一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疾病模式动物的构建方法，具体涉及一种非酒精性脂肪肝斑马鱼 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史，以脂肪变性和脂质堆积为特征的临床病 症。除直接引起肝硬化及肝癌外，该疾病的发展还间接导致了 2型糖尿病和动脉粥样硬 化的发生。随着肥胖及相关代谢综合症的流行，非酒精性脂肪肝已成为全球慢性肝病的 重要病因及生物医学的重要研宄对象。在西方发达国家，非酒精性脂肪肝发病率往往在 24% -42%之间，而在我国，成人发病率已达到15%以上，甚至儿童也有2. 1%的几率患病。 在此情况下，关于其病理过程研宄及新型治疗手段的研制工作就显得至关重要。
[0003] 无论病理研宄，还是药物疗效评价均需要合适的动物模型来进行，目前科研上主 要的模式动物为通过高脂饲料喂养、毒性损伤及基因突变等方式构建基于大/小鼠的非酒 精性脂肪肝模型，这些模型与人类极为相似，适于疾病机制和药物干预研宄。但是大/小 鼠模型的构建一般需要2-3月，维护成本较高，对饲料和药物的消耗量较大，非常不适用于 高通量实验，进而其应用受到了限制。特别是采用四氯化碳腹腔注射等毒性损伤下的大/ 小鼠模型，除上述缺点外，还会因为毒性的影响引发动物的死亡率上升，从而造模成功率下 降。
[0004] 目前，斑马鱼已成为国际上疾病研宄的主要模式生物之一，并被成功应用于新药 筛选中。这首先是因为斑马鱼遗传背景清晰，与人类基因相似度高达87 %，器官病变过程又 与人类极为接近。另一方面，斑马鱼胚胎发育是全透明的，加上适当的色素抑制处理，可以 清晰地观察病变过程。更重要的是，和老鼠等其他实验动物相比，斑马鱼体型小、实验周期 短，且维护费用低廉，非常适合于高通量实验。我国关于斑马鱼的研宄开始较晚，到21世纪 初才正式开始，但发展迅速，已成立了国家斑马鱼模式动物中心等多个资源库，业务涉及疾 病研宄和新药筛选等多个学科领域。
[0005] 然而目前，用斑马鱼进行非酒精性脂肪肝的研宄工作仍较少，国内戴文聪等人 (2013)采用2%乙醇处理受精后5天的斑马鱼32h后建立了急性酒精性脂肪肝模型，非酒 精性脂肪肝模型则未见报道。在国外，通过基因变异或沉默的方法，研宄者采用斑马鱼模型 验证了多种基因变异（foiegras，ducttrip，hi559，redmoon及sktll，见AmnonSchlegel， 2012)与非酒精性脂肪肝的关系，但这些方法操作复杂，成本较高，且目前尚未成为稳定的 商品出售。就化学物诱导而言，仅有Amali等人（2006)采用硫代乙酰胺处理受精后5天的 斑马鱼，发现其在10天后即可明显表现出脂质损伤症状。然而化学物处理因其具有的明显 的生物毒性，会导致斑马鱼死亡，从而降低建模成功率，且对于操作者本身也具有危害。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种成本低、成熟周期短的非 酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法。
[0007] 为实现本发明目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
[0008] -种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤1)在无光照条件下，将性成熟的斑马鱼按雌雄比=1 : 2的比例放入交配鱼 缸内；10小时后将所述交配鱼缸置于光照条件下0. 5小时，进行受精产卵；
[0010] 步骤2)将步骤1)得到的受精卵以30个/孔的密度分布于孔板中，在所述孔板 的每个孔中加入3?4mL培养液，28°C恒温，以每天14小时光照/10小时黑暗的条件培养 4dpf后，移去所述孔板中的培养液；
[0011] 步骤3)将所述孔板中的受精卵随机分为正常组与高脂处理组，向所述高脂处理 组的每个孔中加入3?4mL高脂培养液，密封，28°C恒温，以每天14小时光照/10小时黑暗 的条件培养2?3天；所述高脂培养液含50?200yM的棕榈酸或100?400yM的油酸；
[0012] 步骤4)将步骤3)得到的正常组与高脂处理组斑马鱼置于染色皿中，加入4wt%多 聚甲醛在4°C下反应10?14小时，PBS缓冲液洗涤2?3次，随后依次采用Owt%、30wt%、 60wt%、90wt%和100wt%的丙二醇水溶液在室温下各脱水lOmin，加入lwt%的油红染色 液，在28°C下染色10?12小时，随后依次采用 丙二醇的乙醇溶液在室温下各脱色IOmin;
[0013] 步骤5)采用显微镜观察高脂处理组斑马鱼的肝脏脂肪变性情况，并与正常组对 比，若高脂处理组斑马鱼的肝脏脂滴度多3,则判定为非酒精性脂肪肝。
[0014] 优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，当所述高脂培养液含50? 200yM的棕榈酸时，向所述高脂培养液中加入牛血清白蛋白直至其含量达到4wt%。
[0015] 优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，当所述高脂培养液含 100?400yM的油酸时，向所述高脂培养液中加入DMSO直至其含量达到0.Iwt%。
[0016] 优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，所述高脂培养液含200UM 的棕榈酸或400yM的油酸。
[0017] 优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，当所述高脂培养液含50? 200yM的棕榈酸时，培养时间为3天。
[0018] 优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，当所述高脂培养液含 100?400yM的油酸时，培养时间为2天。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 1)本案在国内首次采用斑马鱼来构建非酒精性脂肪肝模型，成本低且成熟周期 短，可以有效降低病理学和药物筛选成本；此外，斑马鱼模型还可用于构建高通量药物筛选 平台，进一步提高生物医药研发效率。
[0021] 2)本案的成果将为临床非酒精性脂肪肝的发生病理学提供参考，而形成的斑马鱼 模型也将提供给各科研机构及制药公司，成为非酒精性脂肪肝病理研宄、新型治疗手段开 发以及药物高通量筛选的有力工具，降低药物开发成本，拓展分子生物医学的研宄手段，推 动我国模式动物产业及非酒精性脂肪肝医疗事业的发展。
【具体实施方式】
[0022] 下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据 以实施。
[0023] 一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，包括以下步骤：
[0024] 步骤1)在无光照条件下，将性成熟的斑马鱼按雌雄比=1:2的比例放入交配鱼 缸内；10小时后将交配鱼缸置于光照条件下0. 5小时，进行受精产卵；
[0025] 步骤2)将步骤1)得到的受精卵以30个/孔的密度分布于孔板中，在孔板的每个 孔中加入3?4mL培