Ggpps基因在制备治疗非酒精性脂肪肝药物的用途

Ggpps基因在制备治疗非酒精性脂肪肝药物的用途
【专利摘要】本发明提供了GGPPS作为靶点治疗非酒精性脂肪肝的应用。本发明的GGPPS拮抗剂能降低与肝脏脂质积累有关的基因表达。本发明的肝脏特异性敲除GGPPS可以减缓肝脏脂质积累和变性，降低血液中天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平，保护肝脏功能。
【专利说明】GGPPS基因在制备治疗非酒精性脂肪肝药物的用途

【技术领域】
[0001]本发明涉及GGPPS基因在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途，肝脏特异性GGPPS敲除及GGPPS拮抗剂可降低肝脏脂质积累，对治疗非酒精性脂肪肝有显著作用。

【背景技术】
[0002]非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种无过量饮酒史，但病理学改变类似酒精性脂肪性肝病(AFLD)，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征。其疾病谱包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化四个从轻到重的病理阶段。近年来由于生活方式、饮食结构等的改变，NAFLD亦随着肥胖、2型糖尿病、血脂异常等代谢相关疾病的增加而越来越弓I起人们的重视。
[0003]NAFLD的临床表现随病因、肝脏的脂肪及炎症浸润程度、病程及伴随的基础疾病如肥胖、糖尿病、高血压、冠心病等不同而不同。多数患者(48%?100% )无肝病症状，少数会有乏力、右上腹不适或隐痛等非特异性症状。肝肿大常是许多患者的唯一体征，肝功能多正常或转氨酶轻度升高，并以ALT为主，且AST/ALT < I。部分患者进展为终末期肝病时，可出现黄疸、腹水、消化道出血等表现。
[0004]NAFLD在总人群中的患病率为20% (15%?39%)，NASH为2%?3%。日本NAFLD患者占非嗜酒者的14%，而美国成人中高达23%，是最常见的肝疾病。NAFLD可发生于任何年龄，儿童的发病率为2.6%，肥胖儿童可增加到52.8%。我国B超发现脂肪肝在一般人群中的患病率为10%?16%，肥胖患者的检出率为38%。
[0005]目前已有大量的关于非酒精性脂肪肝及其治疗的临床报道，但导致NAFLD的具体机制并不清楚。现今广泛接受的关于NAFLD发病机制的理论是“二次打击”假说:第一次“打击”是脂肪醇和甘油三酯在肝脏沉积，引起的单纯脂肪变性；在此基础上引起慢性氧化应激，造成肝细胞线粒体和肝细胞本身的持续损伤和炎症的形成即为第二次“打击”。现在研究表明，肝细胞内甘油三酯(TriglyCeride，TG)的积累是非酒精性脂肪肝病变的第一步，造成了肝脏组织的第一次损伤打击。由于肝细胞内TG的积累是可以逆转的，因而明确肝细胞内TG积累的具体调节机制对治疗和预防NAFLD的发生有着重要的临床意义。
[0006]ggpps基因即香叶基香叶基二憐酸合成酶(geranylgeranyl diphosphatesynthase I, ggpps I)基因。在蛋白质异戍二烯化修饰过程中起到关键作用，ggpps的底物GGPP是小G蛋白发生香叶基化的重要前体。香叶基化是蛋白质的翻译后修饰之一，一般发生在蛋白质C末端保守的半胱氨酸。发生香叶基化的蛋白质包括Ras和Ras相关的小G蛋白如Rho，Rab，Rac，以及三聚体G蛋白的Y亚基，这些受调控的蛋白质都是信号传递通路中重要的分子开关调节蛋白。有研究报道，以GGPPS为药物靶点对于成骨细胞分化与骨骼构建有改善作用(Weivoda and Hohl 2011)，也有研究阐述了 GGPPS可作为香烟烟雾引发的肺部疾病的治疗靶点(Shen，Gong et al.2011)，但就GGPPS用于治疗非酒精性脂肪肝之间的靶点药物并没有任何报道。


【发明内容】

[0007]有鉴于此，本发明的目的在于通过考察肝脏特异性GGPPS敲除小鼠肝脏中脂质积累情况及肝脏中与脂质合成相关基因的表达量等指标，确认GGPPS能否作为非酒精性脂肪肝治疗的药物靶点，从而为治疗非酒精性脂肪肝开辟新的道路，提高非酒精性脂肪肝患者的生命质量。
[0008]为达上述目的，发明人通过高脂诱导建立非酒精性脂肪肝小鼠模型，并检测其肝脏组织中GGPPS的表达水平。通过real time方法检测发现，高脂诱导的非酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织中GGPPS的表达量显著增加。
[0009]为进一步证实GGPPS在非酒精性脂肪肝的发生中起到重要的调控作用，发明人在肝脏脂质代谢细胞模型原代肝细胞中过表达GGPPS，发现:GGPPS可以显著提高肝细胞内脂滴积累的效率以及PPAR Y的表达，并且很多PPAR Y负责激活表达的下游脂质合成相关基因FAS，SREBP-lc, ACCI, S⑶-1，PPAR Y的表达显著增加。此外，发明人构建了小鼠肝脏特异性敲除的GGPPS模型，并对其与对照组进行高脂诱导。连续12周体重记录显示肝脏特异性GGPPS敲除减缓了高脂诱导的体重增加。高脂诱导后的肝脏特异性GGPPS敲除小鼠和对照鼠肝脏切片油红染色和HE染色分别显示GGPPS肝脏特异性敲除缓解了高脂诱导产生的肝脏脂质积累和变性。解剖显示肝脏特异性敲除GGPPS避免了高脂诱导后的过度增重及肝脏由于脂质积累产生的发白现象。而且肝脏特异性GGPPS敲除保护了肝脏的功能，缓解了高脂诱导后的血糖不耐受和胰岛素抵抗。此外，GGPPS肝脏特异性敲除降低了肝脏脂质合成相关基因的表达。上述细胞水平和动物水平的实验结果均证明了 GGPPS在非酒精性脂肪肝的发生中起到重要的调控作用。
[0010]根据本发明的记载和本领域的公知常识，抑制GGPPS对于治疗非酒精性脂肪肝有显著作用。GGPPS基因重组表达载体例如本申请中构建的Ade-ggpps/siRNA重组腺病毒可以单独或与其他有功能活性基因重组表达载体联合，再辅以药学上可接受的载体，用以制备治疗非酒精性脂肪肝的药物。
[0011]本发明治疗非酒精性脂肪肝的药物施用方式可以是口服、肝脏特异性施用或全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者用栓剂)。本发明的药物也可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物，可通过常规方法进行制备。针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。
[0012]进一步，根据本发明的记载和本领域的公知常识可知，任何在转录和/或翻译水平上抑制GGPPS基因的拮抗剂均可单独或与其他具有功能活性的多肽、蛋白质、融合蛋白等联合，再辅以药学上可接受的载体，用于制备治疗非酒精性脂肪肝的药物。
[0013]本发明的有益效果在于:本发明首次公开了 GGPPS基因和蛋白的拮抗剂可以用于制备治疗非酒精性脂肪肝的药物，肝脏特异性抑制GGPPS表达可以减缓肝脏脂质积累和性变，在非酒精性脂肪肝治疗领域具有潜在、良好的应用前景。
[0014]

【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1为肝脏特异性GGPPS敲除小鼠的敲除效率检测。显示肝脏特异性GGPPS敲除小鼠的肝脏中GGPPS的mRNA和蛋白质水平下降，表示两者相比具有统计学显著差异。
[0016]图2为用正常饲料和高脂饲料喂养下，肝脏特异性GGPPS敲除小鼠与对照鼠12周的体重检测。显示了 GGPPS敲除减缓了正常饲料和高脂诱导下的体重增加。
[0017]图3为正常饲料和高脂饲料喂养下，肝脏特异性GGPPS敲除小鼠与对照鼠肝脏切片HE染色后光镜图。显示GGPPS肝脏特异性敲除缓解了高脂诱导产生的肝脏脂质变性。
[0018]图4为正常饲料和高脂饲料喂养下的肝脏特异性GGPPS敲除小鼠与对照鼠肝脏切片油红O染色后光镜图，显示GGPPS肝脏特异性敲除缓解了正常饲料和高脂诱导下的肝脏脂质积累。
[0019]图5为正常饲料和高脂饲料喂养下的肝脏特异性GGPPS敲除小鼠与对照鼠肝脏，显示GGPPS肝脏特异性敲除保护肝脏的过度增重及肝脏由于脂质积累产生的发白现象。
[0020]图6为GGPPS肝脏特异性敲除小鼠血液中AST和ALT水平下降，显示GGPPS的肝脏特异性敲除保护了肝脏的功能。
[0021 ] 图7显示GGPPS肝脏特异性敲除小鼠降低了 Erk/MAPK的激活。
[0022]图8显示GGPPS肝脏特异性敲除降低了肝脏脂质合成相关基因表达。
图9显示在原代肝细胞中过表达GGPPS可促进PPAR Y的表达及SREBP-1的成熟。
[0023]图10显示原代肝细胞中干扰GGPPS可降低PPAR Y和ADRP的表达。

【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0025]以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验指南New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件
一般材料和方法
材料:原代肝细胞由正常小鼠肝脏分离。Ant1-p-ERK抗体、ant1-ERK抗体购自上海康城生物技术公司，GGPPS, PPAR Y，SREBP-1, β-actin’ a-tubulin 抗体购自 Santa Cruz公司。ECL发光液购自CST公司，Trizol购自TAKARA公司，反转录试剂盒购自TAKARA公司。荧光定量PCR试剂盒购自B1neer公司。油红染料购自南京生兴生物技术公司。肝脏特异性GGPPS敲除小鼠及对照小鼠购自南京大学模式动物研究所。
[0026]方法I小鼠肝脏细胞分离培养
小鼠用2%戊巴比妥钠按(45mg/kg)麻醉后暴露腹腔，灯泡靠近小鼠保持体温，在小鼠下腔静脉处插管，用 Pl 灌流液(Krebs Ringer with glucose 40ml, 50mM EGTA 80 μ I) 2ml预灌流，见肝脏变色后剪开门静脉，灌流速度加快，40ml在6分钟左右灌流完毕。换20ml P2灌流液(Krebs Ringer with glucose 40ml, IM Cac12 54.88 μ I)灌流，完毕后肝脏呈土黄色。
[0027]在超净台中将肝脏整体摘下，在预冷培养皿中用PBS漂洗。在灭菌培养皿中加入1ml P2，将肝脏包膜除去、撕碎后用筛子和漏斗过滤。滤液置于50ml离心管中加4°C DMEM培养基(10%FBS加100U/ml青霉素、100mg/L链霉素的DMEM) 20ml混匀，50gpm离心2分钟。吸去培养液后加30ml预冷培养液重悬细胞，50gpm离心2分钟，重复三次。吸去培养液后加15ml预冷培养液重悬检测活率。
[0028]接种细胞于6孔板，调整密度为5 X 105，加入37°C DMEM培养基，与37°C、5% C02浓度下的细胞培养箱中培养。
[0029]非酒精性脂肪肝小鼠模型建立及分组
受试动物适应性饲养I周后，分别称重，空白组由12只肝脏特异性GGPPS敲除小鼠与12只对照鼠组成，正常食物(含4%脂肪)及饮水。高脂诱导由12只肝脏特异性GGPPS敲除小鼠与12只对照鼠组成，予以高脂饲料(含65%脂肪)，正常饮水，饲养12周，每周称重一次。
[0030]方法2石蜡切片制备
取肝右叶组织约适量，用4%的多聚甲醛固定24?48h，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片，厚度为5 μ m。
[0031]方法3石蜡切片的HE染色将切片分别浸于二甲苯中10分钟和5分钟脱蜡，之后于梯度乙醇中附水。苏木精染色4分钟后单蒸水稍洗。用0.25% NA3.H20泛蓝30s后单蒸水洗。用梯度浓度乙醇脱水至95%乙醇脱水后，0.5%伊红液染色2-3s，之后100%乙醇中脱水，并在二甲苯中浸泡2分钟。最后用中性树胶封片。
[0032]方法4冰冻切片制备:各组实验鼠于肝右叶相同部位取适量组织，多聚甲醛固定2hr，30%蔗糖脱水8-12hr，OCT包埋。放在_70°C冰箱保存。冰冻切片机切片，切片厚度为 15 μ m。
[0033]方法5油红染色:取高脂诱导后的肝脏特异性GGPPS敲除小鼠和对照鼠肝组织做冰冻切片，60%乙醇稍洗，浸染于油红O染色液工作液中染色(60%油红O原液加40%单蒸水)10-15分钟，60%乙醇分化，水洗，Harris苏木精染核I分钟，水洗I分钟，吸干水分，甘油明胶封片。
[0034]方法6小鼠组织蛋白提取:小鼠喂养第4周后，称取小鼠体重，2%戊巴比妥钠按45mg/kg麻醉，剪开腹腔，取全部肝脏称量湿重，并取肝左叶制备肝脏组织匀浆。用电子天平称取肝脏组织10mg,剪碎后加入蛋白裂解液300ul(20mmol/L Tris (pH 7.5), 4mmol/L EDTA (pH8.0)，2% SDS),组织匀浆，13，000 rpm、4 V、15min 离心，弃沉淀，取上清液。-70 V冰箱保存，99变性。
[0035]方法7培养细胞蛋白提取:细胞培养至可以进行蛋白抽提时，吸去培养基，用冰预冷的 PBS 洗两遍，加入 300ul 裂解缓冲液(50.0 mmol/L Tris (pH 7.5), 150.0 mmol/L NaCl, 0.1% SDS, 1.0% NP-40, 0.5% 脱氧胆酸钠，lmmol/L EDTA)冰浴 30 min，期间每隔5min混匀一次，刮取细胞，12 000 rpm离心15分钟，收集上清，采用BCA法测定蛋白质浓度，99°C变性。
[0036]方法8免疫印迹分析:取50 Ug的总蛋白(组织或细胞中提取)进行SDS-PAGE胶电泳分离，按常规方法转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗4°C孵育过夜，ant1-GGPPS(1:500)，ant1-PPARy (1:500)，ant1-SREBP-l (1:500)，ant1-β -actin (1:500)，ant1-a-tubulin (1:500)，HRP标记的二抗:孵育1.5小时，之后用ECL发光液曝光检测结果O
[0037]方法8提取组织标本RNA:取50mg组织标本，悬浮于Iml Trizol，用组织匀浆器勻衆3-5 min,加1/5体积酹氯仿抽提蛋白，13000rpm,离心15分钟,抽取上清,加等体积的异丙醇，-20 V，20分钟沉淀RNA，13000rpm,离心15分钟，弃上清，75ET0H沉淀溶于20ul DEPC(焦碳酸二乙脂)溶液，测定浓度。
[0038]方法9反转录PCR:通过反转录试剂盒，取Img总RNA反转录合成单链cDNA ,流程如下:Img总RNA,加入4 μ I pre-mix,补DEPC水至20ul。37° C反应30 min后，85° C 处理 5s。
[0039]-20°C 保存。
[0040]方法10实时荧光定量PCR:采用实时荧光定量PCR试剂盒(b1neer)，具体体系如下:20μ I 体系，SYBR(2*):10μ l，Rox 0.4ul 引物(上游)(10*):2 μ 1，引物(下游)(10*):2 μ I, cDNA 模板:2 μ I,加双蒸水至 20 μ I。
[0041]ggpps实时定量PCR引物序列:
ggpsl(鼠)正向:5，- TTTTGCATACACTCGACACACT-3’
ggpsl (鼠)反向:5，- GGCCTCAATTTGTTTGTAGGCTT-3，
扩增条件:95°C预变性I分钟，95°C变性15秒，60°C退火15秒，72°C延伸，收集荧光信号30秒，共40个循环，数据分析。
[0042]方法11 pATC-GGPPS/siRNA构建:根据siRNA设计的一般原则设计选取靶序列。本实验选取的靶序列是5’ - GGUGUCCCAUCUGUCAUUA-3’ (GGPPS小干扰RNA靶向序列)(SEQ ID NO:1),将靶向上述序列的 siRNA 的编码序列 5’-GGTGTCCCATCTGTCATTA-3’ (P1, SEQ ID NO:2)及其反义序列 5’- TAATGACAGATGGGACACC-3，(P2, SEQ ID NO:3)交由上海生工生物技术有限公司合成。
[0043]寡核苷酸退火:将合成的寡核苷酸溶解在ddH20中，终浓度为lyg/ Ul。依次按以下步骤操作:寡核苷酸P1，P2各取1.5μ I加入47 μ I的退火缓冲液(100 mmol/L乙酸钾，30 mmol/L HEPES-KOH pH 7.4，2mmol/L 乙酸镁)，94°C 孵育 4 min, 70°C 孵育 10min ,缓慢冷却至4°C。
[0044]寡核苷酸磷酸化:取Iul退火的寡核苷酸，加I μ I Τ4 PNK缓冲液、I ul Immol/L AT P (储存液 1mM) Uul T4 PNK,6 μ 1Η20,在 37°C 孵育 30 min，70°C孵育 10min (灭活 PNK)。
[0045]质粒酶切、去磷酸化与纯化:按如下体系以Bgl II和Hind III 双酶切穿梭质粒，37 V孵育4 h。85°C，加热15 min以终止反应。直接向反应体系中加入0.1 μ?的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸化反应I h。用1%的琼脂糖凝胶电泳。在长波紫外灯照射下，割取目的片段，用DNA胶回收试剂盒(Qiagen公司)回收。
[0046]Bgl II和Hind III双酶切穿梭质粒反应体系:
1Xbuffer1.0 μ I
穿梭质粒8.0 μ I (?2.0yg)
Bgl II0.2 μ KlOU/ μ I)
Hind III0.2 μ I (1U/ μ I)
Η200.6 μ I
连接与转化连接反应体系:
1XLigase buffer1.0 μ I
T4 DNA Ligase0.5 μ I
酶切过的载体5.0μ1
Pl0.5 μ I P20.5 μ I
H202.5 μ I
将5.0 μ I的酶切过的载体转移到无菌微量离心管中，加Ρ1、Ρ2各0.5 μ I，加水至8.5 μ?，于45° C加温5 min以使重新退火的粘端解链，将混合物冷却至(TC，再分别加入连接酶缓冲液1.0 μ1，Τ4 DNA连接酶0.5 μ?，混匀，于16°C孵育过夜。次日取5.0μ I转化大肠杆菌感受态细胞。
[0047]重组质粒的鉴定:挑克隆，小量提取质粒，以EcoR I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。预期阳性克隆酶切产物会释放一个300 bp的条带，而阴性对照相应条带只有240 bp ο
[0048]为了进一步从序列的准确性上得到验证，选取EcoR I酶切后电泳出现300bp条带的阳性重组质粒送至上海生工有限公司测序。
[0049]在重组包装病毒之前，我们用磷酸钙沉淀法将重组穿梭质粒瞬时转染293A细胞对其基因沉默效率进行了检测。
[0050]方法11 Ade-ggpps /siRNA重组腺病毒的构建:重组质粒pATC-GGPPS/siRNA经Pme I酶切线性化后，用电穿孔法将其与质粒pAdEasy-Ι共同转化感受态菌BJ5183 (条件:电脉冲25 μ F，电压2.5 kV,电阻200 Ω)，进行同源重组。用Pac I酶切鉴定同源重组的质粒，以电穿孔法将重组子转化入大肠杆菌DHlO α内，大量制备重组腺病毒质粒DNA备用转染。
[0051]重组腺病毒的包装和收获:将重组质粒用磷酸钙法转染ΗΕΚ-293Α细胞。转染后7-10天，出现细胞病变效应(cytopathic effects, CPE),表现为贴壁细胞变圆、核浓缩、脱落，出现病毒空斑。收集细胞，反复冻融3次，离心，收集上清于-70 V保存备用。
[0052]病毒颗粒浓度的测定:在24孔细胞培养皿中，待培养的4孔293细胞生长至90%汇合时，吸去培养液，加入0.5 mL无血清DMEM培养液，分别滴加入5、10、30及40 ul的病毒稀释液(稀释约500倍),小心混勻,置于含5% C02培养箱中培养。Ih后,小心加入
0.5 mL含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液，混匀、培养，观察CPE ;3 d后，待加入5ul病毒稀释液的孔完全出现CPE现象时，计数细胞并计算病毒颗粒的浓度。病毒颗粒的浓度=(细胞数X20/病毒稀释液的体积)X病毒稀释倍数。
[0053]实施例
实施例1肝脏特异性GGPPS敲除的工具小鼠的建立。
[0054]根据前面“一般材料与方法” 一节的方法，我们通过Cre-LoxP建立了肝脏特异性GGPPS敲除的工具小鼠。通过免疫印迹法和反转录PCR，荧光实时定量PCR检测了敲除鼠和对照鼠肝脏组织中GGPPS mRNA和蛋白水平。如图1A所示，肝脏特异性GGPPS敲除小鼠的肝脏组织中GGPPS蛋白质水平下降。如图1B所示，肝脏特异性GGPPS敲除小鼠的肝脏组织中GGPPS mRNA水平下降。上述结果表明肝脏特异性GGPPS敲除的工具小鼠得以成功建立。
[0055]实施例2肝脏特异性敲除GGPPS缓解了肝脏脂质积累和变性
根据前面“一般材料与方法”一节的方法，我们对高脂诱导的肝脏特异性GGPPS敲除小鼠与对照鼠肝脏切片HE染色和油红O染色，显示肝脏特异性GGPPS敲除缓解了肝脏脂质积累和变性。图3显示GGPPS肝脏特异性敲除缓解了高脂诱导产生的肝脏脂质变性。图4显示GGPPS肝脏特异性敲除缓解了高脂诱导产生的肝脏脂质积累。图5显示GGPPS肝脏特异性敲除保护肝脏的过度增重及肝脏由于脂质积累产生的发白现象。
[0056]实施例3肝脏特异性敲除GGPPS保护了肝脏的功能。
[0057]根据“一般材料和方法”一节的方法，我们分别检测了高脂饲料和常规饲料喂养的肝脏特异性GGPPS敲除小鼠和对照鼠血液中AST和ALT的水平。结果显示肝脏特异性敲除GGPPS降低了高脂饲料喂养下小鼠的AST和ALT水平。说明了肝脏特异性敲除GGPPS可以保护肝脏功能的受损。如图6所示，肝脏特异性GGPPS敲除小鼠的AST和ALT水平在高脂饲料喂养下较对照鼠低。
[0058]实施例4肝脏特异性敲除GGPPS降低了肝脏脂质合成相关基因的表达水平。
[0059]根据“一般材料和方法”一节的方法，我们检测了高脂饲料和常规饲料喂养的肝脏特异性GGPPS敲除小鼠和对照鼠肝脏中与肝脏脂质合成相关基因(FAS，SREBP-lc, ACC1,S⑶-1，PPAR Y )的mRNA水平，结果显示肝脏特异性敲除GGPPS降低了高脂饲料喂养下小鼠的肝脏中FAS, SREBP-lc, ACCI, S⑶-1和PPAR Y的mRNA水平。如图8所示，肝脏特异性GGPPS敲除小鼠肝脏的FAS, SREBP-lc, ACCI, SCD-1，和PPAR Y的mRNA水平在高脂饲料喂养下较对照鼠低。
[0060]实施例5原代肝细胞中过表达GGPPS促进PPAR Y的表达及SREBP-1的成熟。
[0061]根据“一般材料和方法” 一节的方法，我们在原代肝细胞中过表达GGPPS，并用免疫印迹法检测了 PPARy蛋白、前体SREBP-1和核SREBP-1。结果显示过表达GGPPS促进了PPARy的表达，同时也促进了 SREBP-1的成熟。如图9所示，GGPPS过表达后，原代肝细胞中PPARy蛋白水平提高，成熟的SREBP-1蛋白水平提高。
[0062]实施例6干扰原代肝细胞中GGPPS的表达可以减缓肝细胞脂质积累
我们使用上节“一般材料和方法”中构建的Ade-ggpps/siRNA重组腺病毒干扰原代肝细胞中GGPPS的表达。并测定细胞中与肝脏脂质合成相关基因(PPAR Y，ADRP)的mRNA水平。结果显示，原代干细胞中干扰GGPPS降低了培养基脂肪酸阳性条件下PPAR Y，和ADRP的表达。如图10所示，培养基加入脂肪酸情况下，GGPPS干扰原代肝细胞中PPARy和ADRP的mRNA水平较对照组低。
【权利要求】
1.靶向抑制GGPPS基因的试剂在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶向抑制肝脏特异性GGPPS基因的试剂是任何在转录和/或翻译水平上抑制GGPPS基因的拮抗剂，包括但不限于抑制GGPPS基因转录和/或翻译的小干扰RNA。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述靶向抑制肝脏特异性GGPPS基因的试剂是小干扰RNA。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述小干扰RNA靶向以下序列:5’_GGUGUCCCAUCUGUCAUUA-3’ (SEQ ID NO:1)。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述小干扰RNA的编码序列为5’-GGTGTCCCATCTGTCATTA-3’ (SEQ ID NO:2)。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述小干扰RNA由重组腺病毒真核表达载体表达。
【文档编号】A61K48/00GK104415349SQ201310401483
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】李朝军, 薛斌, 姜珊, 石梦月, 沈宁 申请人:南京大学