火木层孔菌中甲基苯二酚在抗禽流感h5n1病毒上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种从火木层孔菌Phellinus?igniarius?(Lex?Fr)Quel（裂蹄木层孔菌phellinus?linteus(Berket?Curt)Teng、鲍氏层孔菌Phellinus?baumii、哈蒂针层孔菌Phellinus?hartigii(Alleschet?Schnabl)Imaz）发酵液和子实体中分离的具有抗禽流感活性的甲基苯二酚。本发明首次公开了甲基苯二酚的一种新活性，证明其具有抗禽流感病毒H5N1作用。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了这种甲基苯二酚的新活性，证明其具有抗禽流感病毒的作用，为禽类生产中，禽流感的治疗增添了一种新药物。
【专利说明】火木层孔菌中甲基苯二酚在抗禽流感H5N1病毒上的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗禽流感H5N1病毒的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及的火木层孔菌菌种，已于2013年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC N0.8108，分类名称为火木层孔菌Phellinusigniarius，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
【背景技术】
[0002]苯二酚能与蒸汽一起挥发，是强还原剂，遇明火能燃烧，受高热散发出有毒、有腐蚀性气味，能经皮肤引起中毒，能升华，对中枢神经、呼吸系统有刺激作用，大鼠经口 LD50为3890mg/kg,与间苯二酹及对苯二酹不同。
[0003]目前，抗禽流感病毒的药物种类主要集中于单克隆抗体，种类单一，有一定的局限性。
【发明内容】
[0004]本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的甲基苯二酚。本方法较一般化合物应用的优点在于:发现了该种甲基苯二酚的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。为抗球流感病毒提供了新的思路与方向。
[0005]本发明的技术方案如下:
首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:`
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.1vvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物；
(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ；
(4)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；
(5)对步骤(4)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0006]然后从火木层孔菌粗提物中甲基苯二酚，步骤如下:火木层孔菌粗提物一正相硅胶层析一氯仿与甲醇梯度洗脱一TLC检测一正相硅胶层析一甲醇凝胶层析一TLC检测一正相硅胶层析一TLC检测一减压蒸干一为3-甲基-1，2-苯二酚。
[0007]具体方法为:
(1)制备火木层孔菌粗提物；
(2)将步骤(1)所得的乙醇沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液；
(3)将步骤(2)中最后一次洗脱液减压蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；
(4)收集步骤(3)得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(5)用步骤4得到的产物再次进行正相硅胶层析，洗脱剂为氯仿与甲醇；
(6)TLC检测，适度合并洗脱液，加压干燥，即为甲基苯二酚。
[0008]优选的，提取步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇；
提取步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为石油醚:丙酮=20:1-40:1 ; 提取步骤(4)中所述的凝胶为S^hadex LH-20，洗脱剂为甲醇；
提取步骤(5)所述的洗脱剂为氯仿:甲醇=100:1-150:1 ;
提取步骤(6)所述的TLC检测，展开剂为氯仿:甲醇=25:1-40:1。
[0009]实例1:
火木层孔菌粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸镁 0.1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。
[0010](3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热1小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
[0011]将上述粗提物称取100g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高0.8m，直径10cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿:甲醇=100:1，分别洗脱3，4个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2。将Fr_2等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200— 300目正相硅胶。洗脱剂为石油醚:丙酮=20:1。减压浓缩洗脱液，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析。使用TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压蒸干，再次进行正相硅胶层析，洗脱剂为氯仿与甲醇，对洗脱液进行TLC检测，适当合并，加压干燥，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ 6.71 (s, 1H)，2.26 (s, 1H).证明是为3-甲基-1，2-苯二酚。
[0012](7)采用步骤(6)得到的麦角甾酮进行对MDCK细胞毒性的测定，确定其半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。
[0013]在96孔板上，100 μ I/孔加入4X IO5Iiir1浓度的MDCK细胞悬液，培养24 h后，在单层细胞上分别加入不同浓度的含样维持液，每种浓度重复3孔，并设正常细胞对照。置370C，5%C02培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的维持液，继续培养Ih后，弃MTT上清，每孔加溶解液(DMSO) 100 μ 1，振荡5_10 min，待结晶完全溶解，酶标仪测492nm处的OD值。计算出样品的半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。当加样组的OD492值不显著低于细胞对照组OD492时，此浓度即为样品的最大安全浓度。
[0014]表1 3-甲基-1，2-苯二酚各浓度对细胞生长的影响
【权利要求】
1.甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用。
2.如权利要求1所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于甲基苯二酚是从火木层孔菌中提取的，提取步骤顺序如下: (1)制备火木层孔菌粗提物； (2)将步骤(1)所得的乙醇沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液； (3)将步骤(2)中最后一次洗脱液减压蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (4)收集步骤(3)得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (5)用步骤4得到的产物再次进行正相硅胶层析，洗脱剂为氯仿与甲醇； (6)TLC检测，适度合并洗脱液，加压干燥，即为甲基苯二酚。
3.如权利要求2所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述火木层孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种 子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.lvvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可得到火木层孔菌菌丝体发酵全液； (2)取步骤(1)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ； (3)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(2)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90% ； (4)对步骤(3)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ； (5)将将步骤(4)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。
4.如权利要求3所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述液体培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%。
5.如权利要求3所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于火木层孔菌粗提物制备步骤(3)的乙醇为浓度65%-95%食用乙醇，所用体积为3-6倍体积。
6.如权利要求2所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤⑵中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇。
7.如权利要求2所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为石油醚:丙酮=20:1-40:1。
8.如权利要求2所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(4)中所述的凝胶为S^hadex LH-20，洗脱剂为甲醇。
9.如权利要求2所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(5)所述的洗脱剂为氯仿:甲醇=100:1-150:1。
10.如权利要求2所述的甲基苯二酚在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(6 )所述的TLC检测，展开剂为氯仿:甲醇=25:1-40:1。
【文档编号】A61P31/16GK103816137SQ201310401654
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】赵晨, 宋爱荣, 孔超, 黄芳, 梁大勇 申请人:青岛农业大学