一种月季花中提取抗脑缺血物质的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及月季花中提取抗脑缺血物质的方法及其应用，有效解决从月季花中提取抗脑缺血物质，实现月季花提取物在制备抗脑缺血药物中的应用，方法是，将月季花粉碎成药粉，用石油醚回流萃取1h脱脂；脱脂后的月季花药粉滤渣，挥去石油醚至干燥，得月季花粉；月季花粉用乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，提取液过滤，减压回收乙醇至无醇味，浓缩，浓缩液加蒸馏水分散成样品液；样品液上AB-8型大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，弃去水液；再用乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩至干粉，得月季花总黄酮；该月季花总黄酮有效用于制备抗脑缺血药物，本发明原料丰富，易制备，提取物具有抗脑缺血作用，有效用于制备抗脑缺血药物。
【专利说明】一种月季花中提取抗脑缺血物质的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药，特别是一种月季花中提取抗脑缺血物质的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]缺血性脑血管病属于中医“缺血中风”的范围，是由局部脑供血、供氧不足或中断引起的脑部局灶性功能障碍，常见的有短暂脑缺血发作、脑栓塞、脑血栓，是严重威胁人类生命健康的常见病多发病，更是导致死亡和能力丧失的主要疾病。缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)是指组织在遭受一定时间缺血,恢复血液供应后,组织损伤程度加重的病理现象。目前，药物对缺血性脑损伤的干预治疗已成为社会和医学界关注的重要研究课题，寻找有效的治疗药物来防治脑缺血的研究越来越得到重视。
[0003]既往在因于风、火、痰、瘀等的认识基础上，采用中医单一或多因的辨证论治，取得了一定的疗效，但进一步的疗效提高实在艰难。近年来，随着对传统毒邪认识的深化，中风病临床实践的发展和现代病理机制研究的深入，提出从毒论治中风病，从而提高中风病疗效，己成为中风病病因学及治疗学研究中新的视点与热点。刘氏等针对中风病中的毒邪而提出解毒护脑法，总结 的方法中有:祛瘀解毒法，祛瘀是解毒的基础，解毒有利于祛瘀。该法不仅适用于缺血性中风的治疗，而且治疗出血性中风临床也有良效；清热解毒法，热毒的产生与中风后体内瘀血、痰浊积滞久化热及阳腑实有关，因火盛化毒，毒性火热，故仍具有猛烈善变，易攻脏腑的特点，尤其是损坏脑质，甚至导致死亡，打破长期以来用“活血化瘀”为主的治则治疗本病；从而提出用清热解毒法治疗脑缺，不仅为治疗脑缺血增添了新的内容，同时也丰富了中风病的治疗方法，为中风病开辟了新的内容，提高了临床疗效，很有创新意义，不仅对中医临床具有重要的指导作用，而且必将有助于提高中风病的中医药综合治疗效果。
[0004]现代医学研究关于脑缺血的发生机制有能量代谢障碍、血小板聚集、血管收缩及微循环障碍、自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙离子超载、炎症损伤、NO和NOS的作用、细胞凋亡等，脑缺血损伤是由于脑部血液循环障碍，造成细胞能量代谢衰竭，从而启动的损伤级联反应的结果。该损伤级联反应涉及兴奋性氨基酸(EAA)毒性、梗死周围去极化、炎症和细胞凋亡等不同的阶段。现代医学防治脑缺血多采用药物性干预，临床可用于防治脑缺血的药物主要有抗血小板药的阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定和阿司匹林-双嘧达莫，抗凝剂的肝素、低分子肝素，口服抗凝剂的华法林、双香豆素针，溶栓的尿激酶(UK)、链激酶(SK)，血管扩张剂麦角溴烟酯，自由基清除剂超氧化物歧化酶、地塞米松、甘露醇、维生素E，钙拮抗剂尼莫地平，谷氨酸受体拮抗剂，NOS抑制剂及他汀类药物等，其中以阿司匹林抗血小板聚集的应用最多。很多文献报道这些药物有预防和治疗脑缺血作用，但是现有的药物由于价格较贵且给药方式受限、副作用多而不适宜反复应用或因用药时间长、给药剂量大等使应用受到了限制。因本病的特点多需较长时间用药，长期用药的不良反应、药物的价格、疗程的限制等都影响对脑缺血的治疗。
[0005]近些年来，国内外学者将目光投向天然药物(中药或中药制剂)的开发，中药治疗脑血管疾病的历史悠久，且中药具有副作用小等优点；中医学具有整体观念的特点，而中药又具有多成分、作用于多靶点的特征，从多条路径干预脑缺血，减轻脑缺血再灌注的损伤。对于脑缺血疾病，中医认为其发病机理与“瘀”关系最为密切，已有研究认为瘀阻脑络，积久蕴毒热毒的产生与中风后体内瘀血，痰浊积滞日久化热及阳腑实有关，热毒损及脑络，扰乱神明，因此建议使用以“活血化瘀、清热解毒”改善脑缺血损伤为主的治则来治疗本病。中医药利用“活血化瘀、清热解毒”方药治疗脑缺血都取得了较好的效果，得到了广泛的肯定，目前运用活血化瘀兼清热解毒中药防治脑缺血再灌注是新的观点，有临床应用可行性的预处理措施，为缺血性脑血管病的防治提供新的方法，运用“活血化瘀兼清热解毒”方药减轻脑缺血再灌注损伤的思路，具有较广阔的研究前景。
[0006]临床上常采用“活血化瘀”法治疗脑缺血，重在改善脑循环，保护神经细胞，清除自由基而达到治疗脑缺血损伤的效果；基于“热毒致卒中”的观点，提出“清热解毒”法治疗脑缺血疾病，清热解毒药重在减轻炎症反应，减少脑缺血的继发性反应。月季长期以来作为一种有良好活性但低毒性的抗肿瘤植物，在近20多年内受到国内外学者的关注。但直到目前，还没有发现其对脑缺血的任何报道，抗脑缺血具体活性成分还不明确，月季花醇提物中主要活性成分为总黄酮，又如何把月季花总黄酮提取出来，至于尚未见有公开报导。
【发明内容】
[0007]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种月季花中提取抗脑缺血物质的方法及其应用，可有效解决从月季花中提取抗脑缺血物质，实现月季花提取物在制备抗脑缺血药物中的应用。
[0008]本发明解决的技术方案是，将月季花粉碎成药粉，用石油醚回流萃取Ih脱脂；脱脂后的月季花药粉滤渣，挥去石油醚至干燥，得月季花粉；月季花粉用乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，得提取液，过滤，减压回收乙醇至无醇味，浓缩，浓缩液加蒸馏水分散成样品液；样品液上AB-8型大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，弃去水液；再用乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩至干粉，得月季花总黄酮(物质)；该月季花总黄酮(物质)有效用于制备抗脑缺血药物，实现月季花提取物在制备抗脑缺血药物中的应用。
[0009]本发明原料丰富，易制备，提取物具有抗脑缺血作用，有效用于制备抗脑缺血药物，开拓了月季花的新用途，提高了月季花的药用价值，是药物上的创新。`【具体实施方式】
[0010]以下结合具体情况，对本明的【具体实施方式】作详细说明。
[0011]本发明在具体实施中，是由以下具体方法实现的:将月季花粉碎成过60-80目筛的药粉，用10倍药粉重量的石油醚回流萃取Ih脱脂；脱脂后的月季花药粉滤渣，挥去石油醚至干燥，得月季花粉；月季花粉加10倍花粉重量、体积浓度为60%的乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，得提取液，过滤，减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度1.1-1.4的浓缩液，浓缩液加蒸馏水分散至相当于含生药量0.3g/ml的样品液；样品液上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水液；用3倍柱体积的、体积浓度为10%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用5倍柱体积的、体积浓度为80%的乙醇洗脱，收集体积浓度为80%的乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干粉，得月季花总黄酮(物质)，总黄酮含量>61%;该月季花总黄酮(物质)有效用于制备抗脑缺血药物，实现月季花提取物在制备抗脑缺血药物中的应用。
[0012]经实验研究，月季花总黄酮可显著提高小鼠常压及减压耐缺氧能力；对小鼠脑缺血、小鼠血瘀性脑缺血模型均有很好的改善作用，可改善血液流变学指标、改善脑部能量代谢；对小鼠脑缺血再灌注、大鼠脑缺血也有很好改善作用，可减轻脑组织损伤、改善脑组织能量代谢、改善炎性因子水平等。但抗脑缺血具体活性成分还不明确，月季花醇提物中主要活性成分为总黄酮。本课题通过观察月季花总黄酮对小鼠脑缺血再灌注模型、小鼠局灶性脑缺血再灌注模型、大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的影响，深入探讨其改善脑缺血再灌注损伤的药理作用，明确其药理活性成分，以期开发出一种降低脑缺血再灌注损伤作用的药物，亦为开发疗效优良的治疗脑缺血综合症药物奠定实验基础，有关实验资料如下:
[0013]月季花总黄酮对小鼠脑缺血再灌注模型的影响
[0014]I实验材料
[0015]1.1实验药物
[0016]本发明月季花总黄酮；尼莫地平片，山东新华制药股份有限公司生产，批号1205036 ;脑络通胶囊，哈药集团三精制药四厂有限公司生产，批号201209002。
[0017]1.2实验试剂
[0018]青霉素，由哈药集团 制药总厂生产，批号20120507 ;氯化钠注射液，由郑州永和制药有限公司生产，批号11072121 ;水合氯醛，由上海山浦化工有限公司生产，批号20120406 ;甲醛溶液，由天津市科密欧化学试剂有限公司生产，批号20120701 ;羧甲基纤维素钠，由天津市恒兴化学试剂制造有限公司生产，批号20060728 ;乙醇(医用酒精)，由新乡市三伟消毒制剂有限公司生产，批号20110405 ;考马斯亮蓝测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产，批号20120914 ;乳酸(LD)试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产，批号20120914 ;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产，批号20120914 ;三磷酸腺苷(ATP)酶试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产，批号20120914。
[0019]1.3 仪器
[0020]UV - 2000紫外可见分光光度计，由尤尼柯(上海)仪器有限公司生产；TGL_16G台式离心机，由上海安亭科学仪器厂生产JA1103N电子分析天平，由奥豪斯(上海)公司生产；DZKW-4型电子恒温水浴锅，由北京永光明医疗仪器厂生产；可调式移液器，由上海雷勃分析仪器有限公司生产；超声波清洗器，由上海科导超声仪器有限公司生产；玻璃匀浆器，由郑州玻璃仪器厂生产。
[0021]1.4实验动物
[0022]昆明种小鼠，清洁级，雄性，体重25_30g，河北省实验动物中心提供，本批小鼠合格证号:1209020。
[0023]2实验方法
[0024]2.1造模与给药
[0025]取体重为27_30g的KM小鼠105只，雄性，随即均匀分为7组，即:假手术组，模型组，尼莫地平组，脑络通组，月季花总黄酮大、中、小剂量组，每组15只。尼莫地平组(阳性对照药，给药剂量为30mg/kg，临用前用0.5%CMC配成药物浓度3mg/ml，0.lml/10g,临床用量的15倍)；脑络通胶囊组(阳性对照药，给药剂量为750mg/kg，临用前用0.5%CMC配成药物浓度75mg/ml，0.lml/10g，临床用量的15倍)；月季花总黄酮大、中、小剂量组(300mg/kg、150mg/kg、75mg/kg,临用前用 0.5%CMC 配成药物浓度 30mg/ml、15mg/ml、7.5mg/ml,
0.lml/10g);假手术组、模型组(灌服同体积0.5%CMC)，每天给药I次，连续给药7d。
[0026]于第6d晚上8点开始分批禁食不禁水，12h后，分批称重给药，Ih后，用5%水合氯醛(0.06ml/10g)腹腔注射麻醉(小鼠的翻正反射消失)，用酒精颈部消毒，然后用手术刀作颈部正中切口，逐渐分离周围肌肉，直到见到双侧颈总动脉(CCA)，再用弯头精密镊剥离周围神经，分离CCA,用微血管夹夹闭颈总动脉IOmin,恢复灌流IOmin,再夹闭IOmin,恢复供血，创伤口处敷撒青霉素粉，缝合颈部伤口。空白组作假手术处理，即除了不阻断CCA外，其它操作同造模组。
[0027]2.2检测指标和测定方法
[0028]2.2.1检测指标
[0029]所有小鼠再灌注24h后，脱颈椎处死，迅速取脑，矢状切取一半放入10%福尔马林液中，固定一周，石蜡包埋，作HE染色；另一半用生理盐水冲洗上面的血迹，再用滤纸上吸干净上面的生理盐水，准确称量其重量，根据此重计算该加入的冰冷的生理盐水量，以生理盐水(ml):脑组织(g)=9: I的比例在盛有冰块的大烧杯用玻璃匀浆器制成10%的脑匀浆，4°C,3000r/min离心IOmin,取上清液于_20°C以下低温保存,分别按试剂盒说明书测定脑匀浆中蛋白含量、LD、LDH、ATP酶水平。
[0030]2.2.2考马斯亮兰蛋白的测定方法
[0031]考马斯亮兰蛋白测定 操作程序
[0032]
【权利要求】
1.一种月季花中提取抗脑缺血物质的方法，其特征在于，将月季花粉碎成过60-80目筛的药粉，用10倍药粉重量的石油醚回流萃取Ih脱脂；脱脂后的月季花药粉滤渣，挥去石油醚至干燥，得月季花粉；月季花粉加10倍花粉重量、体积浓度为60%的乙醇浸泡0.5h，回流提取2次，每次lh，得提取液，过滤，减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度1.1-1.4的浓缩液，浓缩液加蒸馏水分散至相当于含生药量0.3g/ml的样品液；样品液上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水液；用3倍柱体积的、体积浓度为10%的乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用5倍柱体积的、体积浓度为80%的乙醇洗脱，收集体积浓度为80%的乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至干粉，得月季花总黄酮。
2.权利要求1所述方法提`取的月季花总黄酮在制备抗脑缺血药物中的应用。
【文档编号】A61K133/00GK103432240SQ201310420423
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月14日 优先权日:2013年9月14日
【发明者】苗明三, 方晓艳 申请人:河南中医学院