灰树花258菌株粗多糖在抗禽流感h5n1病毒上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开灰树花258菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用，其方法包括灰树花发酵全液分离菌丝体或固体发酵后的菌丝体经过乙醇提取、过滤、减压浓缩、除色素、除小分子化合物、除脂肪、醇析、离心分离、收集物干燥、收集物粉碎等步骤。本发明的方法提取的灰树花发酵菌丝体粗多糖对禽流感病毒具有明显的抑制作用，该方法具有工艺简便、成本低、效果好的特点。
【专利说明】灰树花258菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及灰树花258菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用，尤其涉及灰树花258菌株，已于2013年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC N0.8114，分类名称为灰树花Grifola frondosa，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
【背景技术】
[0002]关于灰树花258菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用，经检索到的相关专利有:中国专利申请号为99112556.8灰树花发酵液多糖提取方法，02136517.2灰树花发酵工艺及其多糖肽的生产方法，89105471 —种云芝糖肽(PSP)的生产方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工艺，96109095中国灵芝保健饮料，92111030灵芝营养保健液及其制法，93103116灵芝口服液等专利，这些专利内容大多以提取多糖为主要目的，灰树花、云芝和灵芝三种制备的活性物质提取物具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等药效，但对于抗病毒作用鲜有报道，而对于抗禽流感H5N1病毒的报道更是没有检索到。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的问题是，针对上述灰树花菌株以及其制备的粗多糖的药理作用所存在的不足，提供灰树花258菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用。利用本发明的方法提取的灰树花258菌株粗多 糖对禽流感H5N1病毒具有抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用。
[0004]所述的灰树花258菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的应用，其特征是，所述灰树花258菌株粗多糖由下述方法制得:
(1)加热提取:取经液体发酵或固体发酵的灰树花258发酵全液或菌丝体或澄清液放于容器内，加入纯净水调整其pH值为8~12，置60~120°C下加热100~240分钟，
(2)过滤:之后冷却、以180~200目的筛网过滤灰树花菌丝体，收集滤液,滤渣以其4~8倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作I~2遍，再收集滤液；
(3)减压浓缩:合并收集的滤液，在温度50~70°C，压力0.2~0.6Kg/cm2，真空度为
0.02~0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10~1/20 ；
(4)除色素:取浓缩后的提取液，用氨水调pH至6.0~8.0，于30~45°C下搅拌，按每IOml滴加Iml~2ml 10 %~30%的H2O2，进行脱色10~24h，得到淡黄色液体，
(5)除小分子化合物:然后利用透析袋，截留分子量3000~5000以上，4°C~10°C条件下透析24h~48h,去除多余的H2O2、小分子化合物。
[0005](6)除脂肪:取上述提取液，装入索氏提取器，按1:0.5~I的比例加入石油醚，加热回流提取2~6h，待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液。
[0006](7)醇析:在回收的提取液中，加入量为其体积4~8倍的95%乙醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为30~60r/min，10~20分钟后，静置24~48小时进行醇析；
(8)离心分离:醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为3000~5000r/min离心20~30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；
(9)收集物干燥:将上述收集的离心沉淀物，在50~70°C温度条件下干燥36~48小
时；
(10)收集物粉碎:取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后即为灰树花粗多糖。
[0007]其中，所述的灰树花258发酵全液是指灰树花258菌株发酵液与菌丝体的集合体。
[0008]步骤[I j所述的灰树花258菌丝体是指灰树花258菌株液体发酵和固体发酵所得的菌丝体
所述灰树花258菌株通过以下步骤进行发酵:
(O液体种子培养:采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基，将10%的灰树花菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，调节PH为3-8，培养温度为20-35°C，摇瓶转速为80-280r/min，培养7_15天，即可得到灰树花液体种子；
(2)发酵罐发酵:先将发酵罐中的培养基进行灭菌，灭菌压力为0.1~0.2公斤/平方厘米，灭菌时间为1-2小时；当灰树花液体种子pH值降至2.5-4时，将摇瓶中的灰树花种子接种到发酵罐的培养液中，调整pH为5-8，培养温度25-35°C，通气量0.5-1.lvvm，搅拌转速100-250r/min,培养 7-30 天。
[0009]所述液体种子培养基或发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉I~3%蔗糖I~5%
蛋白胨0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5%
硫酸镁0.1~0.3%磷酸二氢钾 0.05~0.1%
(3)固体发酵
所述固体培养基配方以百分含量计是:
玉米芯63~83%，麸皮15~35%，葡萄糖1%，碳酸钙1%
所述固体培养基制备方法:将灰树花251菌株液体菌种接种至事先制备的固体培养基的菌包中，其含水量约为65%，12X30 cm、15X 30 cm或17X 30cm菌袋，每袋重150 g~1050 g，pH自然，培养温度25°C~27°C、空气相对湿度50%~70%、黑暗培养100 d~160d，定期检察并移除污染菌包，待菌包表面全部呈桔红色后，开包取出菌丝体，粉碎后进行提取。
[0010]所述固体培养基还可以为谷物培养基，其配方是:(I)小麦98%，碳酸钙1%，石灰1% ; (2)谷子98%，碳酸钙1%，石灰1% ; (3)玉米98%，碳酸钙1%，石灰1% ； (4)大麦98%，碳酸钙1%，石灰1%。
[0011]所述谷物培养基的制备方法:先将谷物加水浸泡12小时，加入石灰1%，煮沸后捞出，浙干表面水分，拌入1%碳酸钙后，装瓶，封口，然后植入高压锅中进行高压灭菌。121°c下保持2h，温度降到30°C后，取出，冷却后将灰树花液体菌种接种至固体培养基的中，培养温度25°C~27°C、空气相对湿度50%~70%、黑暗培养160 d，检察并移除污染，待菌瓶表面全部长满白色菌丝，取出菌丝体，进行提取。
`[0012]采用本发明的抗禽流感病毒的灰树花258菌株粗多糖，具有工艺简便、成本低、产量高的特点。该方法采用灰树花发酵菌丝体进行多糖提取，大大解决了灰树花258菌株子实体匮乏，原料奇缺，子实体重金属含量高的困境；解决了灰树花258菌株子实体人工培养难度大、时间长的技术问题；降低了活性物质提取的原料成本和生产成本，提高了菌丝体的产量，提高了活性物质产率。
[0013]采用本发明的方法提取的灰树花258菌株粗多糖，经青岛农业大学药用真菌研究所在中国动物卫生与流行病学中心外来病研究中心所作的体外抗禽流感病毒药物筛选试验，灰树花258菌株粗多糖对禽流感H5N1病毒具有抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用。
[0014]体外抗禽流感病毒药物筛选试验的具体方法如下:
I、实验材料
1、细胞:MDCK细胞
2、病毒:禽流感病毒毒株为H5N1型
3、培养液:含10%胎牛血清的DMEM培养液
II、实验条件 生物安全三级实验室
III、实验步骤
1、采用CPE法结合MTT法对MDCK细胞进行毒性的测定:在96孔板上，100 μ I/孔加A4X105ml-l浓度的MDCK细胞悬液，培养24 h后，在单层细胞上分别加入不同浓度的含样维持液，每种浓度重复3孔，并设正常细胞对照。置37°C，5% CO2培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，100 μ I/孔加入5 mg.ml-lMTT的维持液，继续培养Ih后，弃MTT上清液，每孔加DMSO溶解液100 μ 1，振荡5-10 min,待结晶完全溶解，酶标仪测492nm处的OD值。当加样组的OD492值不显著低于细胞对照组OD492时，此浓度即为样品的最大安全浓度。计算出样品的半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度。
[0015]2、粗多糖对H5N1禽流感病毒的药效测定:采用所得到的最大安全浓度范围内对样品在MDCK细胞水平上进行对H5N1毒株的攻毒实验。试验中，设置正常细胞对照组，病毒对照组，质量浓度在无毒范围内2倍稀释4个质量浓度，设置3孔重复。弃96孔细胞培养板孔内上清，100 μ I/孔加入10000TCID50病毒液(10-4.43)，设置3个重复。37°C吸附2 h，弃病毒液上清，100 μ I/孔加入不同浓度的样液。置37°C，5% C02培养箱中继续培养48h。采用MTT法测定0D492值，用统计学软件SPSSl1.5的Probit回归法，计算样品的半数毒性浓度(CC50)和半数有效浓度(EC50)，得到样品的选择指数(SI)=CC50 / EC50，计算病毒抑制率。
[0016]根据下公式计算病毒抑制率:
病毒抑制率=(A-B) / (C-B) X 100%
A:样液处理组OD值，B:病毒对照组OD值，C:细胞对照组OD值
IV、实验结果
1、病毒的 TCID5。为 10_4。
[0017]2、取灰树花258菌株粗多糖5个浓度即100、50、25、12.5,6.25mg / ml进行细胞毒性测定，每浓度做10个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为32mg / ml。
[0018]3、取32、16、8、4mg / ml药液，做10个复孔，观察对禽流感病毒的抑制作用。试验设病毒对照和细胞对照。结果显示，灰树花258菌株粗多糖4个不同浓度药物对禽流感病毒具有很好的抑制作用。
[0019]结果显示:灰树花258菌株粗多糖在4mg/ml浓度下对H5N1毒株可达到最高的抑制率为 24.8%，此时 CC50 为 51.282mg/ml, SI 为 0.51
下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
[0020](四)【具体实施方式】 实施例1:
灰树花258菌株粗多糖由下述方法制得:
1.发酵培养基配方:
玉米淀粉1~3%葡萄糖I~5%
蛋白胨0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5%
硫酸镁0.1~0.3%磷酸二氢钾 0.05~0.1%
2.发酵罐发酵:
将灰树花258菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用发酵全液制备灰树花258菌株粗多糖。
[0021]3.菌丝体粗多糖的提取:
取发酵全液10L，进行过滤，得到灰树花258菌丝体100克，放于3000ml容器内，加入2000ml纯净水，调整其pH值为8，置100°C下加热60min (时间不在权利要求范围之内)，之后冷却、以200目的筛网过滤，收集滤液，滤渣以其8倍体积的纯净水稀释，重复上述操作I遍，再收集滤液；合并收集的滤液，在50°C,压力0.6Kg/cm2,真空度为0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10 ；
取浓缩后的提取液，用氨水调pH至8.0，于30°C下搅拌，按每IOml滴加Iml 10 %的H202，进行脱色24h，得到淡黄色液体，然后利用透析袋，截留分子量5000以上，10°C条件下透析24h，去除多余的H202、小分子化合物。取上述提取液，装入索氏提取器，加入200ml石油醚加热回流提取2h，待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液。在回收的提取液中，加入量为其体积4倍的95%乙醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，20分钟后，静置24小时进行醇析；醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000r/min离心20min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；在501:温度条件下干燥48小时后，进行粉碎，经200目筛网过筛后即为灰树花粗多糖。
[0022]采用上述的灰树花258菌株粗多糖，对MDCK细胞进行毒性的测定:
在96孔板上，100μ I/孔加入4X105ml-l浓度的MDCK细胞悬液，培养24 h后，在单层细胞上分别加入不同浓度的含样维持液，每种浓度重复3孔，并设正常细胞对照。置37°C，5%C02培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，100 μ I/孔加入5 mg.ml-lMTT的维持液，继续培养Ih后，弃MTT上清，每孔加溶解液(DMSO)IOOy 1，振荡5_10 min，待结晶完全溶解，酶标仪测492nm处的OD值。计算出样品的半数中毒浓度CC50为51.282mg/ml，最大安全浓度 EC50 为 32mg/ml。
[0023]采用所得到的最大安全浓度范围内对样品在MDCK细胞水平上进行对H5N1毒株的攻毒实验。试验中，设置正常细胞对照组，病毒对照组，质量浓度在无毒范围内2倍稀释4个质量浓度，设置3孔重复。弃96孔细胞培养板孔内上清，100 μ I/孔加入10000TCID50病毒液(10-4.43)，设置3个重复。37°C吸附2 h，弃病毒液上清，100 μ I/孔加入不同浓度的样液。置37°C，5% C02培养箱中继续培养48h。采用MTT法测定OD492值，用统计学软件SPSS11.5的Probit回归法，计算样品的半数毒性浓度(CC50)和半数有效浓度(EC50)，得到样品的选择指数(SI)=CC50 / EC50，计算病毒抑制率。
[0024]结果显示:灰树花258菌株粗多糖在8mg/ml浓度下对H5N1毒株可达到最高的抑制率为 21.4%，此时 CC50 为 51.282mg/ml, SI 为 0.51
实施例2:
灰树花258菌株粗多糖由下述方法制得:
谷物培养基一玉米培养基的制备方法:
先将玉米加水浸泡12小时，加入石灰1%，煮沸后捞出，浙干表面水分，拌入1%碳酸钙后，装瓶，封口，然后置入高压锅中进行高压灭菌。121°C下保持2h，温度降到30°C后，取出，冷却后将灰树花液体菌种接种至玉米培养基中，培养温度25°C、空气相对湿度50%、黑暗培养160 d，检察并移除污染，待菌瓶表面全部长满白色菌丝，取出菌丝体，进行提取。
[0025]取灰树花258菌丝体100克，放于3000ml容器内，加入2000ml纯净水，调整其pH值为8，置100°C下加热60min，之后冷却、以200目的筛网过滤，收集滤液，滤渣以其10倍体积的纯净水稀释，重复上述操作I遍，再收集滤液；合并收集的滤液，在50°C，压力0.6Kg/cm2，真空度为0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10 ；
取浓缩后的提取液，用氨水调pH至8.0，于30°C下搅拌，按每IOml滴加Iml 10 %的H2O2，进行脱色24h，得到淡黄色液体，然后利用透析袋，截留分子量5000以上，10°C条件下透析24h，去除多余的H2O2、小分子化`合物。取上述提取液，装入索氏提取器，加入200ml石油醚加热回流提取2h，待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液。在回收的提取液中，加入量为其体积4倍的95%乙醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，20分钟后，静置24小时进行醇析；
醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000r/min离心20min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；在501:温度条件下干燥48小时后，进行粉碎，经200目筛网过筛后即为灰树花粗多糖。
[0026]采用上述的灰树花258菌株粗多糖对MDCK细胞进行毒性的测定，在96孔板上，?οομ I/孔加入4X105ml-l浓度的MDCK细胞悬液，培养24 h后，在单层细胞上分别加入不同浓度的含样维持液，每种浓度重复3孔，并设正常细胞对照。置37°C，5% C02培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，100 μ I/孔加入5 mg.ml-lMTT的维持液，继续培养Ih后，弃MTT上清，每孔加DMSO液100 μ 1，振荡5_10 min,待结晶完全溶解，酶标仪测492nm处的OD值。计算出样品的半数中毒浓度CC50为51.282mg/ml，最大安全浓度EC50为32mg/ml。
[0027]采用所得到的最大安全浓度范围内对样品在MDCK细胞水平上进行H5N1毒株的攻毒实验。试验中，设置正常细胞对照组，病毒对照组，质量浓度在无毒范围内2倍稀释4个质量浓度，设置3孔重复。弃96孔细胞培养板孔内上清，100 μ I/孔加入10000TCID50病毒液(10-4.43)，设置3个重复。37°C吸附2 h，弃病毒液上清，100 μ I/孔加入不同浓度的样液。置37°C，5% C02培养箱中继续培养48h。采用MTT法测定0D492值，用统计学软件SPSSl1.5的Probit回归法，计算样品的半数毒性浓度(CC50)和半数有效浓度(EC50)，得到样品的选择指数SI=CC50 / EC50，计算病毒抑制率。
[0028] 结果显示:灰树花258菌株粗多糖在4mg/ml浓度下对H5N1毒株可达到最高的抑制率为 24.8%，此时 CC50 为 51`.282mg/ml, SI 为 0.51。
【权利要求】
1.灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征是，所述灰树花258菌株粗多糖由下述方法制得: (1)加热提取:取经液体发酵的发酵全液或菌丝体或澄清液，固体发酵的菌丝体放于容器内，加入纯净水调整其PH值为8~12，置60~120°C下加热100~240分钟； (2)过滤:之后冷却、以180~200目的筛网过滤灰树花菌丝体，收集滤液，滤渣以其4~8倍体积的蒸馏水稀释，重复上述操作I~2遍，再收集滤液； (3)减压浓缩:合并收集的滤液，在温度50~70°C，压力0.2~0.6Kg/cm2，真空度为.0.02~0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10~1/20 ； (4)除色素:取浓缩后的提取液，用氨水调pH至6.0~8.0，于30~45°C下搅拌，按每IOml滴加Iml~2ml 10 %~30%的H2O2，进行脱色10~24h，得到淡黄色液体； (5)除小分子化合物:然后利用透析袋，截留分子量3000~5000以上，4°C~10°C条件下透析24h~48h,去除多余的H2O2、小分子化合物； (6)除脂肪:取上述提取液，装入索氏提取器，按1:0.5~I的比例加入石油醚，加热回流提取2~6h，待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液； (7)醇析:在回收的提取液中，加入量为其体积4~8倍的95%醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为30~60r/min，10~20分钟后，静置24~48小时进行醇析； (8)离心分离:醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为3000~5000r/min离心20~30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物； (9)收集物干燥:将上述收集的离心沉淀物，在50~70°C温度条件下干燥36~48小时； (10)收集物粉碎:取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后即为灰树花粗多糖； 其中，所述的灰树花258菌株发酵全液是指灰树花258菌株发酵液与菌丝体的集合体。
2.如权利要求1所述的灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述灰树花258菌株发酵全液经分离获得灰树花258菌株菌丝体。
3.如权利要求1或2所述的灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒上药物的应用，其特征在于，所述灰树花258菌株发酵全液通过以下步骤获得: (O液体种子培养:采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基，将10%的灰树花菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，调节PH为3-8，培养温度为20-35°C，摇瓶转速为80-280r/min，培养7_15天，即可得到灰树花液体种子； (2)发酵罐发酵:先将发酵罐中的培养基进行灭菌，灭菌压力为0.1~0.2公斤/平方厘米，灭菌时间为1-2小时；当灰树花液体种子pH值降至2.5-4时，将摇瓶中的灰树花258菌株种子接种到50L发酵罐的培养液中，调整pH为5_8，培养温度25-35°C，通气量.0.5-1.lvvm，搅拌转速100-250r/min，培养7_30天，即可获得灰树花258菌株发酵全液。
4.如权利要求3所述的灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，灰树花258菌株液体发酵培养基以克/100毫升计是:玉米淀粉I~3%，蔗糖I~5%，蛋白胨0.2~0.6%，酵母膏0.2~0.5%，硫酸镁 0.1~0.3%，磷酸二氢钾.0.05 ~0.1%。
5.如权利要求1所述的灰树花253菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，灰树花253菌株固体发酵的培养基以百分含量计是:玉米芯63~83%，麸皮15~35%,葡萄糖1%,碳酸钙1% ； 所述固体培养基还可以为谷物培养基，其配方是:小麦98%，碳酸钙1%，石灰1% ;或者谷子98%，碳酸钙1%，石灰1% ;或者玉米98%，碳酸钙1%，石灰1% ;或者大麦98%，碳酸钙1%，石灰1% ； 所述谷物培养基的制备方法及菌丝体培养方法为:先将谷物加水浸泡12小时，加入石灰1%，煮沸后捞出，浙干表面水分，拌入1%碳酸钙后，装瓶，封口，然后植入高压锅中进行高压灭菌，121°C下保持2h，温度降到30°C后，取出，冷却后将樟芝液体菌种接种至固体培养基的中，培养温度25°C~27°C、空气相对湿度50%~70%、黑暗培养160 d，检察并移除污染，待菌瓶表面全部长满白色菌丝，取出菌丝体，进行提取。
6.如权利要求1所述的灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征是，所述灰树花菌株名为灰树花258菌株系山东省应用真菌重点实验室选育(应使用规定的保藏信息)。
7.如权利要求1所述的灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于步骤(7)中所述醇溶液为甲醇或乙醇水溶液，浓度为60-95%。
8.如权利要求1所述的灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于步骤(9)中所述干燥使用真空干燥，真空度0.02-0.06 Mpa，干燥时间36-48小时。
9.如权利要求1所述的灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于步骤(10)中所述粗多糖粉碎时采用200目的中药粉碎机对粗多糖进行粉碎过筛。
10.如权利要求1所述 的灰树花258菌株粗多糖在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述灰树花258菌株粗多糖在药物中的含量为10%-20%。
【文档编号】A61P31/16GK103800357SQ201310401641
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】宋爱荣, 赵晨, 田雪梅, 王光远, 张京宣 申请人:青岛农业大学