专利名称：石榴花多酚在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种石榴花多酚在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途。
背景技术：
随着生活水平的提高、生活方式的转变以及饮食结构的变化，代谢性疾病的发病率逐年上升。其中以糖尿病和非酒精性脂肪肝较为常见。目前非酒精性脂肪肝(NAFLD)日益受到重视，但其发病机制仍不明了。1998年Day提出的“二次打击”理论认为各种诱因引起胰岛素抵抗(IR)，即初次打击。胰岛素抵抗可促进外周脂解増加、高胰岛素血症，増加肝细胞脂肪堆积。同时增加肝细胞对损害因子的敏感性。二次打击即氧化应激及脂质过氧化等因素进ー步损伤肝细胞，导致NAFLD的发生。肝脏是机体脂代谢的重要器官，游离脂肪酸(FFA)通过血液进入肝脏，之后经过两条途径进行代谢，被氧化生成ATP和被酯化转变成甘油三酯(TG)，生成的TG—部分储存在肝细胞内，另一部分形成极低密度脂蛋白(VLDL)。脂肪过量和脂肪组织功能障碍引起体内FFA和TG过多，使得大量TG沉积在肝细胞中，从而形成NAFLD。此外，当患有非酒精性脂肪肝时机体糖基化产物和糖氧化产物形成增加和抗氧化机制的减弱，活性氧簇(ROS)増加，自由基反应明显增强。过多的自由基会通过损伤胰岛B细胞导致外周组织对胰岛素的敏感性和反应性降低。丙ニ醛(MDA)是脂质过氧化终产物，反映脂质过氧化产物的浓度，它对细胞及其成分具有毒性效应。超氧化物歧化酶(SOD)属于机体抗氧化酶系统，能持续清除R0S，防止生物膜脂质过氧化损伤，其活性间接反映机体清除氧自由基的能力。资料显示，非酒精性脂肪肝患者血清中ALT的水平与肝脏的IR相关，提示ALT的升高可以反映肝脏脂肪的变化。这种变化可先于糖尿病的发生，因此，对肝脏转氨酶的检测，尤其是重视ALT的变化，对于预测该类疾病的发生和发展有着重要的意义。此外转氨酶水平的升高也提示患者的脂肪肝病变程度加重，有向脂肪肝性肝炎发展的趋势，需积极的防治，阻止肝细胞进一歩受损。对氧磷酶(PON)是能够水解有机磷酸盐基质对氧磷的ー种酶，它包括PONl、P0N2和P0N3。与肝脏疾病发生有关的PONl和P0N3主要在肝脏中合成，在肾和脑中也有表达。研究显示PON有重要的抗氧化作用，在脂肪肝的发病机理中，病人由于氧化应激及脂质过氧化增加，导致肝功能损害，抑制了 PON的合成。而PON又与高密度脂蛋白(HDL)的生理作用密切相关，因此PON的含量也是检测肝脏功能的重要指标。非酒精性脂肪肝的患者多存在肝功能障碍，而临床治疗常用药，大多在肝脏进行代谢，因此长期应用可能会加重脂肪蓄积和肝功损害。鉴于长期服用化学药物引起的诸多不良反应，在植物药中寻找既能降低血糖、血脂又能保护肝脏的药物，具有积极的临床意义。研究显示，植物多酚在治疗非酒精性脂肪肝方面具有疗效显著、副作用小的特点。实验研究表明黒茶多酚提取物可抑制此类患者体内胰脂酶活性，減少TG的吸收，減少患者进餐后血脂的增高；Kaleaa等发现蓝莓中的多酚类物质能够降低血清中低密度脂蛋白(LDL)和机体氧化应激反应。石槽科(Punicaceae)植物石槽(Punicagranatum L.)的花为中药和维吾尔常用药。研究发现，石榴花提取物在降糖的同时，对血脂也有调节作用。与对照组相比，石榴花提取物显著減少ZDF大鼠心肌中甘油三酯和总胆固醇的含量，其机制为上调腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) a 2mRNA水平。Li Y.等给予ZDF大鼠ロ服石榴花醇提物500mg *kg^6周后，肝TG和脂滴含量显著減少。同时石榴花醇提物可通过改善次氮基三こ酸铁诱导的氧化应激状态保护肝脏。本课题组先前 研究发现，石榴花多酚能够明显降低高脂饮食诱导的糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数，増加组织对胰岛素的敏感性，有效减轻IR程度。同时还可明显降低糖尿病大鼠血清中的TG、LDL-C的含量。其中药量为300mg -kg^1的效果尤为明显。此结果提示石榴花多酚能对非酒精性脂肪肝具有一定的保护作用。本研究以高脂饲料联合腹腔注射STZ的造模方法复制非酒精性脂肪肝的大鼠模型。在实验过程中通过对大鼠血清和肝脏组织进行生化指标的检测、病理组织学的观察，进一步确定脂肪肝的严重程度，探讨建立动物模型的最佳方案。在此基础上，观察石榴花多酚对大鼠非酒精性脂肪肝的影响，探讨石榴花多酚的作用机制。本发明与此前本课题组所作的石榴花多酚对糖尿病大鼠血糖和血脂的影响有明显的区別。在前期的工作中本发明人研究提供了石榴花多酚对糖尿病大鼠具有良好的降糖调脂功效，鉴于此本发明人进ー步研究了石榴花多酚对非酒精性脂肪肝大鼠的治疗作用，由于非酒精性脂肪肝的发病机制与胰岛素抵抗和高脂相关，因此动物造模也通常采用腹腔注射STZ伴高脂饲料喂养的方法，通过肝脏病理检测确定模型是否成功。给予非酒精性脂肪肝大鼠石榴花多酚进行干预四周，检测相应指标以判断受试物的药效，并进一歩分析其作用机制。结果显示石榴花多酚对非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏具有良好的保护作用。其机制可能与石榴花多酚良好的抗氧化能力；对肝脏中PONl蛋白的合成影响；增加血清中高密度脂蛋白的合成等因素有夫。
发明内容
本发明目的在于，提供ー种石榴花多酚在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，经过大量的实验及肝脏的病理切片证明石榴花多酚对非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏具有良好的保护作用。其作用机制能通过降低大鼠血清FBG、Flns，缓解胰岛素抵抗，延缓“ニ次打击学说”中的第一次打击，降低血清中TG、TC、LDL升高HDL含量；改善机体氧化应激状态；可显著升高大鼠肝脏组织中PONl的表达等作用来缓解第二次打击；从而起到防止肝脏进ー步发生变性、坏死及纤维化的作用。本发明所述的ー种石榴花多酚的用途，该石榴花多酚在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途。
图I为本发明正常对照组大鼠肝脏组织HE染色切片(X400)图；图2为本发明模型组大鼠肝脏组织HE染色切片(X400)图3为本发明ニ甲双胍组大鼠肝脏组织HE染色切片(X400)图；图4为本发明PFP I组大鼠肝脏组织HE染色切片(X400)图；图5为本发明PFP II组大鼠肝脏组织HE染色切片(X400)图；图6为本发明PFP III组大鼠肝脏组织HE染色切片(X400)图；图7为本发明正常对照组肝脏组织PONl的表达图；图8为本发明模型组肝脏组织PONl的表达图；图9为本发明ニ甲双胍组肝脏组织PONl的表达图；图10为本发明PFP I组肝脏组织PONl的表达图；图11为本发明PFP II组肝脏组织PONl的表达图；图12为本发明PFP III组肝脏组织PONl的表达图。
具体实施例方式实施例本发明所述的石榴花多酚的用途，该石榴花多酚在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，具体步骤为材料与方法实验材料 受试药物石榴花多酚，由中国科学院新疆理化技术研究所提供，分装后，于温度-20°C避光保存备用，用时以蒸馏水配制，现配先用。实验动物清洁级健康雄性SD大鼠75只，体重140_160g，均由新疆大学实验动物中心提供，许可证号SCXK (新)2009-0001。实验方法动物模型制备取75只SD大鼠，适应性喂养I周后，根据体重随机取8只作为正常对照组，其余大鼠按照第一部分的造模方法，先以高脂饲料喂养10周，第8周腹腔注射STZ 30mg kg—1 ；动物分组和给药方法将非酒精性脂肪肝大鼠随机分为5组模型组给予Iml IOOg-1蒸馏水灌胃；ニ甲双胍组给予ニ甲双胍IOOmg kg-1 ；PFP I组给予石榴花多酚75mg kg—1灌胃；PFP II组给予石榴花多酚150mg kg—1灌胃；PFP III组给予石榴花多酚300mg kg—1灌胃；各组大鼠每日灌胃一次，共4周；标本留取于给药第4周末，禁食12小时，以麻醉药(安定氯胺酮阿托品=1:1: 1)0. 2ml IOOg-1体重的剂量进行腹腔麻酔，腹主动脉取血，分离血清，留作血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、空腹血清(Flns)測定；切取肝脏最大叶距离边缘Icm处肝脏组织，置于4%多聚甲醛固定液留做病理学观察，剰余肝脏标本保存于温度-80°C冰箱用于制备组织匀浆、提取RNA等；观察指标与方法一般情况观察大鼠一般情况精神状态、饮食及活动情况、毛色、饮水量、尿量
坐寸o生化指标测定用BECKMAN CX7 全自动生化分析仪检测血清 TG、TC、HDL-C, LDL-C, ALT、AST。血清胰岛素水平測定按照碘胰岛素放射免疫分析药盒说明书的步骤，測定大鼠 血清中Flns的含量。组织匀浆中总蛋白含量測定取制备完成的肝组织匀浆，用生理盐水(0. 9% )按I 9稀释，按考马思亮兰蛋白測定试剂盒说明书的步骤进行定各组织匀浆中总蛋白含量。各组大鼠血清和肝组织中SOD和MDA的测定按照SOD和MDA试剂盒说明书的步骤操作。肝组织病理形态学观察采血后，摘取大鼠肝脏，在肝脏最大叶距边缘0. 5cm处取
0.5X0. 5X0. 5cm3大小的肝组织浸泡于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后以4 y m厚度切片，行苏木素-伊红染色，光镜下观察。结果分析根据肝脏外观及HE染色，所有切片均由有经验的病理科医师盲法阅片作出诊断，每张切片观察5个X250视野，对肝脂肪变性程度分级。PONl蛋白表达的测定采用免疫组化PV(Power Vision)法測定。统计学处理应用SPSS17. 0统计分析软件进行统计分析，所有计量资料用S表示，采用单因素方差分析，以P < 0. 05，P < 0. 01为统计学上差异显著。结果动物分组及一般情况观察将造模成功的56只大鼠进一步分为5组模型组、ニ甲双胍组、石榴花多酚低、中、高组，均以高脂饲料喂养4周。正常对照组和模型组予以等体积量的蒸馏水灌胃4周，ニ甲双胍组、石榴花多酚低、中、高剂量组分别以ニ甲双胍IOOmg kg'石槽花多酹 75、150、300mg kg-1 灌胃 4 周；灌胃期间各组大鼠一般状态尚好，与正常对照组相比，模型组大鼠进食、饮水量和尿量偏多，精神差，毛色枯黄，行动缓慢，ニ甲双胍和石榴花多酚干预组大鼠状态介于正常对照组和模型组之间。各组大鼠一般资料的比较干预4周末，模型组大鼠体重显著低于正常对照组(P
<0. 01)。与模型组相比，ニ甲双胍和石榴花多酚干预后，大鼠体重较模型组无显著改变(P
<0. 01)。见表 I :表I各组大鼠体重的变化(mmol じ1，n = 8)
权利要求
1. ー种石榴花多酚的用途，其特征在于该石榴花多酚在制备治疗非酒精性脂肪肝的药 物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种石榴花多酚在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途，经过大量的实验证明石榴花多酚可明显降低大鼠血清Flns、IRI，延缓“二次打击学说”中的第一次打击，起到防止肝脏进一步发生变性、坏死及纤维化的作用，石榴花多酚可显著升高大鼠肝脏组织中PON1的表达，升高HDL含量并改善大鼠体内的氧化应激状态。
文档编号A61K133/00GK102641312SQ20121015782
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者何雯, 帕尔哈提·克热木, 曲姗姗, 程路峰, 闫冬, 阿依仙木·加帕尔, 阿吉艾克拜尔·艾萨, 马晓玲, 魏媛媛 申请人:新疆医科大学