猪轮状病毒δvp8亚单位重组嵌合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及猪轮状病毒ΔVP8亚单位重组嵌合蛋白及其应用，所述重组嵌合蛋白是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式（Gottfried-ΔVP8）和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式（OSU-ΔVP8）嵌合而成，且在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、Gottfried-ΔVP8和OSU-ΔVP8之间通过柔性Linker连接，有助于重组嵌合蛋白的正确折叠，提高可溶性蛋白产量。本发明提供的猪轮状病毒ΔVP8亚单位重组嵌合蛋白可诱导高滴度的抗类Gottfried型(G4P[6])或类OSU型(G5P[7]基因型特异的轮状病毒中和抗体，表明该重组嵌合蛋白具有优良的免疫原性，且该可溶性重组嵌合蛋白的产量高（实验室常规制备可达20mg/L以上），适合于工业化生产以及大批量新型猪轮状病毒疫苗的制备。
【专利说明】猪轮状病毒ΔνΡ8亚单位重组嵌合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和基因工程领，具体地说，涉及猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]轮状病毒性胃肠炎也称轮状病毒性腹泻，是全世界范围内婴幼儿及多种幼龄动物腹泻的最主要的急性肠道传染病，以腹泻和脱水为特征，死亡率高，给人类健康和畜牧业发展造成巨大危害。
[0003]仔猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒(Procine Rotavirus，PRV)引起的一种以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征的急性传染病，多发生于寒冷季节即晚秋、冬季和早春，各种年龄的猪皆可感染，感染率最高可达90%~100%。并且本病易继发细菌性感染，令仔猪死亡率升高，从而造成严重的经济损失。1975年Woode和Bridge在英国首次报道PRV，随后PRV在猪群中的传播引起了许多国家的重视，美国、法国、澳大利亚、北爱尔兰等均有RV引起仔猪腹泻的相关报道。数据显示，美国断奶仔猪感染阳性率为80%，病死率为15%;当有混合感染时，病死率更高。英国报道I~4周龄仔猪的发病率超过80%，病死率10%~30%，发病猪体重急剧下降10%~20%，需半个月甚至更长时间才能回复到正常生长速度，由此可见仔猪轮状病毒腹泻可给养猪业带来巨大的经济损失。RV在猪群中普遍存在，波兰人Markowska-Daniel等在11个大型猪场里，从2~10周龄的腹泻仔猪群中(断乳前发病率为8%~15%)采集了 1230份血清和531份粪样，进行RV抗体检测及病毒分离，ELISA检测结果显示有1214份血清为RV抗体阳性，169个粪样为抗原阳性；Barman等对采自印度Assam地区的528份猪血清样品进行了间接ELISA检测，其中RV阳性率占51.1%，明显高于TGEV (猪传染性胃肠炎病毒，39.4%)和PEDV (猪流行性腹泻病毒，21.2%)。加拿大人Dewey等研究了猪A群轮状病毒感染比率与饲养规模管理之间的关系，发现饲养规模大且断奶较早的仔猪群易感染A群RV ;集约化生产模式下饲养的仔猪A群RV阳性感染率比持续流动设施条件下大约高3.4倍。
[0004]我国在1982年首次从腹泻猪粪便中分离到轮状病毒。1990年王玉春等对国内19个省共计121个猪场做血清学调查，未发现RV阴性猪群。1999年李国平等在调查中发现I~10日龄仔猪RV阳性率在42.4%~66%之间，10日龄到断奶仔猪RV阳性率则高达83.2%~91.7%，断奶后仔猪RV阳性率为63.2%~72%。程健频等在2002年10月对甘肃省庄浪县7个乡镇90户饲养的2100头仔猪进行了初步调查，感染RV并发病的仔猪有1460头，发病率达69.5%，其中因环境温度下降，继发大肠埃希菌病死亡690头，死亡率47.8%。2003年冬季至2004年春季，在上海的一些规模化猪场中，生产母猪虽然已按程序进行了猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联苗免疫，但其产下的仔猪仍发生病毒性腹泻，经诊断为猪RV感染，造成了巨大的经济损失。2011年12月16至17日，湖南省平江县三阳乡的四个中等规模猪场的仔猪相继发生一种以厌食、呕吐、腹泻为主要症状的疾病，经诊断亦为RV感染，发病率为100%，因采取措施及时得当，死亡率为10.3%。目前，我国规模化、集约化养猪已占相当大的比重，2012年生猪存栏47492万头，而大部分猪群都未进行RV免疫接种，处于免疫空白状态，造成易感猪群广泛存在，为轮状病毒感染留下了极大隐患。
[0005]PRV经粪-口途径在猪群中传播，病猪、隐性感染猪以及带毒猪是主要的传染源，病毒粒子主要存在于它们的消化道中，随粪便排到体外，污染饲料、饮水、垫草及土壤等，经消化道途径使易感猪感染。排毒时间可持续数天，加之病毒对外界环境抵抗力较强，使轮状病毒在成年猪、中猪、仔猪之间反复循环感染，长期扎根猪场。另外，人和其他动物也可散播传染。在流行地区，由于大多数成年猪呈隐性感染而获得对病毒的免疫力，因此，发病猪多是8周龄以下的仔猪，日龄越小的仔猪，发病率越高，I~4周龄仔猪发病率超过80%。该病主要表现为腹泻症状，发病仔猪粪便为水样或糊状，严重者带有粘液和血液。若继发或并发其他细菌性或病毒性疾病，极易导致高死亡率。中猪和大猪呈隐性感染，无临床症状。
[0006]RV主要入侵小肠绒毛上皮细胞，其次是盲肠和结肠上皮细胞。幼畜感染RV后，很快便会发生胃壁迟缓，小肠绒毛萎缩、上皮细胞脱落，肠道分泌和吸收功能失调，致使肠内容物渗透压增高，正常的离子和水分即向肠腔分泌，最终导致渗透性腹泻。眼观病变主要局限于消化道，小肠黏膜呈条状或弥散性出血，肠壁变薄且肠粘膜易脱落。
[0007]目前我国较大规模临床应用的包括福建省生物药品厂与中国农业大学联合开发的TGEV-PEDV-RV三联弱毒苗，以及中国农科院哈尔滨兽医研究所研制的RV-TGEV 二联弱毒苗等。弱毒疫苗虽然克服了灭活疫苗固有的一些缺陷，但由于致弱毒株毒力不稳定，存在着病毒污染、毒力返强、疫苗株与流行株共存可能产生强毒株，疫苗基因重配后可能扩大感染宿主等不安全因素，给养猪业的安全生产带来了极高风险。我国猪群的RV阳性率非常高，至今还没有治疗猪轮状病毒腹泻的特效药物，疫苗接种是预防该病的主要措施。国内猪RV疫苗的研究一直是薄弱环节，而现有疫苗对于控制该病的发生和流行并不十分理想，因此开发廉价、安全、有效的轮状病毒新型疫苗是具有十分重要的意义。
[0008]轮状病毒(Rotavirus, RV)为呼肠弧病毒属(Reoviridae)成员，病毒基因组由11节段dsRNA组成，编码6个结构蛋白(VPl~4，VP6~7)和6个非结构蛋白(NSP1~6)。成熟的病毒粒子为三层衣壳结构，最外层由纤突蛋白VP4 (经蛋白酶裂解形成VP8和VP5)和糖蛋白VP7组成。VP7与病毒在富含蛋白酶的成熟的小肠上皮细胞中复制直接相关。VP4蛋白不仅涉及RV的粘附、侵入，而且与RV血凝性、中和活性、毒力以及蛋白酶裂解后感染性增强等理化特性相关。VP7和VP4都可独立的诱导病毒中和抗体，抗VP7和VP4的抗体都可阻止病毒的侵入。因此，VP7和VP4成为疫苗开发的首选目标分子。
[0009]轮状病毒基因型别组合众多，不同基因型间的交叉免疫甚少，这给疫苗研制带来了困难。然而，研究发现一个P基因型可能覆盖数个G基因型，即某个P型可以与不同的G型组合，理论上同一 P型可以诱导抗不同G型的异型免疫。而决定P型的VP4蛋白含有多个线性化抗原表位，且该蛋白无需翻译后修饰，其经胰酶裂解后形成的VP8片段，包含了 VP4型特异性主要抗原表位，皆为线性且较为保守，可以利用VP8蛋白来开发新型的PRV亚单位疫苗。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白及其应用。
[0011]为了实现本发明目的，本发明的一种猪轮状病毒Λ VP8亚单位重组嵌合蛋白，其是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式(以Gottfried- Λ VP8表示)和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式(以OSU- Δ VP8表示)嵌合而成的重组蛋白，且在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、Gottfried- Δ VP8和OSU- Δ VP8之间通过柔性Linker连接，有助于重组嵌合蛋白的正确折叠，提高可溶性蛋白产量。
[0012]其中，所述破伤风毒素T细胞表位多肽P2、猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式以及所述猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式的氨基酸序列分别如SEQ ID N0.7-9所示。破伤风毒素T细胞表位多肽P2和Gottfried-Λ VP8之间用柔性Linker “GGGGS”连接，形成的 P2-Gottfried_ Λ VP8 与 OSU-Λ VP8 之间用柔性 Linker “GS”连接。
[0013]具体地，本发明的一种猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0014]本发明还提供编码上述重组嵌合蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0015]本发明还提供含有上述基因的表达载体及宿主细胞。
[0016]本发明还提供制备上述重组嵌合蛋白的方法，将含有编码所述猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白的基因的表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达获得重组嵌合蛋白。
[0017]根据可溶性蛋白表达的需要，向所述LB液体培养基中额外添加0.02g/mL葡萄糖和I~5% (v/v)乙醇。
[0018]优选地，将阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养至0D_约0.5，加入IPTG至终浓度为ImM，在16°C下诱导表达重组嵌合蛋白。
[0019]本发明进一步提供所述猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白在制备猪轮状病毒疫苗或药物中的应用。
[0020]本发明提供的猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白可诱导高滴度的抗类Gottfried型(G4P[6])或类OSU型(G5P[7]基因型特异的轮状病毒中和抗体，表明该重组嵌合蛋白具有优良的免疫原性，且该可溶性重组嵌合蛋白的产量高(实验室常规制备可达20mg/L以上)，适合于工业化生产以及大批量新型猪轮状病毒疫苗的制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为本发明实施例1中P2-Gottfried_ Δ VP8PCR电泳图；其中，I为MarkerDL2000，2 为 P2-Gottfried-AVP8。
[0022]图2为本发明实施例1中0SU-AVP8PCR电泳图；其中，I为Marker，2为OSU-ΛVP8。
[0023]图3为本发明实施例1中pET28a-P2-Gottfried_AVP8重组质粒酶切鉴定电泳图；其中，M 为 Marker DL7000，1、2、3、4 均为 pET28a-P2_Gottfried-Λ VP8 质粒单酶切，经鉴定2、3号样品为含有P2-Gottfried-AVP8的重组质粒。
[0024]图4为本发明实施例1中pET28a-P2_Gottfried- Δ VP8-0SU- Δ VP8重组质粒酶切鉴定电泳图；其中，I 为 Marker DL7000，2 为 pET28a-P2_Gottfried-Λ VP8-0SU-Λ VP8 重组质粒双酶切。
[0025]图5 为本发明实施例 2 中重组 P2-Gottfried_ Δ VP8-0SU- Λ VP8 蛋白 SDS-PAGE电泳检测图；其中，M为蛋白质分子质量标准(Fermentas, unstained protein Molecularweight Marker,#SM0431 )1为诱导前全菌体；2为诱导后菌体裂解液上清(37°C诱导2.5h)；3为诱导后菌体裂解液沉淀(37°C诱导2.5h) ；4为诱导后菌体裂解液上清(16°C诱导16h)；5为诱导后菌体裂解液沉淀(16°C诱导16h) ；6为空载体诱导后全菌体(37°C诱导2.5h)。
[0026]图6为本发明实施例3中P2-Gottfried-AVP8-0SU_AVP8重组嵌合蛋白的Western blot检测图；其中，M为蛋白质分子质量标准(Crystalgen, ProteinIadderl0-170KD)；1为诱导前全菌体；2为诱导后菌体裂解液上清(37°C诱导2.5h)；3为诱导后菌体裂解液沉淀(37°C诱导2.5h) ；4为空载体诱导后全菌体(37°C诱导2.5h)。
【具体实施方式】
[0027]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0028]以下实施例中使用的猪轮状病毒OSU株、Gottfried株VP8基因来自于重组质粒 pCR4-0SU-VP4 (GenBank 登录号:X13190)和 pCR4-Gottfried_VP4 (GenBank 登录号:M33516)，本领域技术人员可以根据参考序列通过基因合成的方法获得相应基因；原核表达载体pET-28a及工程菌E.coli BL21 (DE3)购自Novagen公司；所用引物为自行设计并委托苏州金维智生物科技有限公司合成。
[0029]实施例1含有目的片段的表达载体的构建
[0030]本实施例中使用猪轮状病毒的经典毒株OSU株和Gottfried株(从各大洲仔猪分离到的猪轮状病毒毒株大多数属于这两种P基因型之一，即类Gottfried型(G4P[6])或类OSU型(G5P[7]))，其中所用的引物是根据猪轮状病毒Gottfried株VP4的基因序列(GenBank登录号:M33516)或OSU株VP4的基因序列(GenBank登录号:X13190)而设计的，其中在Gottfried-Λ VP8两端分别引入Nde I和BamH I酶切位点，并在其上游引入破伤风毒素T细胞表位Ρ2序列，Ρ2序列与Gottfried-Λ VP8之间引入“GGGGS”柔性Linker。在OSU- Δ VP8上游引物中引入BamH I酶切位点，在P2-Gottfried_ Δ VP8和OSU- Δ VP8重组蛋白之间引入另一柔性Linker “GS”，在OSU-Λ VP8下游引物中引入Hind III酶切位点。
[0031]扩增P2-Gottfried-AVP8 (即在Gottfried-Λ VP8的5’端连有编码破伤风毒素T细胞表位多肽Ρ2的核苷酸序列)、OSU-AVPS的引物序列如下:
[0032]P2-Gottfried-AVP8-UP 5’ -AATTCCATATGCAGTACATCAAAGCAAATTCTAAGTTTATTGGTATCACGGAGCTCGGAGGTGGCGGATCTGTACTTGACGGTCCATATCAGCC-3’ (Nde I)
[0033]P2-Gottfried-Δ VP8-L0W 5’-CGGGATCCTAAC CCAGTATTAATATACTCATTGC-3’(BamH I)
[0034]OSU-ΔVP8-UP 5’-CGGGATCCTTATTAGATGGCCCATACCAACCAA-3’ (BamH I)
[0035]OSU-ΔVP8-L0W 5’-ATAGAAAGCTTTCCATGATTGATATACTCAGTAC-3’ (Hind III)
[0036]反应参数设置如下:
[0037]以重组质粒pCR4-Gottfried_VP4 或 pCR4-0SU_VP4 为模板(根据 GenBank 公布的Gottfried-VP4和0SU-VP4基因序列，通过人工合成的方法获得Gottfried_VP4和0SU-VP4基因片段，并分别插入到克隆载体pCR4 (Invitrogen公司)中，即构建得到重组质粒 pCR4-Gottfried-VP4 和 pCR4-0SU_VP4),通过 pfu 高保真 DNA 聚合酶扩增 GottfriedP[6]特异性P2-AVP8融合片段或OSU P[7]特异性ΛVP8片段。扩增参数见表1。P2-Gottfried-AVP8PCR扩增结果见图1，OSU-Λ VP8片段的PCR扩增结果见图2。通过Qiagen快速胶回收试剂盒回收各PCR产物。
[0038]将回收的P2-Gottfried_AVP8片段和0SU-AVP8片段通过限制性内切酶依次定向克隆到含6 XHis-tag标签(用于重组蛋白的亲和柱层析)的pET28a载体中，从而获得pET28a-P2-Gottfried- Δ VP8-0SU- Δ VP8 重组质粒。pET28a-P2-Gottfried- Δ VP8 重组质粒的单酶切鉴定结果见图3，所述重组质粒的双酶切鉴定结果见图4。对所构建的质粒进行DNA测序，鉴定所构建质粒的完整性和正确性。
[0039]具体如下:
[0040](1) PCR 扩增 P2-Gottfried_ Δ VP8 片段[0041 ] PCR反应体系(表1)及反应条件如下:
[0042]表1PCR 反应体系(25 μ L)
[0043]
【权利要求】
1.猪轮状病毒AVP8亚单位重组嵌合蛋白，其特征在于，其是由破伤风毒素T细胞表位多肽P2以及猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式嵌合而成的重组蛋白，且在破伤风毒素T细胞表位多肽P2、猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式和猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式之间通过柔性Linker连接； 其中，所述破伤风毒素T细胞表位多肽P2、猪轮状病毒Gottfried株VP8亚单位的截短形式以及所述猪轮状病毒OSU株VP8亚单位的截短形式的氨基酸序列分别如SEQ IDN0.7-9 所示。
2.根据权利要求1所述的重组嵌合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述重组嵌合蛋白的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
6.含有权利要求3或4所述基因的宿主细胞。
7.制备权利要求1或2所述重组嵌合蛋白的方法，其特征在于，将权利要求5所述的表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养，加入IPTG诱导表达获得重组嵌合蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基中还添加0.02g/mL葡萄糖和I~5v/v%乙醇。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将阳性克隆并接种于LB液体培养基中培养至OD6tltl约0.5，加入IPTG至终浓度为ImM，在16°C下诱导表达重组嵌合蛋白。
10.权利要求1或2所述的重组嵌合蛋白在制备猪轮状病毒疫苗中的应用。
【文档编号】A61K39/15GK104072617SQ201310289361
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】闻晓波, 张艳, 冉旭华, 魏晓曼, 崔玉东, 朱战波, 张春山 申请人:黑龙江八一农垦大学