一种副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗组合物及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，所述组合物包含七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，其氨基酸序列分别如SEQ?ID?NO:1-7所示。本发明从副猪嗜血杆菌(Haemophilus?parasuis，Hps)（菌种保藏编号：CVCC?3361）中分离得到多个新的具有免疫原性的蛋白，包括HbpA、afuA、oppA、oppA2、D15、Hps06257和nqrA，它们的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:8-14所示，分别编码531、346、545、513、417、263和448个氨基酸。这些基因的编码产物为新的具有免疫原性蛋白，其混合物对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力。本发明表达的重组副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白的混合物具有良好的安全性和保护效力，其免疫保护效果达到80%。
【专利说明】一种副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗组合物及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物传染病亚单位疫苗制备【技术领域】。具体涉及一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物及其制备方法和应用，所述组合物包含七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原。
【背景技术】
[0002]副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是一种革兰氏阴性菌,常定居于猪的上呼吸道，是一种条件致病菌，能够导致猪的副猪嗜血杆菌病。GlSsser在1910年首次报道该菌，因此该病又称为革拉瑟氏病(Glasser’s disease)。Hps只感染猪，能够影响2周龄到
4月龄的猪，发病常见于5~8周龄猪。发病率为10%~15%，严重时死亡率可达50%，给养猪业带来巨大损失，该病的主要特征为纤维素性胸膜炎、腹膜炎、关节炎、心包炎和脑膜炎。
[0003]蛋白质组学是一个旨在大规模、高通量、高效率地分离和鉴定构成生物体的蛋白质及其功能的新研究领域。因此蛋白质组学技术非常适用于免疫原及疫苗候选成分的筛选等方面的研究。疫苗是生物体抵抗病原微生物的有利武器，而具有保护作用的免疫原往往是理想的疫苗候选靶位。但传统研究方法存在低效、费时及不经济等诸多不利原因，使高效疫苗祀位的发现受到了一定程度限制。在这种情形下，免疫蛋白质组学(Immunoproteomic)随着蛋白质组学的出现也应运而生。免疫蛋白质组学将蛋白质组学技术鉴定蛋白质的高通量性与免疫学技术鉴定免疫原的可靠性有机地结合起来，在病原微生物、肿瘤免疫原和疫苗候选靶位的研究中占据着重要的地位，已经成为该研究领域中最具生命力的技术手段。
[0004]免疫蛋白质组学技术是一种有力的工具用于系统的鉴定病原的免疫原性蛋白，研究者们已经应用这项技术成功的从猪链球菌、炭疽芽苞杆菌、福氏志贺菌的亚组份结构中发现了新型抗原，如外膜蛋白。对于G_病原菌而言，分泌蛋白和外膜蛋白直接参与病原菌在宿主体内的定植、粘附、侵入过程，因此在细菌的感染过程中，分泌和外膜蛋白直接与宿主的免疫系统相互作用，发挥重要的功能。所以从G—菌的这些亚细胞组份中筛选重要的疫苗候选抗原是可行的。
[0005]本研究通过克隆、表达七种编码具有免疫蛋白的基因，并将纯化后的蛋白混合后免疫小鼠，发现其对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗开发的候选抗原。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供能够用于制备副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的候选抗原的蛋白及其编码基因。
[0007]本研究通过双向电泳和蛋白印迹法技术对副猪嗜血杆菌(Haemophi Iusparasuis, Hps)分泌蛋白质组进行分析，筛选出抗原性好、保护力强的抗原蛋白，以期为发展血清学诊断标记及新型亚单位疫苗的研发奠定坚实的基础。
[0008]本发明鉴定到具有免疫保护效果的七种蛋白，其混合物对小鼠感染副猪嗜血杆菌能提供有效的免疫保护力，可以作为副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗开发的候选抗原。
[0009]为了实现本发明目的，本发明首先分离副猪嗜血杆菌的胞外分泌蛋白，然后通过双向电泳方法分离分泌蛋白质组，并将其转移至硝酸纤维素膜上，使用猪的康复血清进行western-blot杂交寻找具有免疫原性的蛋白，然后通过质谱鉴定技术对具有免疫原性的蛋白进行质谱鉴定，再对其编码基因进行克隆表达，将表达的蛋白纯化后，再进行免疫原性分析，同时将七种蛋白混合后进行小鼠的免疫保护试验，结果表明其具有一定的免疫保护作用。
[0010]本发明同时保护一种制备七种蛋白的方法，所述方法包括培养含有蛋白编码序列的重组大肠杆菌，得到重组蛋白。所述制备重组蛋白的方法具体可为:将所述重组菌37°c培养3h，OD600 = 0.7时，加入IPTG至终浓度0.8 PM,转至37°C继续培养4h。
[0011]本发明的重组蛋白具有免疫保护活性。
[0012]本发明的重组蛋白混合物可以应用于副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗的制备。
[0013]更具体地，本发明提供以下各项:
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:左图为分泌蛋白的双向电泳分离图谱；右图为转膜后杂交图。
[0015]图2:七种蛋白转膜后杂交图。
[0016]图3-1:七种蛋白不同浓度混合免疫攻毒后小鼠存活率图。
[0017]图3-2:七种蛋白单独及IOOii g混合免疫攻毒后小鼠存活率图。`【具体实施方式】
[0018]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0019]实施例1、蛋白免疫原性的发现
[0020]一、分泌蛋白样品的制备
[0021]从_70°C冰箱取出Hps菌株,室温融化,然后划线接种于TSA(Becton, Dickinsonand Company)固体培养基(含10%的马血清，0.01%的NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸))，37°C培养36h,然后挑取单菌落接种于TSB (Becton, Dickinson and Company)液体培养基(不含马血清，含有0.02%的NAD)，37°C培养24h，然后以1%的菌液体积转接于500mL TSB液体培养基(不含马血清，含有0.02%的NAD)，37°C培养约16h小时，使菌液OD达到1.0。向细菌培养物加入蛋白酶抑制剂，4°C 5000g离心lh。取上清，用0.22 ii m的滤膜把残留的Hps滤去。向滤液中加入1/6体积预冷的100%三氯乙酸(TCA)，4°C静止30分钟用于沉淀滤液中的蛋白，之后4°C 12000g离心30分钟，收集沉淀，弃上清，然后用预冷的丙酮将沉淀洗涤三次，充分将TCA溶于丙酮中洗掉。最后得到的沉淀就是副猪嗜血杆菌的分泌蛋白，室温放置10分钟，使丙酮挥发完全，溶于适量裂解液(7M尿素，2M硫脲，4%Chaps)中。取出一小管进行蛋白浓度测定。
[0022]二、分泌蛋白样品的第一向等电聚焦(IEF)
[0023]取以上制备的分泌蛋白600 ii g用裂解液稀释至终体积250 ii L，用pH梯度为pH3~10的IPG胶条(Bio-Rad)进行等电聚焦，设置聚焦参数为:温度20°C ;最大电流
0.05mA/ 胶条，聚焦程序为:30V, 12h ；200V, Ih ；500V, Ih ；1000V,2h ；7000V,3h ；7000V 至50000Vh。
[0024]三、分泌蛋白样品的第二向SDS-PAGE电泳
[0025]用去离子水小心冲洗聚焦好的胶条上的覆盖油，然后进行平衡。第一次平衡:将胶条置于平衡缓冲液I (含6M尿素，75mMTris-HCl pH8.8，87%甘油，2% SDS, 0.2%溴酚蓝，
0.1g DTT/1OmL)中，水平摇床上室温孵育10分钟；用去离子水冲洗胶条4~5次。第二次平衡:将胶条置于平衡缓冲液II (含6M尿素，75mMTris-HCl pH8.8，87%甘油，2% SDS, 0.2%溴酚蓝，0.25g IAA/1OmL)中，水平摇床上孵育15分钟。用配好的I X SDS凝胶缓冲液润洗平衡好的胶条。将覆盖在丙稀酰胺凝胶上的水饱和正丁醇倒掉，并用去离子水小心冲洗凝胶表面。将平衡好的胶条小心放入凝胶的上层，立即加入融化了的0.5%的低熔点琼脂糖固定IPG胶条，避免在胶条和凝胶之间产生气泡。在电泳槽里加入电泳缓冲液，将凝胶玻璃板放入，加入上层缓冲液，然后盖上盖，设置温度12.5°C，电流IOmA/胶开始电泳。电泳Ih后，电流改为20mA/胶，直到溴酚蓝条带跑到凝胶最下端停止电泳。小心取出凝胶，进行染色。
[0026]四、分泌蛋白样品SDS-PAGE胶染色
[0027]1.固定:将电泳后的凝胶放入固定液(40%乙醇，10%乙酸，50%去离子水)中，固定过夜。
[0028]2.敏化:将固定液倒掉，加入10%冰乙酸，水平摇床上轻摇30分钟。
[0029]3.染色:将凝胶放入R-250染色液中，90°C加热30分钟.[0030]4.脱色:将染色液倒掉，加入10%冰乙酸，置于水平摇床上脱色，直到蛋白点清晰可见为止。`
[0031 ] 五、分泌蛋白样品的蛋白印迹法分析
[0032]将分泌蛋白样品的第二向SDS-PAGE胶按照常规的蛋白印迹法采用半干转方式进行转印。转印80分钟，按照0.8mA/cm2设定电流。转印结束后，PVDF膜(Pall Corparation)用丽春红染色，用针头标记若干个标记性的点，拍照保存。4°C封闭过夜，封闭液为5%的脱脂乳。PBST洗3次，每次10分钟。一抗为Hps猪康复血清(选取4-6周龄，ELISA抗体检测为阴性的健康仔猪，以5X 107CFU/mL Hps (CVCC3361)攻毒，饲养30天后，抽取存活仔猪的血液样品制备康复血清，实验室内分装、冻存)(1:200)，37°C孵育lh。PBST洗3次，每次10分钟。二抗为辣根过氧化酶HRP标记的兔抗猪二抗(Sigma) (1:5000)，37°C孵育lh。PBST洗3次，每次10分钟，最后化学发光显色试剂盒(天根生物有限公司)进行显色。根据事先的丽春红染色图片和针头标记的特征蛋白点，在对应的考马斯亮蓝染色的凝胶上找出对应的蛋白点。如图1，共找到9个发生免疫反应的蛋白。
[0033]六、质谱分析
[0034]将找出的蛋白点用剪过的200 U L枪头戳取下来，然后放入干净的离心管，做好标记，送往北京蛋白质组研究中心进行质谱分析。经鉴定3号点为Heme-binding proteinA(HbpA)，质量分数为 394，分子量为 59394Da。8 号点为 Iron (Fe3+)ABC superfamilyATP binding cassette transporter, binding protein (AfuA),质量分数为 667,分子量为 38595Da。5 号点为 Oligopeptide permease ABC transporter membrane protein(OppA),质量分数为 574,分子量为 60911Da。7 号点为 Oligopeptide permease ABCtransporter membrane protein (0ppA2)，质量分数为 572，分子量为 57851Da。6 号点为Na-translocating NADH-quinone reductase subunit A (nqrA)，质量分数为 175，分子量为48690Da。4号点为D15膜蛋白(D15)，质量分数为687，分子量为46873Da。9号点为HPS06257，质量分数为257，分子量为27981Da。
[0035]实施例2、七种蛋白的表达
[0036]一、Hps 总 DNA 的提取
[0037]将ImL Hps (CVCC 3361)的过夜培养菌液12000rpm离心I分钟，弃上清。在菌体沉淀中加入40uL DB液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，160 u L溶菌酶和8uL RNaseA0剧烈震荡，混合均匀。37°C温浴30~60分钟，不断颠倒离心管数次。MA 200 u L DLT液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)和25 u L蛋白酶K (TIANamp Bacteria DNA KU，天根生物有限公司)，立即温和地颠倒混匀。置65°C水浴中至少30分钟，不断颠倒离心管数次。WOOOrpm离心3~5分钟，用移液器吸取全部上清到一个干净的离心管中。加入200 u L无水乙醇，混匀后全部吸入吸附柱，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管中的液体，放回吸附柱。加入500u L Wl液(TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，静置I分钟，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管中的液体，放回吸附柱。加入500uL Wl液，12000rpm，离心30秒。倒掉收集管内的液体，放回吸附柱。12000rpm，离心I分钟。将吸附柱放入一个1.5mL离心管。在吸附膜中央加入100 U L Tl液(TIANampBacteria DNA Kit，天根生物有限公司)，65°C水浴5分钟，12000rpm离心I分钟。
[0038]二、七种蛋白编码基因的制备
[0039]根据7种蛋白编码基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:8_14所示)，设计引物对如下:
[0040]正反向引物的下划线部分为相应的酶切位点。
[0041]
【权利要求】
1.一种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，所述组合物包含七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原，所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1-7所示。
2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，其中编码所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的核酸序列分别如SEQ ID N0:8-14所示。
3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，其中在所述组合物中所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原的重量比为1:1:1:1:1:1:1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物，其用作针对副猪嗜血杆菌的疫苗。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物在制备针对副猪嗜血杆菌的疫苗中的用途。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物在制备用于预防由副猪嗜血杆菌引起的疾病的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述由副猪嗜血杆菌引起的疾病是副猪嗜血杆菌病。
8.一种制备副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物的方法，所述方法包括以下步骤: 分别构建、表达和纯化氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-7所示的七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原；以及 将经过纯化的所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原混合。
9.根据权利要求8所述的方 法，其中所述七种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原混合的比例按重量计为1:1:1:1:1:1:1。
【文档编号】A61P31/04GK103479996SQ201310406551
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】王春来, 李刚, 张艳禾, 谢芳 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所