤。可在手术前、心肺旁路的开始时和手术后收集血浆，用于肌钙蛋白和CK-MB的分析。此外，在心肺旁路的不同的时间点可收集冠脉流出物，用于分析肌钙蛋白。
[0083]GLN对人心房组织热休克蛋白含量的影响。于手术前将GLN给予经受CABG手术的患者，可增加在心肺芳路开始时和结束时的心肌热休克蛋白72和27的含量。在心肺芳路之前和之后可切除经受CABG手术的患者的右心耳组织并分析热休克蛋白72和27的含量(Western 分析)。
[0084]GLN对人心房中组织的组织代谢和氧化还原状态的影响。于手术前将GLN给予经受CABG手术的患者，改善在心肺旁路开始时和结束时的心肌组织的代谢。在冠状动脉旁路的开始之前，可切除患者的右心耳组织并用于组织代谢(磁共振光谱(MRS))的分析。这些检测包括组织ATP、ATP/ADP比率、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸盐和葡萄糖。通过心肌组织的还原性谷胱甘肽的含量和总NAD/NADH含量(MRS)，可分析组织的氧化还原状态以及氧化磷酸化的维持。
[0085]GLN对手术后心脏功能和总体患者预后的影响。于手术如将GLN给予经受CABG手术的患者，能够(i)改善手术后心脏功能，(ii)减少对手术后血管加压药的支持的需求，以及(iii)缩短手术后机械通氧、ICU(监护)和住院的时间。可收集手术前、在心肺旁路开始和终止时以及手术后(通过心脏指数)心脏功能的数据。对手术后血管加压药治疗的需求可用于一起评估患者需要血管加压药治疗的剂量和时间长度。此外，可记录手术后通氧的持续时间、进入ICU的时间长度和总住院时间长度。
[0086]GLN预处理对于保护心肌避免为了 CABG的心肺旁路后的I/R损伤，来自以上的深入观察清楚地显示出这一可能性。该研究还提供进一步的对于生物化学机制的深入观察，通过所述机制，GLN可抵御人的心肌中的I/R损伤。
[0087]在病人中的初步的数据表明，低剂量口服给予GLN(80mg/kg)可显著延迟慢性稳定性心绞痛的患者的局部缺血发作的时间。特别地,对17位已知的慢性稳定性心绞痛患者给予GLN的作用进行随机、盲的、安慰剂对照的交叉试验。在运动负荷试验(exercisestress test)前40分钟给予患者GLN或安慰剂,记录直至发生ST降低Imm的时间。然后,在一个星期的间隔后将患者进行交换。GLN给药导致显著地延迟ST降低的发生(p < 0.05)。
[0088]先前在不同的临床诊所将GLN给予危重病人，没有任何证据显示有毒性。该结果的唯一例外是在患有明显的肾衰竭和/或肝衰竭患者中。患者被观察到血尿氮和氨水平升高，后者未见报道有严重的生理性后果和治疗终止后的逆转。
[0089]除了经受CABG手术的患者之外，其它组别的患者也可从潜在的GLN介导的保护心肌避免I/R损伤中受M。在处于心脏缺血风险的患者中(诸如在患有诞状动脉疾病和/或慢性不稳定性心绞痛的患者中)，给予GLN可减少心肌缺血或梗死后的心肌损伤和改善心脏性能。还有，GLN还可用于保护以避免在心脏的缺血损伤和保护为器官移植而切除的其它器官。
[0090]谷氨酰胺可改善危重病症的临床结果；其机制不明。谷氨酰胺目前作为肠胃外营养或经肠灌饲的营养补 充剂给予。作为“药物”给予单个大剂量的谷氨酰胺，通过修正有缺陷的热休克蛋白70表达、减少促炎细胞因子的释放和纠正脓毒症在代谢中引起的缺陷，可明显地改善脓毒症、急性呼吸窘迫综合征和促炎状态的预后。
[0091]以0.75g/kg作为单剂量(的丙氨酰-谷氨酰胺)给予谷氨酰胺，可增强热休克蛋白70表达、减少促炎细胞因子表达(TNF-a、IL_6、IL_18eXC.)和改善组织代谢(改善的组织ATP水平、降低的乳酸盐和维持的NAD+水平)导致脓毒症和急性呼吸窘迫综合征后的死亡率和发病率降低。这对于改善脓毒症、肺损伤、外伤和其它炎性疾患(诸如关节炎、炎性肠病和多发性硬化症)的预后可具有重要的临床意义。
[0092]给予丙氨酰-谷氨酰胺，可以确定的是，在大鼠临床相关的盲肠结扎加穿孔的脓毒症模型中，于发生脓毒症后以单个大剂量给予丙氨酰-谷氨酰胺，可使肺的热休克蛋白表达恢复正常、减少促炎细胞因子的释放和改善肺中其它的有缺陷的细胞代谢。
[0093]大的单或多剂量氨基酸二肽可用于显著改善严重感染、急性呼吸窘迫综合征和其它严重损伤如外伤和严重烧伤的预后。根据许可可将药剂给到急症室或I⑶以降低死亡率和发病率。该氨基酸还可改善其它炎性疾病诸如炎症性肠病(克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、关节炎、多发性硬化症和/或狼疮的预后。
[0094]GLN增强在未应激和应激的心肌中的热休克蛋白表达。在最初的研究中，考察了GLN对应激和未应激的完整大鼠的心肌热休克蛋白表达的影响。首批实验考察了在未应激的大鼠心脏中，某一范围剂量的GLN对休克蛋白表达的影响。如下列图1所示，GLN在所有测试的剂量下显著增强HSP72表达。这样的增加在HSP27(另一种保护性的热休克蛋白)也被观察到，其中诱导早在4-6小时发生并且持续最长至48-72小时。在分开的一批实验中，用0.75g/kg的GLN或LR对照溶液处理一组大鼠,然后同时给予5mg/kg的挨希氏大肠杆菌内毒素(LPS)。在给予GLN/LPS六小时后处死动物，取出心脏组织用于HSP表达的分析。通过蛋白质印迹分析(western blot analysis)检测，GLN明显地增强HSP72和27两者的表达(图2)。
[0095]更具体地说，图2显示在未应激大鼠的心和肺组织中，GLN对HSP72表达的剂量反应效应。在12-15分钟内给予不同浓度的GLN处理大鼠。然后在GLN处理后4个小时切取组织，采用蛋白质印迹分析HSP72表达。显示的图像代表那些在四个不同实验中所获得的结果。条形图表示与对照相比的HSP72的百分增加率。所有GLN剂量(0.15g/kg(空白条)，
0.45g/kg(灰色条)0.75g/kg(黑色条))与对照相比显著增加HSP72浓度(用密度测定法(densitometry)检测)。(通过 ANOVA,与对照相比，*p <.001, **p <.01, ***p <.05)
[0096]图3显示GLN对LPS损伤大鼠的心脏的HSP72表达的影响。在给予大鼠LPS (5mg/kg)的同时经由尾静脉给予GLN (n = 5) +液体复苏或只给LR复苏(n = 4)。在LPS损伤后6个小时切取组织并通过蛋白质印迹进行HSP72表达分析。每条道代表从单个动物中提取的蛋白。相对密度测定法表示为平均值+/-SE。经Studentst检验评估,与单独使用LR复苏相比，*_P < 0.0005。
[0097]GLN保护心肌细胞避免I/R损伤和增强热休克蛋白72表达。在进一步的初步研究中，对GLN是否可保护分离的心肌细胞避免I/R损伤进行了测试。研究了自主性收缩的心肌细胞。在随后的局部缺血/再灌注前一小时，使心肌细胞在加入的含有IOmM或OmM的GLN的BSS中平衡，完成谷氨酰胺的预处理。在整个局部缺血和再灌注期间，GLN也可存在于经GLN处理的细胞中。经观察，在经谷氨酰胺处理的细胞中细胞死亡率(22%)与对照的细胞死亡率(48%)相比，有显著下降(p <.0005)(图4)。GLN还显著增强I/R损伤后的收缩功能的恢复(P <.05)。当用蛋白质印迹检测，与非预处理的细胞(未接受GLN的细胞)相比，经GLN处理的细胞还被证实显著提高HSP72含量。
[0098]图4显示谷氨酰胺(GLN)对细胞死于局部缺血/再灌注的影响。任由心肌细胞在基准含氧量正常的情况下平衡60分钟。在这期间，细胞暴露于含IOmM GLN的平衡盐溶液或单独的平衡盐溶液(对照)中。(与对照相比，**-p <.0005)
[0099]在大鼠工作心脏中，谷氨酰胺预处理增强I/R损伤后的心脏和冠脉血流的恢复。为了考察在完整动物中远期的GLN预处理对心脏功能的恢复的作用，使用大鼠工作心脏模型。向大鼠注射0.75g/kg的丙氨酸-谷氨酰胺溶液(相当于.52g/kg谷氨酰胺)(n= 10)或对照的乳酸化林格氏液(Lactated Ringer' s (LR) solution) (n = 10), 18小时后,取出心脏和经由工作心脏装置将其暴露于I/R损伤下。考察两者(8和12mmHg)的预加负荷值，GLN预处理显著改善再灌注后的心脏血流的恢复(图5)。GLN预处理还显著增强在再灌注后60分钟时的冠脉血流的百分恢复率(p<.01)。从GLN或对照注射中，未记录到可见的毒性(异常行为、精神状态的改变、进食的减少)。
[0100]图5显示在大鼠工作心脏模型中，谷氨酰胺(GLN)预处理对局部缺血/再灌注损伤后的心脏指数的影响。向大鼠IP注射0.52g/kg的GLN(如丙氨酸-谷氨酰胺)或LR对照溶液，18小时后，取出心脏并进行实验性局部缺血/再灌注损伤。图5A显示在左心房压为8mmHg时心脏血流的百分恢复 率。图5B显示在左心房压为12mmHg时心脏血流的百分恢复率。与对照相比，*_P ^ 0.05, **-p ^ 0.010[0101]谷氨酰胺预处理保持大鼠心肌I/R损伤后的心肌ATP/ADP比率和总ATP/肌酸/磷酸肌酸含量。在60分钟的再灌注时间后，从以上图5描述的大鼠中摘取大鼠工作心脏模型心肌组织。在18小时时也切取以GLN或LR处理的对照动物的心肌组织，但该组织不暴露于I/R损伤(局部缺血前组织)并且立即于液氮中冷冻用作分析。通过31P-磁共振波谱(MRS)分析该组织的ATP、ADP和ATP/ADP比率和通过1H-磁共振波谱(MRS)分析该组织的肌酸/磷酸肌酸含量。两组动物在I/R损伤后的ATP/ADP比率和总ATP含量都有显著地降低。然而，在心肌I/R损伤前18小时以GLN预处理，导致I/R损伤后ATP/ADP比率的维持的增强(图6)。总ATP含量也提高(经由Studentst检验，与对照相比，p < 0.001)。
[0102]ATP损耗是I/R损伤后心肌功能障碍和心肌细胞死亡的主要因素。在心肌I/R损伤前18小时进行GLN预处理，明显地保持心肌ATP含量，这可能是至关重要的机制，通过该机制GLN增强I/R损伤后的心肌功能。在经受I/R损伤的动物中没有发现肌酸/磷酸肌酸含量有统计学意义的显著降低。然而，在心肌I/R损伤前18小时以GLN进行预处理，导致I/R损伤后心肌组织肌酸/磷酸肌酸含量增加。受损的心肌的特征是磷酸肌酸(PCr)和游离肌酸含量减少。心肌磷酸肌酸显著减少的大鼠不能在显著的心肌I/R损伤中存活。GLN可保持局部缺血心脏的肌酸/磷酸肌酸含量，这对于维持ATP动态平衡是至关重要的，并且有助于解释在这些大鼠心脏中的改善的再灌注后的心肌功能。
[0103]图6显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织ATP/ADP比率的影响。向大鼠IP注射LR对照溶液(n = 10)(空白条)或0.52g/kg的GLN(如丙氨酸-谷氨酰胺)(n = 10)(实心条)，18小时后，取出心脏并进行实验性局部缺血/再灌注损伤。再灌注后60分钟切取局部缺血后组织。经由31P-MRS分析ATP/ADP比率。(经由ANOVA,与局部缺血前值相比，***-p < 0.001，**p < 0.01，与局部缺血后LR对照组织相比，###-p < 0.001)
[0104]谷氨 酰胺预处理减少大鼠心肌I/R损伤后的心肌乳酸盐积聚。利用前述的大鼠工作心脏模型，在60分钟的再灌注时间后，从以上图5描述的大鼠中收集心肌组织。在18小时时也切取以GLN或LR处理的对照动物的心肌组织，但该组织不暴露于I/R损伤(局部缺血前)并且立即于液氮中冷冻用作分析。通过1H-MRS分析该组织的乳酸盐含量。与对照动物相比，暴露于I/R损伤的两组动物均显著增加心肌组织的乳酸盐含量。然而，在心肌I/R损伤前18小时以GLN进行预处理，导致I/R损伤后心肌乳酸盐积聚的显著减少(图7)。具体地说，GLN预处理比对照动物减少组织乳酸盐的增加> 55%。这表明GLN可减少I/R损伤后心肌组织酸中毒。这种减少是由于GLN引起的心肌组织代谢的保护，特别是保护适当的TCA循环功能。这种减少可通过在TCA循环中GLN为代谢提供底物(通过转化为谷氨酸盐)而发生或经由GLN引起的对TCA循环酶功能的保护(通过HSP诱导)而发生。
[0105]图7显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织乳酸盐的影响。向大鼠IP注射LR对照溶液(n= 10)(空白条)或0.52g/kg的GLN(如丙氨酸-谷氨酰胺Mn = 10)(实心条)，18小时后，取出心脏并进行实验性局部缺血/再灌注损伤。再灌注后60分钟切取局部缺血后组织。经由1H-MRS分析乳酸盐。(经由AN0VA，与局部缺血前值相比，***_P < 0.001，*p < 0.05，与局部缺血后LR对照组织相比，###-p < 0.001)
[0106]谷氨酰胺预处理增加大鼠心肌I/R损伤后的心肌组织(谷氨酰胺、谷氨酸盐和葡萄糖)含量。利用前述的大鼠工作心脏模型，在60分钟的再灌注时间后，从以上图5描述的大鼠中收集心肌组织。在18小时(局部缺血前)时也切取以GLN或LR(LR)处理的对照动物的心肌组织，但该组织不暴露于I/R损伤并且立即于液氮中冷冻用作分析。通过1H-磁共振波谱(MRS)分析该组织的谷氨酰胺、谷氨酸盐和葡萄糖含量。暴露于I/R损伤的GLN和LR对照动物均显著降低I/R损伤后GLN和葡萄糖含量。然而，经GLN处理的动物被证明没有降低局部缺血后谷氨酸盐水平(与局部缺血前比较)。谷氨酸盐是心肌损伤后的重要的组织底物并且有益的是，I/R损伤前18小时给予的单剂量GLN可保持损伤后这种关键底物的组织水平。还有，与LR对照动物相比，在心肌I/R损伤前18小时以GLN进行预处理，导致I/R损伤后心肌组织谷氨酰胺和葡萄糖的含量增加(图8)。此数据表明GLN预处理可增加在I/R损伤后所利用的许多关键底物的心肌组织含量。这个重要结果证实，用(手术前)远期的GLN预处理剂量可能增加心肌组织底物(尤其是谷氨酸盐)的含量。
[0107]更具体地说，图8显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织底物(谷氨酸盐、谷氨酰胺和葡萄糖)的影响。向大鼠IP注射LR对照溶液(n= 10)(空白条)或0.52g/kg的GLN(如丙氨酸-谷氨酰胺)(n= 10)(实心条)，18小时后，取出心脏并进行实验性局部缺血/再灌注损伤。再灌注后60分钟切取局部缺血后组织。经由1H-MRS分析底物。(经由AN0VA，与局部缺血前LR对照相比，++-P < 0.01，与局部缺血前值相比，***-p < 0.001，*p < 0.05，与局部缺血后 LR 对照组织相比，##-p < 0.01，###-p < 0.001)
[0108]谷氨酰胺预处理增加大鼠心肌I/R损伤后的心肌组织还原性谷胱甘肽含量。利用前述的大鼠工作心脏模型，在60分钟的再灌注时间后，从以上图5描述的大鼠中收集心肌组织。在18小时(局部缺血前)时也切取以GLN或LR(LR)处理的对照动物的心肌组织，但该组织不暴露于I/R损伤并且立即于液氮中冷冻用作分析。通过1H-磁共振波谱(MRS)分析该组织的心肌组织还原性谷胱甘肽含量。经受I/R损伤的GLN和LR对照动物均显示减少还原性GSH含量，然而与在LR对照动物中所见到的相比，以GLN处理的动物显示最小限度的减少。具体来说，在心肌I/R损伤前18小时以GLN进行预处理，导致I/R损伤后明显增加心肌组织还原性谷胱甘肽含量(图9)。
[0109]GSH损耗可使由心肌I/R损伤造成的心脏功能紊乱恶化。病因学的部分可涉及减弱的心肌抗氧化剂保护。还有，在阿霉素损伤后的心肌中，GLN显示保持GSH含量和减少损伤。最后，GLN是已知为谷胱甘肽合成的限速前体，因此心肌I/R损伤后观察到的谷胱甘肽含量增加可反映出用于谷胱甘肽产生的有用的前体的增加。
[0110]图9显示在大鼠工作心脏模型中，心肌缺血/再灌注损伤对心肌组织还原性谷胱甘肽的影响。向大鼠IP注射LR对照溶液(n = 10)(空白条)或0.52g/kg的GLN(如丙氨酸-谷氨酰胺)(n= 10)(实心条)，18小时后，取出心脏并进行实验性局部缺血/再灌注损伤。再灌注后60分钟切取局部缺血后组织。经由1H-MRS分析乳酸盐。(经由AN0VA，与局部缺血前值相比，_1 < 0.001/p < 0.05，与局部缺血后LR对照组织相比，#-p < 0.05)。
[0111]谷氨酰胺预处理保持大鼠心肌I/R损伤后的心肌NAD (+)/NADH含量。利用前述的大鼠工作心脏模型，在60分钟的再灌注时间后，从以上图5描述的大鼠中摘取心肌组织。在18小时时也切取以GLN或LR (LR)处理的对照动物的心肌组织，但该组织不暴露于I/R损伤(局部缺血前)并且立即于液氮中冷冻用作分析。通过31P-磁共振波谱(MRS)分析该组织的NAD (+) /NADH含量。只有在暴露于I/R损伤的LR对照组中的动物证明总NAD (+) /NADH含量较在局部缺血前情况下降低。在以GLN处理的动物中未见局部缺血后NAD (+) /NADH含量的变化(与局部缺血前含量相比)。具体地说，在心肌I/R损伤前18小时以GLN进行预处理，导致I/R损伤后显著地维持NAD (+) /NADH的含量(图10)。
[0112]NADH含量的保持对心肌抵抗I/R损伤后不可避免的活性氧形式(reactiveoxygen species)的产生的能力是至关重要的。先前,伴有丙酮酸盐和其它氨基酸的底物增加显示保持NAD (+)/NADH含量以及保护心肌避免收缩功能紊乱和心肌组织损伤。GLN以相似的方式(通过底物增加)起作用，以保持NADH含量和减少心肌组织损伤以及增强心肌收缩性。还有，增加的NAD(+)/NADH含量是增强的线粒体氧化磷酸化的标志。增加的含量解释先前描述的GLN预处理后的ATP/ADP比率的提高。
[0113]图10显示心肌缺血/再灌注损伤对大鼠工作心脏模型中心肌组织NAD (+)/NADH含量的影响。向大鼠IP注射LR对照溶液(n = 10)(空白条)或0.52g/kg的GLN(如丙氨酸-谷氨酰胺)(n = 10)(实心条)，18小时后，取出心脏并进行实验性局部缺血/再灌注损伤。再灌注后60分钟切取局部缺血后组织。经由1H-MRS分析NAD (+)/NADH。(经由ANOVA,与局部缺血前值相比，**-p < 0.01，与局部缺血后LR对照组织相比，##-p < 0.0)。 [0114]暴露于心肌I/R损伤的大鼠心脏的NMR/MRS光谱。作为1H-MRS的特例见下图11。图11显示在大鼠工作心脏模型中暴露于局部缺血和再灌注损伤的大鼠心肌组织的1H-MRS光谱。向大鼠IP注射LR对照溶液或0.52g/kg的GLN，18小时后，取出心脏并进行实验性局部缺血/再灌注损伤。再灌注后60分钟切取局部缺血后组织。(GLN=谷氨酰胺，GLU =谷氨酸盐，Tau =牛磺酸,CR+PCr =肌酸+磷酸肌酸,Suc =琥拍酸盐,Ala =丙氨酸,Lac =乳酸盐)。
[0115]治疗和随机程序。给随机编入GLN组(治疗组)的患者手术前口服L-GLN50克(口服25克，每天2次)，持续2天，也可在手术当天早晨服用25克GLN。给随机编入安慰剂组的患者手术前口服安慰剂混合物(每天2次)，持续2天，也可在手术当天早晨服用该混合物。安慰剂由麦芽右旋糖苷(maltodextran)粉(每剂25克)组成。给随机编入等氮物(iso-nitrogenous)对照组的患者手术前口服对照混合物(每天2次)，持续2天,也可在手术当天早晨服用该混合物。等氮物对照治疗由相当于25克的GLN的氮的氨基酸混合物(不含谷氨酰胺或谷氨酸盐)组成。
[0116]在进入(试验)期间，患者也接受可由GCRC配膳员控制的蛋白质含量的标准化膳食，给予患者每天热量需求的约20%的蛋白质和20%的脂肪，剩下的60%作为碳水化合物热量给予。膳食固定下来以便控制手术前膳食的摄入量。
[0117]GLN的选择的剂量是基于先前给予人的安全的最大剂量。该剂量可耐受良好且无不良的副作用，即使在危重病症的患者中(26-30)。在整个研究中还抽取血液以评价GLN水平。第一次抽血发生在进入时(< 当时3毫升的血)。另一次GLN水平在首次GLN/安慰剂/等氮物对照的剂量之后一小时获得，在导入麻醉剂之前得到一次GLN水平，以及在CABG手术后24小时时获得最后一次GLN水平。
[0118]方法:
[0119]确定GLN对心肌组织损伤的影响
[0120]心肌组织损伤的评价。以下的实验室测试可在CABG手术前2天进行；肌酸磷酸激酶(CPK)(用MB同工型)和肌钙蛋白分析。
[0121]手术前、诱导麻醉后，但在打开胸骨之前，从患者抽取约5毫升的血液用于下列分析:CPK-MB和肌钙蛋白分析。在旁路手术的开始和动脉钳夹松开后2分钟，取冠脉流出液用于评估肌钙蛋白和CPK-MB的水平。在手术后、转移至ICU前，抽取约5毫升的血液用于CPK-MB和肌钙蛋白(分析)。在手术后6和24小时，再取血样用于CPK-MB和肌钙蛋白(分析)(约5毫升的血液)。
[0122]如同通过血浆和冠脉流出液肌钙蛋白和CPK-MB测量所检测的那样，手术前GLN预处理可显著减少心肌损伤。细胞和整体动物模型的临床前数据均显示，GLN预处理呈现出保护心肌避免I/R损伤并且这种保护也在经受CABG手术的人体中被观察到。
[0123]统计分析。数据分布的正态性由Q-Q图的目测检查。当需要时使用对数转换并对正态性再次检查。通过用于重复测量的ANOVA以分析心脏损伤的标记物的差异；如果观察到显著的总体差异被发现存在于各组之间，则采用Studentst检验方法分析在单个时间点时的差异。P值<0.05被认为是有显著意义的。对于所有统计分析，使用SPSS软件包(版本10.07，SPSS有限公司，芝加哥，伊利诺伊州)。[0124]确定GLN对人心房组织热休克蛋白含量的影响。
[0125]右心房组织切取:在冠脉搭桥本期间，在心房插管时，研究者将患者的右心耳的部分切取并迅速冷冻于液氮中。此外，在心肺旁路结束时，从插管位置的周围再切取右心耳组织并迅速冷冻于液氮中。此组织可用于热休克蛋白评价。
[0126]蛋白质印迹分析:经由蛋白质免疫印迹术，通过前述的技术，切取的心房组织可用于热休克蛋白72和27含量分析。用密度测定法分析HSP72含量。
[0127]如果患者经历CABG，则GLN治疗增加右心房组织的HSP72和27水平。在大量前述的细胞和动物模型中，观察到在给予GLN后HSP水平的预应激变化。然而，GLN对损伤后组织HSP表达具有极深的的影响。然而，假定在本研究中的患者均患有某种程度的冠脉缺血，在这些患者中的许多人发生的慢性I/R损伤可导致GLN也增加在心肺旁路前切取的心房组织中的HSP水平。
[0128]统计分析。数据分布的正态性由Q-Q图的目测检查。当需要时使用对数转换并对正态性再次检查。通过用于重复测量的ANOVA以分析右心房组织中热休克蛋白表达的差异；如果观察到显著的总体差异被发现存在于各组之间，则采用Studentst检验方法分析在单个时间点时的差异。P值<0.05被认为是有显著意义的。对于所有统计分析，使用SPSS软件包(版本10.07，SPSS有限公司，芝加哥，伊利诺伊州)。
[0129]确定GLN对人心房组织中的细胞代谢的影响。
[0130]在冠脉搭桥本开始之前，从患者身上切取右心耳组织，并且在心肺旁路中止时立即通过1H-和31P-磁共振波谱(MRS)进行细胞代谢的分析。31P-MRS提供有关心房组织高能量磷酸盐(41?、么0?、磷酸肌酸、熟0(+)31?/^0?比率)浓度的信息。以下的水溶性的代谢物由心房组织提取物的1H-MRS进行定量:丙氨酸、天(门)冬氨酸盐、肌酸+磷酸肌酸、葡萄糖、谷氨酸盐、谷氨酰胺、谷胱甘肽、甘油磷酸胆碱、乳酸盐、磷酸胆碱、琥珀酸盐、牛磺酸以及缬氨酸+亮氨酸+异亮氨酸。以下的脂质代谢物由脂质提取物的1H-MRS光谱进行定量:胆固醇、胆碱、磷酸甘油、单不饱和脂肪酸(MUFA)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、多不饱和脂肪酸(PUFA)、总脂肪酸和甘油三酸脂(triacylglycerides)。
[0131]右心房组织切取:在冠脉搭桥术期间、在心肺旁路的开始时，研究者将患者的右心耳的部分切除并迅速将其冷冻于液氮中。在心肺旁路中止之后还从插管位置周围切取右心房组织并迅速将其冷冻于液氮中。随后将组织分开用于细胞代谢和热休克蛋白分析。
[0132]双PCA/脂质萃取。为了对心房组织实施高分辩率磁共振波谱(MRS)，采用如由Serkova等详细描述的双高氯酸(PCA)/脂质提取程序对收集的冷冻样本进行提取。将急剧冷冻的心脏组织称重，在液氮的存在下在研钵研磨机中匀化该组织，用4ml冰冷的PCA(12%)提取。每次提取，需要0.3至0.5g心房组织。将样本离心，移去水相，用KOH中和，再次离心。在水提取步骤后从残留的沉淀(pellet)中萃取脂质部分。将该沉淀溶解于4ml冰冷的水中并中和该溶液。将水提取物和再溶解的沉淀均冻干过夜。将水提取物的冻干物(Iyophilisates)再溶解于0.45ml氧化氣(D2O)中并用氯化氣(deuterium chloride)(DCl)和重水(NaOD)调节至pH7。从再溶解的沉淀的冻干物中、通过加入Iml的氘化的氯仿/甲醇混合物(CDC13/CD30D ;2: lv/v)萃取脂质部分。离心后，用MRS分析上清液。
[0133]对右心房组织的提取物MRS评价。基于1H-和31P-核磁共振(NMR)波谱的MRS实验如前所述(Serkova等，(44))进行。所有组织PCA水的和脂质提取物的一维MR光谱记录在Bruker500MHz Avance光谱仪上并且用WINNMR软件(Bruker Biospec有限公司，弗里蒙特，加利福尼亚)处理。所有实验中使用5mm-TXI (反相三共振(inverse triple resonance))探头。对于质子MRS，运行频率可为500MHz，将标准预饱和脉冲方法用于水抑制。其它参数如下:40积聚;90。脉冲角度；0dB功率水平；7.35 u s脉宽；IOppm谱宽和12.85秒重复时间。使用三甲基甲硅烷丙-2，2，3，3，-d4酸(TSP，0.6mmol/l用于PCA提取物和1.2mmol/l用于脂质)作为外标物用于基于1H-MR光谱的代谢物定量。在Oppm将光谱的1H化学位移引用到TSP。对于PCA提取物的31P-MRS分析，为了络合二价离子，加入lOOmmol/lEDTA产生显著的较窄的31P峰的线宽。用KOH和HCl调节pH至7。使用以下的具有复合的脉冲去偶合(CPD)程序的NMR参数:202.3MHz操作31P频率；800积聚;90。脉冲角度；12dB适于31P频道的功率水平；9 u s脉宽；35ppm谱宽和2.0秒重复时间。将磷酸肌酸在_2.33ppm时的化学位移用作位移参考。从1H-MRS计算的磷酸肌酸的绝对浓度被用于31P-MR光谱的代谢物定量。
[0134]预期的结果:GLN可增加细胞ATP的含量、提高ATP/ADP比率以及增加NAD (+) /NADH和肌酸/磷酸肌酸的含量。GLN还减少心肌组织乳酸盐和提高心肌组织谷氨酸盐、谷氨酰胺和葡萄糖的水平。最后，`提高心肌组织谷胱甘肽的水平。
[0135]统计分析。数据分布的正态性由Q-Q图的目测检查。当需要时使用对数转换并对正态性再次检查。通过用于重复测量的ANOVA以分析右心房组织代谢标记物(marker)的差异；如果观察到显著的总体差异被发现存在于各组之间，则采用Studentst检验方法分析在单个时间点时的差异。P值<0.05被认为是有显著意义的。对于所有统计分析，使用SPSS软件包(版本10.07，SPSS有限公司，芝加哥，伊利诺伊州)。
[0136]确定GLN对手术后心脏功能和总体患者预后的影响
[0137]对手术前和手术后心脏功能的评价
[0138]为了评估手术前心脏功能，在诱导麻醉时放置持续的心脏指数/输出swan ganz导管。记录心脏输出(CO)、心脏指数(Cl)和系统性血管阻力(SVR)。在结束心肺旁路后、在紧临胸骨闭合时间前，记录心脏参数(CO、Cl和SVR)。于CABG手术之后6和24小时评估心脏参数(C0、CI和SVR)。记录的其它数据可包括移植的冠状血管的数量和移植物的具体定位(即左主冠脉、右冠脉，敞开的(exedra.))、心肺旁路的长度和血红细胞输血。[0139]此外，分析了手术前心脏心律失常(具体为:心房纤维颤动、心房扑动、提早的心室复合波、心室心动过速/纤维颤动和起搏器/去纤颤器需求、抗心律失常治疗需求)的发生率。记录手术后心律失常的发生，以及起搏和/或抗心律失常治疗需求。
[0140]血管加压剂治疗需求的评价:在麻醉的开始时，记录任何血管加压剂治疗的需求及其剂量。(血管加压剂治疗包括使用任何下列药物:肾上腺素、去甲肾上腺素、血管加压素、多巴胺、多巴酚丁胺、去氧肾上腺素或米力农(milrinone))。记录在结束心肺旁路后、在紧临胸骨闭合时间前，记录任何上述血管加压剂的使用和剂量。最后，在CABG手术之后24小时时，记录血管加压剂使用和剂量的数据，
[0141]手术后临床预后的评价:在CABG手术之后记录这些额外的临床参数:
[0142]1.手术后心脏心律失常的发生的评价
[0143]2.手术后的插管的时间长度
[0144]3.再插管的需求
[0145]4.住在I⑶的时间长度
[0146]5.住院的时间长度
[0147]6.生存趋势(包括6个月生存)
[0148]预期的结果和评论:GLN治疗被用于改善在结束心肺芳路后和CABG后24小时时的心脏功能指数(尤其是心脏指数)。关于血管加压剂治疗的应用，GLN治疗减少血管加压药物使用的需求。最后，GLN治疗减少CABG后插管的时间长度和住在ICU的时间长度。
[0149]统计分析:数据分布的正态性由Q-Q图的目测检查。当需要时使用对数转换并对正态性再次检查。用单向或重复测量的ANOVA进行两组的比较。通过Mann-WhitneyU检验比较住在ICU和住院的时间长度和插管的时间长度。用两边的Fisher' s精确检验比较比率和次序(ordinal)的数据。p值< 0.05被认为是有显著意义的。对于所有统计分析，使用SPSS软件包(版本10.07，SPSS有限公司，芝加哥，伊利诺伊州)。
[0150]研究后数据分析:如在此之前描述的，将所有收集的数据作显著性检验。使用SPSS软件包(版本10.07，SPSS有限公司，芝加哥，伊利诺伊州)计算分布的统计数据并用于所有统计分析。P值<0.05被认为是有显著意义的。
[0151]实施例2:
[0152]谷氨酰胺(GLN)降低内毒素引致的死亡率。提高的白细胞介素-18(IL_18)水平在细胞因子引致的器官衰竭中似乎起关键的作用并可预测脓毒症患者的死亡率。用GLN治疗后减少促炎因子(IL-18、IL-6、细胞因子表达，增强肺热休克蛋白72(HSP72)表达，改善2CLP后的生存。使Sprague-Dawley大鼠(250_300g)经受2CLP并在手术后一小时给予单剂量的GLN(0.75g/Kg) (n = 18)或平衡盐溶液(对照)(n = 17)。监测五天的生存情况。在单个组别的动物中，于多个不同的时间点抽取血液用于细胞因子(IL-18、IL-6TNF- a和IL-10)表达的分析。切取肺组织用于HSP72的分析。2CLP后一小时给予GLN显著减少2CLP后12、18和24小时时的IL-18表达(p < 0.05)。2CLP后6小时时的IL-16和TNF-a的表达被减少(P < 0.05)。与对照相比，GLN增强2CLP后的肺HSP72表达(p < 0.05)。最后，GLN将2CLP后的五天死亡率从78%降低至42% (p <.04)。数据表明，GLN可显著改善自2CLP的生存。对于这种保护的可能的机制包括减少促炎细胞因子表达和增强肺HSP72表达。还有，这是在2CLP模型中IL-18表达的首次描述。这些数据表明，给予单剂量GLN作为后处理可减弱全身性炎症反应综合征(SIRS)和降低由多微生物性脓毒症的致死率。
[0153]实施例2:
[0154]已知脓毒症与组织代谢的内在精神错乱相关。近期的资料显示氧利用和组织代谢功能的主要决定性因素是细胞的NAD+水平。在内毒素血症性(endotoxemic)休克后GLN可保持ATP含量并减小乳酸盐积聚。本研究测试以下假设，即GLN作为后处理给予，在多微生物性脓毒症后，保持肺和心组织中的NAD+水平和减弱代谢功能紊乱。
[0155]方法:使雄性Sprague-Dawley大鼠(300_350g)经受盲肠结扎加穿孔(CLP)并在手术后一小时给予单剂量的GLN(0.75g/Kg) (n = 18)或平衡盐溶液(对照)(n = 17)。监测五天的生存情况。在单个组别的动物中(n = 4/组)，于CLP后24小时切取肺和心组织并用1H-MRS和31P-MRS分析组织代谢。
[0156]结果:给予GLN导致CLP后的肺和心组织的NAD+含量均显著提高(p < 0.005)。还有，GLN显著延缓肺组织中ATP/ADP比率(p < 0.005)、肌酸/磷酸肌酸(p < 0.01)、葡萄糖(P < 0.01)和谷氨酰胺(P <.005)的下降。(P < 0.01)。给予GLN导致肺乳酸积聚减少的倾向(P < 0.06)。GLN介导的组织代谢功能紊乱的减弱与CLP后五天内死亡率的显著降低有关[78%(GLN)与42%(对照)比较(p < 0.04)。
[0157]结论:于经由盲肠结扎加穿孔产生的脓毒症之后在肺和心组织观察到，给予GLN可减弱代谢功能紊乱和NAD+的下降。最显著的效应在肺组织中观察到。改善的组织代谢与改善的生存相关。对该效应可能的解释可包括GLN操纵热休克蛋白、减弱PPAR的激活、保持组织谷胱甘肽的含量或经由提高代谢底物的可利用度。
[0158]实施 例3:
[0159]单剂量的谷氨酰胺可改善局部缺血和再灌注损伤后的心功能。这与谷氨酰胺的预防局部缺血和再灌注后代谢功能紊乱的能力有关。在这种谷氨酰胺的给药可改善诸如冠状动脉疾病、心脏病发作和心肺旁路手术的心脏疾病的预后。
[0160]谷氨酰胺(以丙氨酰-谷氨酰胺二肽给予)当以单剂量形式给予时，可改善自局部缺血和再灌注损伤后的预后。这在局部缺血和再灌注损伤的大鼠模型中显示。这可能是由于代谢功能和谷胱甘肽水平的维持。增强的心休克蛋白表达也起作用。
[0161]于心肌损伤前18小时，将单剂量的谷氨酰胺二肽(丙氨酰-谷氨酰胺)给予大鼠，可改善局部缺血和再灌注损伤后的心肌功能。这种保护是由于代谢和谷胱甘肽水平的维持。单剂量的丙氨酰-谷氨酰胺是经由组织代谢(ATP含量除外)的维持和组织中谷胱甘肽水平的维持起作用的。
[0162]常出现的氨基酸二肽，如丙氨酰-谷氨酰胺，作为单剂量药物为了改善自心脏缺血和再灌注损伤的预后的设想，从未被其它的研究者所测试。
[0163]本项技术可用于将丙氨酸-谷氨酰胺或其它谷氨酰胺二肽给予患有心脏病发作来到ER的患者、为了做心脏外科手术而来的患者或患有慢性心绞痛的患者。其好处是巨大的，因为这是一种优良的并且相当廉价的氨基酸。
[0164]实施例4:
[0165]尚无药物被发现对中暑的治疗有益。先前的研究已经表明，增强的热休克蛋白70 (HSP70)表达可改善实验性中暑后的生存。然而，尚无临床上相关的HSP70增强剂用于人体试验。静脉内给予谷氨酰胺(GLN)可增强啮齿类动物的脓毒症和局部缺血/再灌注损伤模型中的组织HSP70表达。本文检测在大鼠中给予GLN是否可增强组织HSP70表达和改善中暑后的生存。
[0166]方法:在进行实验性中暑之前,经由喂饲法,一天两次给予Sprague-Dawley大鼠(250-300g)GLN(0.65g/kg) (n = 8)或平衡盐溶液(BSS) (n = 8)(对照，溶媒 GLN 溶解于此)五天。在麻醉(克他命/甲苯噻嗪)的大鼠上通过将动物的体温升至42°C (直肠温度)30分钟使大鼠中暑。分析中暑后五天内的生存情况。经由蛋白质印迹(n= 10/组)，于中暑后I小时和24小时时，在分开关养的动物中，分析心和肺组织的HSP70和热休克因子-1激活作用(HSF-1)。对于生存采用Fischer' s精确检验和对于HSP-70和HSF-1表达采用Duncan分组的ANOVA作为hoc后检验进行统计学分析。
[0167]结果:在对照的动物中，中暑导致明显的死亡率((5/8),62.5%)，反之，口服GLN治疗则显著地降低死亡率((1/8)，12.5%) (p < 0.003)。所有的死亡率出现在中暑后的前48小时内。给予GLN还显著增强中暑后I小时心和肺两个组织的HSP70表达(p < 0.01，对于两个组织，与体温未升高的动物和体温升高的对照组比较)。于24小时时，在GLN治疗的和对照的动物中均见心和肺组织中的HSP70表达的显著增强(与体温未升高的动物对比)。然而，于中暑后24小时时，未见GLN和对照动物之间的HSP70有显著差异。于中暑后的任一测试时间点未见HSF-1激活(用于HSP70的转录因子)有变化。
[0168]结论:结果证明口服(体内)给予GLN可改善致命的中暑损伤的生存。结果还首次显示，口服GLN可增强中暑损伤后不久的组织HSP70表达。两个体温升高组于中暑后24小时具有类似的HSP70增加，这个事实证实GLN可加速HSP70的表达，而且这是经由GLN增加中暑生存的一个机制。未见HSF-1激活有变化的事实显示，GLN引起更加快速的现有的HSP70mRNA的翻译，而不是新的HSP70基因激活。数据表明，口服GLN在危险人群诸如运动员和士兵中预防中暑死亡是有用的。
[0169]实施例5:
[0170]脓毒症引起的损伤的途径包括炎症细胞因子释放、增强的iNOS活性和组织代谢功能紊乱。热应激蛋白(HSP)路径已知在脓毒症的病理生理学中起重要的作用并且增强的HSP激活作用可改善脓毒症后的生存。
[0171]在盲肠结扎加穿孔(CLP)的大鼠中，在CLP开始后给予单剂量的谷氨酰胺(GLN)可增强肺的HSP表达，减弱组织损伤路径和改善生存。
[0172]方法:将雄性Sprague-Dawley大鼠分成5组。两组在CLP前6小时用400mg/kg的槲皮素(Q) IP(HSP70抑制剂)处理。实施CLP并且于CLP后一个小时给予GLN(0.75g/kg, IV)或平衡盐溶液(BSS) (n = 10/组)。另两组接受减除了槲皮素的同样的GLN+CLP(n=18)或BSS+CLP(n = 17)处理。最后一组(对照，n = 6)未接受任何处理。监测五天内的生存。在分开的研究中，于CLP后的24小时切取肺并用31P-和1H-MRS分析组织代谢。最后的研究分析在CLP后6个小时时血液的TNF-和在CLP后6个小时时肺组织的HSP-70、iNOS、eNOS和激活的热休克因子-1 (HSF-1)。
[0173]结果:脓毒症后单剂量的GLN增强肺HSF-1激活作用和HSP70表达。GLN导致显著地改善5天生存率、减少肺iNOS和血浆TNF-表达。GLN增强肺eNOS和提高肺ATP/ADP比率、NAD+以及减少乳酸盐积聚。由Q产生的HSF-1激活的抑制和后续的HSP70表达抵消GLNs生存的益处并阻碍对肺组织代谢功能紊乱的改善。没有记录Q对TNF-或NOS表达的作用。
[0174]结论:GLN的增强HSP激活和减弱组织代谢功能紊乱的能力是GLN降低脓毒症死亡率的关键机制。由于Q的作用，GLN减弱TNF-和iNOS活性似乎不是GLNs有益作用的关键机制。
[0175]实施例6:
[0176]增高的血清热休克蛋白72(sHSP72)与严重外伤后增加的生存相关。然而，在人类未发现临床上有关的HSP72增强剂。在啮齿类动物中谷氨酰胺(GLN)已显示增强组织HSP72水平并且改善脓毒症后的生存和全身性炎症反应(SIRS)。实施本研究以确定在大鼠中GLN能否增高sHSP72水平和改善在实验性SIRS中的生存以及评价在患有胰腺炎的患者中GLN能否增高sHSP72水平和改善全身性炎症指征。
[0177]方法:在经受盲肠结扎加穿孔(CLP)的Sprague-Dawley大鼠中，检测sHSP72,于CLP后I小时给予单剂量的GLN(以ALA-GLN给予)(0.75g/Kg) (n = 4)或平衡盐溶液(BSS)(n = 4)。第三组(对照，n = 4)未接受任何处理。监测分开关养的大鼠五天。于CLP后6个小时检测对照大鼠和GLN/BSS大鼠的sHSP72。采用ELISA检测sHSP72。于外科清创术后，评价患有胰腺炎的患者中的SHSP72。符合条件的患者在ICU中，在入院登记时具有标记如对C反应性蛋白检测(>10)的全身性炎症。符合条件的患者需要TPN >7天。描绘患者的sHSP72基线并随机分成ivGLN(0.3g/kg) (n = 3)(以ALA-GLN给予)或标准的TPN(n=3)组。入院登记后描绘sHSP72计7天。
[0178]结果:在实验性SIRS后，GLN显著地增强sHSP72(与BSS对比，p < 0.05)和改善生存率(61% (GLN)对比 1 8% (BSS) ;p < 0.01)。
[0179]实施例7:
[0180]以上的体内和体外的数据显示，热休克反应的诱导可减少促炎细胞因子的释放。无法抵抗的促炎和免疫反应是脓毒性休克的关键特征并在组织损伤、多器官系统功能紊乱和最终的死亡的发病机理中起重要的作用。此前已经显示，谷氨酰胺(作为药物补充剂给予)在LPS处理的动物中可改善生存、增加热休克蛋白表达和减弱促炎细胞因子释放，在不具完全抑制细胞因子释放或阻碍后续的作用情况下发生作用。谷氨酰胺缺乏也已显示在培养的血单核细胞(PMBCs)中调节体外细胞因子产生和在培养的人十二指肠组织中补充减少的白细胞介素(IL)-6和IL-8。
[0181]迄今为止，尚无药物被发现对治疗人的中暑有益。先前已经显示，热应激和中暑对循环的细胞因子释放具有重要意义的作用并且增强的热休克蛋白70(HSP70)可改善实验性中暑后的生存。
[0182]谷氨酰胺预处理的好处是巨大的，因为这是一种优良的并且是相对便宜的氨基酸。口服谷氨酰胺预处理的一种用途是在危险人群诸如士兵和运动员中防止死于中暑，其中后续的对身体的热应激是不可避免的。
[0183]上述的数据显示，在体外和体内实验中，有药理作用的谷氨酰胺补充剂是潜在的热休克蛋白72(HSP72)表达的增强剂。此外，经谷氨酰胺处理的外周血单核细胞表现出热休克蛋白表达的增强和显著减少肿瘤坏死因子a的释放。特别是，连续五天给予大鼠口服谷氨酰胺进行预处理并随后将其暴露于实验性中暑时，可改善生存并增强热休克蛋白的表达。[0184]方法:将符合条件的患者随机分入谷氨酰胺(治疗)组，当时他们的最初的治疗是在GCRC中的热管中进行后续的热应激之前，口服接受0.65g/kg的剂量的L-谷氨酰胺，每天两次，持续五天。患者还于后续的热应激之前的早晨服用L-谷氨酰胺。然后将患者置于温度为摄氏40度(+/-2°C )的热管中30分钟或直至他们的口腔温度达到99.6F°或更高。选择的L-谷氨酰胺的剂量是基于之前在人体已经安全施用的最大剂量。该剂量耐受良好印使是在危重病患者中也没有不良的副作用。
[0185]在最初研究(谷氨酰胺的半衰期为6小时)之后的为期4周的清除(washout)之后，患者返回并用由麦芽右旋糖苷粉组成的安慰剂继续同样的实验过程。患者被随机安排如最初所做的那样服用安慰剂，然后，在为期2周的清除之后返回，以完成本研究的L-谷氨酰胺治疗目的。
[0186]为了评估整个研究过程的细胞因子反应、热休克蛋白表达和谷氨酰胺水平，从所有的患者中抽血(IOcc/时间点)。在得到同意后抽取基线的血并且给予口服L-谷氨酰胺/安慰剂的使用说明。在热管中于热应激之前的早晨、在给予末次剂量的L-谷氨酰胺/安慰剂之后抽取血样。另外的抽血时间点包括患者经受热应激之后的I小时、6小时和24小时。每个时间点是依赖于此时在血液中的特别的细胞因子(TNF-a、IL-U IL_6和IL-18)的在促炎级联反应中的表达，然而，在每个时间点检测所有的细胞因子。
[0187]于基线时、末次剂量的L-谷氨酰胺/安慰剂后、1、6和24小时后,将IOml的血样抽入EDTA试管中。将该试管离心且分离血浆用于谷氨酰胺和细胞因子分析。将样本冷冻并于80°C储存。此外，于基线时、末次剂量的L-谷氨酰胺/安慰剂后、1、6和24小时后，取5ml的血置入红盖试管中，用于后续的血液的LPS刺激。
[0188]在研究的每个目的期间，从每个患者中总共抽取约75ml的血。清除期为一个月，然后，另抽取患者75 ml的血。
[0189]热休克蛋白表达的分析:使用对人血清HSP70有特异性的酶联免疫吸附试验(ELISA)分析血清热休克蛋白70(HSP70)表达。(Stressgen，维多利亚BC，加拿大)依据生产厂商的说明书实施所述试验。使用蛋白质印迹还分析HSP70、H0-1和HSP27。于热应激后6小时时抽血并将血液置于含有蛋白酶抑制剂合剂(Roche Molecular,印第安纳波利斯，印第安纳州)的集血管中。将血液以5000旋转/分钟离心3分钟，除去含有血浆的上清液并于摄氏_80°C下冷冻。用Lowry方法确定样本的蛋白质浓度。使用标准式样的10%SDSPAGE凝胶，用IX处理缓冲器，进行蛋白质印迹分析。以5%Blotto (5%重量:体积于含有0.1%吐温的磷酸缓冲盐水中的脱脂干乳)阻挡微孔膜。为了检测HSP72，然后以特异性的小鼠单克隆抗体，C92(StressGen,维多利亚BC,加拿大)孵育印迹(blots)。然后以第二山羊抗小鼠HRPO抗体(Santa Cruz, CA)洗涤和孵育印迹并且用增强化学发光系统显影。对于对照蛋白质HSC73，使用对组成型HSC73 (StressGen)的特异性大鼠单克隆抗体。对于H0-1检测，使用前述的蛋白质印迹技术，用对H0-1的兔多克隆抗体(StressGen)孵育膜。
[0190]促炎细胞因子释放的分析:
[0191]TNF-a检测:使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TNF_a浓度。于热应激后6小时时抽血并用LPS刺激。使用来自Endogen (Woburn，马萨诸塞州)的适合于TNF-a的ELISA试剂盒测定TNF-a浓度。然后使用酶标板读数仪(microplate reader) (Thermo LabSystems Opsys MR, Chantily,维吉尼亚州)，将结果以光电比色计分析确定。[0192]IL-6和IL-1检测:使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定白细胞介素_6和白细胞介素-1浓度。于热应激后6小时时抽血并用LPS刺激。然后使用来自ResearchDiagnostics有限公司(佛兰德斯，新泽西州)的分别适合于大鼠IL-6和IL-1的ELISA试剂盒分析血液。然后使用酶标板读数仪(Thermo Lab Systems Opsys MR, Chantily,维吉尼亚州)以光电比色计获得结果。
[0193]IL-18检测:于热应激后24小时时抽血并用LPS刺激。使用之前所述的来自Biosource International (Camarillo,加利福尼亚州)的 ELISA 试剂盒测定 IL-18 浓度。
[0194]实施例8:
[0195]GLN的保护作用可能是由于增强的热休克蛋白(HSPs)，尤其是HSP70表达。长久已知在经由亚致死量的加热和/或砷的实验动物中的HSP70诱导显著抵抗许多形式的损伤。然而，可安全地并且容易地给予病人的HSP70的临床相关的增强剂现正缺乏。GLN可增加细胞、组织、整个动物和危重病人中的HSP70和其它HSPs。经由归因于HSP70表达(热休克因子-1 (HSF-1))的增强的转录因子激活的HSP70的增加，可保护细胞和实验动物避免多种多样的损伤和应激。最后，将这种安全的和无毒的氨基酸给予危重病人可增加这些患者血清中的 HSP-70。
[0196]谷氨酰胺保护细胞避免损伤和应激是通过增强的HSP70表达所介导的。最初的实验表明GLN保护细胞避免热和氧化剂应激，是由于增强的HSP70表达所致的。这在通过槲皮素(抑制HSF-1结合)阻断HSP70表达和通过HSP-70基因的直接反义抑制(图12)时已得到证明。
[0197]谷氨酰胺在实验动物中抑制内毒素引起的脓毒症并且增强多个组织中的HSP70和HSP25。另一项实验评估GLN能否在完整动物中诱导HSPs。GLN的在应激的和未应激的动物中的作用均得到评价。GLN可增加未应激大鼠心和肺组织中的HSP70和HSP25(图13)。
[0198]然后评价GLN对内毒素血症后的生存和HSP表达的影响。同时给予GLN与致死剂量的内毒素。GLN降低死亡率和提高致死量的内毒素血症后的HSP70和23(图14和15)。
[0199]促炎细胞因子释放的评价在内毒素血症后也被评估。GLN减弱内毒素血症后的TNF- a 和 IL-1 P (图 16)。
[0200]GLN提高经由HSP70的诱导的多微生物性脓毒症后的生存和增强的热休克因子-1 (HSF-1)的激活。由于致死性内毒素血症不是临床上有关的脓毒症模型，所以评估以GLN处理后对肺HSP70表达、HSF-1激活以及以临床相关模型中的多微生物性脓毒症和腹膜炎后生存的影响。选择大鼠的盲肠结扎加穿孔(CLP)作为适当的模型。如之前的数据已显示的，肺HSP的表达集中于HSP70的腺病毒转染为经受的同样的损伤动物的肺，可增强缺乏的HSP70的表达和双倍的生存。所述动物经受腹膜炎和脓毒症诱导以及于30分钟后以GLN处理。GLN处理明显地增强缺乏的肺HSP70的表达和HSF-1的激活。GLN还明显地增强血清HSP70表达。这个作用被给予槲皮素(HSP70表达的抑制剂)所阻断(在图中以Q表示)(图 17 和 18)。
[0201]GLN还可在组织中以近双倍的ATP/ADP比率和NAD+/NADH水平(图19和20)减弱脓毒症和腹膜炎后的组织代谢功能紊乱。该作用被HSP70抑制剂槲皮素所抑制(下面以Q表不)。
[0202]最后，GLN可显著改善腹膜炎和多微生物性脓毒症后的生存(图21)。此作用被给予槲皮素所抑制。数据表明GLN可抵御损伤后的腹膜炎、脓毒症和感染。
[0203]单剂量GLN增强局部缺血-再灌注损伤后的心肌组织代谢、提高谷胱甘肽含量和改善心肌功能。评估了 GLN对心肌缺血和再灌注损伤(I/R)(—种模拟心肌梗死样损伤的损伤)后的心脏功能的作用。为了评估GLN的作用，使用大鼠工作心脏模型，于15分钟的无血流的局部缺血前18小时给予单剂量的谷氨酰胺。GLN处理的动物显著地提高I/R后的心脏输出(图22)。已观察到心肌组织代谢参数的显著改善。结果包括增高的ATP/ADP比率、NAD+/NADH含量和降低的心肌组织乳酸盐积聚。还有，GLN提高I/R后的心肌谷胱甘肽含量(图23)。数据表明GLN可保护患者免受器官I/R损伤和/或心肌I/R损伤，诸如心肌梗死。
[0204]GLN改善实验性中暑损伤后的生存和增强HSP70表达。下一个要确定的是，口服给予GLN是否抵御致死性中暑的死亡率。对在这个大鼠模型中的GLN的对于HSP70表达的作用也进行了评价。在致死性中暑损伤之前口服五天的GLN显著降低死亡率(图24)和增强心、肺和结肠组织的HSP70表达。口服给予GLN可减少士兵和其它处于中暑风险的患者的发病率和死亡率。
[0205]GLN提高危重病人血清中的血清HSP70水平。下一个要确定的是，GLN能否提高危重病人中的HSP70。为了确定这个，将GLN或等氮物对照溶液经静脉给予在外科ICU病房中的混合组的危重病人。在这些患者中，与等氮物对照溶液相比，GLN导致血清HSP水平提高了四倍(图25)。检测前述的大鼠(CLP模型)多微生物性脓毒症/腹膜炎模型中的血清HSP70水平。发现血清HSP70水平增加了约四倍，其与双倍的生存有关。该数据特别重要，因为先前的在外伤患者中的研究显示在严重受伤的患者中提高的血清HSP70水平与增加的生存有相互关系。
[0206]还有，如在图26-29和表1_10中所示，在I周时，接受谷氨酰胺的患者的HSP-70水平比对照患者的高2.82单位(95%CI:-0.01至5.64，p =.050)。从基线到I周时的接受谷氨酰胺的患者的HSP-70水平的变化比对照患者的高2.60单位(95%C1:-0.09至5.29,p=? 057)。在I周时，接受谷氨酰胺的患者的HSP-70水平比对照患者的高3.71倍(95%CI:`1.15至11.85，p = ? 029)。换言之，接受谷氨酰胺的患者的I周内HSP-70水平的增加率比对照患者的高 3.40 倍(95%C1:1.50 至 7.70，p = ? 005)。
[0207]贯穿本申请，包括美国专利的多种出版物，通过作者和年份(专利通过编号)加以引用。下面列出对出版物的完全引用。为了更充分地描述适于本发明的领域的现状，这些出版物和专利的全部公开在此通过引用结合于本申请中。
[0208]本发明以说明性的方式描述，应该理解已经使用的术语意欲为其描述的单词本意而并非是一种限制。
[0209]明显地，根据上述可对本发明进行许多修正和变化。因此，应该理解在本发明描述范围内，本发明可以以在此具体描述之外的其它方式实施。
[0210]魁
[0211]所有诊断的谷氨酰胺和对照患者的基线特征。
[0212]
【权利要求】
1.二肽在制备药物中的用途，所述二肽选自丙氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-谷氨酰胺、亮氨酰-谷氨酰胺、缬氨酰-谷氨酰胺、异亮氨酰-谷氨酰胺和半胱氨酰-谷氨酰胺，所述药物用于治疗或预防急性或慢性病症、疾病或损伤，用于预防局部缺血或再灌注损伤，用于减轻炎症或在健康或疾病状态下减少促炎细胞因子表达，用于预防或治疗热应激、中暑或任何其它与温度有关的应激或损伤，用于改善组织代谢，和用于治疗脓毒症，其中所述病症、疾病或损伤是肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、自身免疫病症、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、狼疮、多发性硬化症、纤维肌痛症、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、心脏病发作、心脏手术、慢性心绞痛、冠心病、腹膜炎和系统性炎性反应综合征中的一种，所述药物被配制为单次静脉内推注剂型，所述推注剂型的剂量范围是0.1克/kg至2克/kg。
2.根据权利要求1的用途，其中所述推注剂型的剂量是0.52g/kg或0.75g/kg。
3.二肽在制备用于抑制皮肤或粘膜因化疗或放疗所致损伤的药物中的用途，所述二肽选自丙氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-谷氨酰胺、亮氨酰-谷氨酰胺、缬氨酰-谷氨酰胺、异亮氨酰-谷氨酰胺和半胱氨酰-谷氨酰胺，所述药物被配制为单次静脉内推注剂型，所述推注剂型的剂量范围是0.1克/kg至2克/kg。
4.根据权利 要求3的用途，其中所述推注剂型的剂量是0.52g/kg或0.75g/kg。
【文档编号】A61K38/07GK103623390SQ201310269425
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2004年8月16日 优先权日:2003年9月12日
【发明者】P.维施迈尔, K.辛莱顿 申请人:科罗拉多州大学评议会