一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括H7N9禽流感工作种子批毒种的建立、病毒接种与培养、病毒灭活、病毒收获液澄清与浓缩、病毒纯化、病毒裂解、再灭活、除糖除裂解剂、除菌过滤及半成品配制步骤；采用该方法制备的H7N9型流感疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。
【专利说明】一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]禽流感是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，它能感染人类，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高；目前，主要采用疫苗进行预防，所用疫苗包括病毒灭活疫苗、减毒疫苗、重组亚单位疫苗等。
[0003]流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一型为血细胞凝集素(即H)，一型为神经氨酸酶(即N)，H又分15个亚型，N分9个亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性，H3为人犬共患；依据流感病毒特征可分为HxNx共135种亚型，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种，往往在禽间发现，未发现过人感染的情况，这个病毒的生物学特点、致病力、传播力，还没有依据进行分析判断。
[0004]在针对禽流感H7N9病毒的疫苗研究方面，现有技术中尚未见良好疗效的针对H7N9亚型的粘膜免疫疫苗，更未有良好疗效的针对H7N9亚型病毒的多表位粘膜免疫疫苗，面对可能的禽流感H7N9病毒感染的流行，人们迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防禽流感。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提`供一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，该方法制备得到的疫苗能预防H7N9型病毒的感染。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
提供一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤:
(1)禽流感工作种子批毒种的建立:将来自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接种11日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；
(2)病毒接种与培养:于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔接种稀释为10_5稀释度的H7N9禽流感工作种子批毒种，每胚0.1ml ;将鸡胚置33~35°C培养4(T60小时；挑选活胚置4°C冷胚15~20小时，收获病毒尿囊液；
(3)病毒灭活:将获得的病毒尿囊液中加入甲醛在2~8°C下灭活24~36小时；
(4)病毒收获液澄清与浓缩:将灭活后的尿囊液进行澄清过滤，即经10um滤膜粗滤后，再经0.45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为1000K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/l的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；
(5)病毒纯化:蔗糖速率区带离心:分别用33%和56%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度离心3小时；
(6)病毒裂解:纯化后的病毒液加入等量的终浓度为0.3^1.0%的Triton X-100，混匀后置20~25°C下作用2小时；
(7)再灭活:将步骤(6)制得的裂解液加入甲醛在2~8°C下灭活24~36小时；
(8)除糖除裂解剂:将步骤(6)制得的裂解物用相对分子质量为100K的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.01mol/1的PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度离心是在25000rpm/min的条件下离心f 3小时；
(9)除菌过滤:将步骤(8)制得的病毒纯化液用0.2um孔径的滤膜过滤即为单价原液；
(10)半成品配制:根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氢 氧化铝佐剂，混匀后于2(T25°C搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品。
[0007]步骤(5)中，病毒纯化的具体过程为:当区带离心转速达到3000rpm/min时，泵入病毒液、33%蔗糖及56%蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完毕，同时调节机器转速至25000rpm/min,离心 3 小时。
[0008]综上所述，本发明的制备方法制备的H7N9型流感疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。
【具体实施方式】
[0009]下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。
[0010]实施例1
本实施例的禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤:
将来自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接种11日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；将上述制得的H7N9禽流感工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10_5稀释度，接种于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔，病毒接种量为0.1ml/胚，将鸡胚置33°C培养40小时；挑选活胚置4°C冷胚15小时，收获病毒尿囊液；
将获得的病毒尿囊液中加入甲醛在2°C下灭活24小时；将灭活后的尿囊液进行澄清过滤，即经10 um滤膜粗滤后，再经0.45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为1000K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/1的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；
再分别用33%和56%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度离心3小时进行病毒纯化；其中，纯化的具体过程为:将空区带离心转头先放入离心机，选择区带离心功能并启动，当区带离心转速达到3000rpm时,打开离心机仓门，放上上样头,开始上样,从进样口的边孔以50ml/min的泵流速先后加入单型病毒液样品、33%蔗糖和56%蔗糖，其中33%蔗糖的加入量为病毒样品量的1/2，56%蔗糖的加入量为将区带离心转头加满使有少数液体从中孔留出为止，改变泵的方向，从中孔以相同速度加入PBS作为封闭液，上样完后，取出上样头，关闭仓门，离心开始。3h后，待离心转速降至3000rpm时，打开离心机仓门，并在出口处连接紫外分光光度检测仪测定病毒液流出的OD值；由于过滤浓缩后的病毒液中仍含有许多物质，随着病毒液的流出可以看到紫外分光仪OD值的变化。以OD值变化范围为单位收集病毒液，进行相应血凝效价、卵清蛋白含量、内毒素检测，以确定合适的用于制备流感裂解灭活疫苗的病毒液所对应的紫外分光仪OD值区间，同时记录单位时间出样的OD值进行检测，寻找规律用于今后大量生产时直接收集相应OD值区段的纯化病毒液。最后分区段收集病毒液并分别测定血凝效价、卵清蛋白含量、内毒素检测，收集血凝效价高，卵清蛋白含量和内毒素低的病毒液合并。
[0011]将上述纯化后的病毒液加入等量的终浓度为0.3%的Triton X-100,混匀后置20°C下作用2小时，再加入甲醛在2°C下灭活24小时，制得裂解液；将制得的裂解物用相对分子质量为100K的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.01mol/1的PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度离心是在25000rpm/min的条件下离心I小时，制得病毒纯化液；将病毒纯化液用0.2um孔径的滤膜过滤即为单价原液；根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氢氧化铝佐剂，混匀后于20°C搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品；将上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，冻干、真空压塞和轧盖， 制得冻干疫苗成品，并于2l°C冷库保存。
[0012]实施例2
本实施例的禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤:
将来自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接种11日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；将上述制得的H7N9禽流感工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10_5稀释度，接种于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔，病毒接种量为0.1ml/胚，将鸡胚置35°C培养60小时；挑选活胚置4°C冷胚20小时，收获病毒尿囊液；
将获得的病毒尿囊液中加入甲醛在8°C下灭活36小时；将灭活后的尿囊液进行澄清过滤，即经10 um滤膜粗滤后，再经0.45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为1000K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/1的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；
再分别用33%和56%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的离心速度离心3小时进行病毒纯化；其中，纯化的具体过程为:将空区带离心转头先放入离心机，选择区带离心功能并启动，当区带离心转速达到3000rpm时,打开离心机仓门，放上上样头,开始上样,从进样口的边孔以50ml/min的泵流速先后加入单型病毒液样品、33%蔗糖和56%蔗糖，其中33%蔗糖的加入量为病毒样品量的1/2，56%蔗糖的加入量为将区带离心转头加满使有少数液体从中孔留出为止，改变泵的方向，从中孔以相同速度加入PBS作为封闭液，上样完后，取出上样头，关闭仓门，离心开始。3h后，待离心转速降至3000rpm时，打开离心机仓门，并在出口处连接紫外分光光度检测仪测定病毒液流出的OD值；
由于过滤浓缩后的病毒液中仍含有许多物质，随着病毒液的流出可以看到紫外分光仪OD值的变化。以OD值变化范围为单位收集病毒液，进行相应血凝效价、卵清蛋白含量、内毒素检测，以确定合适的用于制备流感裂解灭活疫苗的病毒液所对应的紫外分光仪OD值区间，同时记录单位时间出样的OD值进行检测，寻找规律用于今后大量生产时直接收集相应OD值区段的纯化病毒液。最后分区段收集病毒液并分别测定血凝效价、卵清蛋白含量、内毒素检测，收集血凝效价高，卵清蛋白含量和内毒素低的病毒液合并。
[0013]将上述纯化后的病毒液加入等量的终浓度为1.0%的Triton X-100，混匀后置25°C下作用2小时，再加入甲醛在8°C下灭活36小时，制得裂解液；将制得的裂解物用相对分子质量为100K的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.01mol/1的PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度离心是在25000rpm/min的条件下离心3小时，制得病毒纯化液；将病毒纯化液用0.2um孔径的滤膜过滤即为单价原液；根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氢氧化铝佐剂，混匀后于25°C搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品；将上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，冻干、真空压塞和轧盖，制得冻干疫苗成品，并于2l°C冷库保存。
[0014]实施例3
本实施例的禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤:
将来自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接种11日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；将上述制得的H7N9禽流感工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10_5稀释度，接种于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔，病毒接种量为0.1ml/胚，将鸡胚置34°C培养50小时；挑选活胚置4°C冷胚17小时，收获病毒尿囊液；
将获得的病毒尿囊液中加入甲醛在5°C下灭活30小时；将灭活后的尿囊液进行澄清过滤，即经10 um滤膜粗滤后，再经0.45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为1000K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/1的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；`
再分别用33%和56%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的离心速度离心3小时进行病毒纯化；其中，纯化的具体过程为:将空区带离心转头先放入离心机，选择区带离心功能并启动，当区带离心转速达到3000rpm时,打开离心机仓门，放上上样头,开始上样,从进样口的边孔以50ml/min的泵流速先后加入单型病毒液样品、33%蔗糖和56%蔗糖，其中33%蔗糖的加入量为病毒样品量的1/2，56%蔗糖的加入量为将区带离心转头加满使有少数液体从中孔留出为止，改变泵的方向，从中孔以相同速度加入PBS作为封闭液，上样完后，取出上样头，关闭仓门，离心开始。3h后，待离心转速降至3000rpm时，打开离心机仓门，并在出口处连接紫外分光光度检测仪测定病毒液流出的OD值；
由于过滤浓缩后的病毒液中仍含有许多物质，随着病毒液的流出可以看到紫外分光仪OD值的变化。以OD值变化范围为单位收集病毒液，进行相应血凝效价、卵清蛋白含量、内毒素检测，以确定合适的用于制备流感裂解灭活疫苗的病毒液所对应的紫外分光仪OD值区间，同时记录单位时间出样的OD值进行检测，寻找规律用于今后大量生产时直接收集相应OD值区段的纯化病毒液。最后分区段收集病毒液并分别测定血凝效价、卵清蛋白含量、内毒素检测，收集血凝效价高，卵清蛋白含量和内毒素低的病毒液合并。
[0015]将上述纯化后的病毒液加入等量的终浓度为0.7%的Triton X-100,混匀后置23°C下作用2小时，再加入甲醛在5°C下灭活30小时，制得裂解液；将制得的裂解物用相对分子质量为IOOK的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.01mol/1的PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度离心是在25000rpm/min的条件下离心2小时，制得病毒纯化液；将病毒纯化液用0.2um孔径的滤膜过滤即为单价原液；根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氢氧化铝佐剂，混匀后于23°C搅拌吸附4小时，即为半成品H7N9禽流感病毒裂解疫苗，将上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，冻干、真空压塞和轧盖，制得冻干疫苗成品，并于2l°C冷库保存。
[0016]虽然结合具体实施例对本发明的【具体实施方式】进行了详细地描述，但并非是对本专利保护范围的限定。在权利要求书所限定的范围内，本领域的技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改或调整仍受本专利的保护。
【权利要求】
1.一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)禽流感工作种子批毒种的建立:将来自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接种11日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种； (2)病毒接种与培养:于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔接种稀释为10_5稀释度的H7N9禽流感工作种子批毒种，每胚0.1ml ;将鸡胚置33~35°C培养40飞0小时；挑选活胚置4°C冷胚15~20小时，收获病毒尿囊液； (3)病毒灭活:将获得的病毒尿囊液中加入甲醛在40°C下灭活24~36小时； (4)病毒收获液澄清与浓缩:将灭活后的尿囊液进行澄清过滤，即经10um滤膜粗滤后，再经0.45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为1000K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/l的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液； (5)病毒纯化:蔗糖速率区带离心:分别用33%和56%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度离心3小时； (6)病毒裂解:纯化后的病毒液加入等量的终浓度为0.3^1.0%的Triton X-100，混匀后置20~25°C下作用2小时； (7)再灭活:将步骤(6)制得的裂解液加入甲醛在2~8°C下灭活24~36小时； (8)除糖除裂解剂:将步骤(6)制得的裂解物用相对分子质量为100K的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.01mol/1的PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度离心是在25000`rpm/min的条件下离心f 3小时； (9)除菌过滤:将步骤(8)制得的病毒纯化液用0.2um孔径的滤膜过滤即为单价原液； (10)半成品配制:根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氢氧化铝佐剂，混匀后于2(T25°C搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于:步骤(5)中，病毒纯化的具体过程为:当区带离心转速达到3000rpm/min时,泵入病毒液、33%鹿糖及56%蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完毕，再调节机器转速至25000rpm/min，离心3小时。
【文档编号】A61K39/145GK103520716SQ201310401419
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】侯文礼, 冯晓 申请人:成都康华生物制品有限公司