一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗及其制备方法，该二联三价活疫苗由抗原和冻干保护剂组成，其中抗原包括保藏编号为：CCTCC-V201320的鸡肾型传染性支气管炎病毒K136株、鸡呼吸型传染性支气管炎病毒H120株以及鸡新城疫病毒La?Sota株。在制备抗原时优选K136株和La?Sota株同胚接种，H120株单独接种的模式，在此基础上将培养产物按比例混合制成抗原后加入冻干保护剂冻干即得疫苗产品。本发明制备的二联三价疫苗可同时预防鸡新城疫和鸡传染性支气管炎病，有效解决了现有疫苗对肾型IB只能提供部分保护或根本不保护的问题，达到了一针两防的目的。
【专利说明】一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗及制备方法
【技术领域】[0001]本发明属于畜禽用生物新医药【技术领域】，尤其是涉及一种鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联三价活疫苗及其制备方法。【背景技术】[0002]传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属，能引起一种鸡急性、高度接触性呼吸道传染病，其临床症状主要表现为病鸡呼吸困难、发出罗音、咳嗽、张口呼吸、打喷嚏等，死亡率一般很低，但对各种日龄、性别的鸡均易感染。幼雏鸡感染后常引起输卵管永久性退化；成年肉鸡感染后通常会引起饲料报酬降低、死淘率上升；产蛋鸡感染后通常表会导致产蛋量降低、蛋的品质下降。另外，该病经常并发或继发大肠杆菌葡萄球菌、或霉形体感染，使死亡率大大增加，对养鸡业造成严重危害。[0003]鸡传染性支气管炎呈世界性分布，但对IBV致病型的划分目前尚没有明确标准， 主要是根据病毒对组织的亲嗜性、损害的主要器官和引起的临床症状来确定，其中包括呼吸型、生殖道型、肾型、肠型、腺胃型和变异型等，不同国家和不同地区IBV具有较为显著的地域差异，我国的鸡传染性支气管炎主要为呼吸型和肾型，目前在我国用于预防呼吸型IBV 的疫苗株主要包括H120株、M41株等；用于预防肾型IBV的疫苗株主要包括W93株、Ma5株坐寸ο[0004]鸡新城疫病毒(NDV)属于副粘病毒科副黏病毒属，能引起一种鸡的高度接触性、急性、烈性传染病。其病程中常呈现败血症，主要临床特征表现为病鸡呼吸困难，下痢，神经机能紊乱，黏膜和浆膜出血等。各品种鸡和各种年龄的鸡都能感染，幼鸡和中鸡更易感染，死亡率极高，常对禽养殖业造成毁灭性打击。新城疫病毒只有一个血清型，但不同亚群和毒株在毒力、抗原性和致病性等方面存在着明显的差异，这种差异虽然不足于造成免疫失败， 但有可能使一些致病毒株在免疫鸡群持续存在，给鸡养殖业带来安全隐患，长期的生产实践证明新城疫La Sota株疫苗对在我国流行的鸡新城疫病毒有特异、广谱的防治效果。[0005]随着对这两种疾病研究的不断深入，防控措施也得到不断完善，特别是相应疫苗的成功运用，使得这两种疾病在一定程度上得到了有效控制。但是，在实际生产过程中，IB 并未得到有效控制，免疫失败的现象时有发生，其主要原因在于IBV基因组易发生点突变、 基因缺失、插入及重组，导致新的血清型和基因型病毒不断出现，据报道，全世界已有30多个血清型,传染性支气管炎病毒血清型众多,这给免疫带来了很大的困难,单一血清型疫苗只能对同型的传染性支气管炎病毒产生免疫力，而对其他型的传染性支气管炎病毒只能提供部分保护或根本不保护，如传统的H52、H120、M41等毒株制备的疫苗对很多地方流行的传染性支气管炎病毒已经不能提供保护作用。迄今为止，市面上一直没有交叉保护力好的传染性支气管炎疫苗，肾型IB几乎得不到控制，目前国内外用于预防肾型传染性支气管炎疫苗的研究较多，但获得的以W93株为代表肾型经典毒株也随着病毒的变异逐渐丧失了对肾型IB的保护，且这些毒株的副反应较大，已经不适合对我国的流行株的防治，因此筛选获得新的具有能有效防治肾型IB的毒株，用于制备多联疫苗就显得尤为重要。与IBV不同的是NDV血清型相对固定，目前我国新城疫预防常用I系、II系、III系等新城疫疫苗，其中La Sota株疫苗对ND的防治效果相对较好，在广谱性上具备一定的优势，尤其是La Sota株疫苗在接种时受母源抗体的影响较低，同时在混合感染时一般不受IBV或其它病毒的干扰，因此常成为多联疫苗制备过程中的最佳选择。
[0006]在我国已有大量关于IBV和NDV 二联疫苗的研究报道，但其中极少有关于二联三价疫苗的制备方法的研究，针对肾型IBV和NDV 二联三价疫苗的研究更是少之又少。2006年，崔保安(专利申请号:200610018069.2)利用IBV的呼吸型M41株、肾型HN99株以及NDV的La Sota株成功制备了 IB/ND 二联三价灭活疫苗，但是其是利用甲醛灭活生产的灭活疫苗，其制剂存在着传统灭活疫苗的固有不足，免疫效果较差；2012年，宋新宇(专利申请号:201210594755.X)利用IBV的腺胃型YB160株、呼吸型H120株以及NDV的La Sota株制备了 IB/ND 二联三价活疫苗，其制品充分发挥了活疫苗的优势，成功的对目前中国流行的腺胃型、呼吸型鸡传染性支气管炎病毒的攻击和新城疫病毒的攻击提供了良好的免疫保护力，但是由于鸡传染性支气管炎存在不同型疫苗之间交叉保护力差的特性，所以该制品对鸡肾型IB的保护能力仍无能为力。为满足我国对肾型IB防治的需要，筛选获得新的具有良好保护力的肾型IBV弱毒并用于制备多联活疫苗就成为当务之急。
[0007]传统的多联疫苗的制备过程中，常采用将不同病毒分别接种并扩大培养的模式来制备抗原，在现有的IB/ND 二联三价疫苗的制备工艺中沿用了这种抗原制备模式，其往往存在工艺繁琐、成本高、易污染、不同批次间效价不稳定等问题。在本发明中，我们将IBV、NDV采用同胚接种繁育，可达到操作简便，污染率低，节约劳动力等目的。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是 提供一种可预防鸡新城疫、肾型和呼吸型传染性支气管炎的二联三价活疫苗，即利用经典的新城疫病毒La Sota株、鸡传染性支气管炎呼吸型H120株、以及本发明人自己分离的肾型鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株K136株作为抗原制备活疫苗，本发明的疫苗能有效防治我国目前流行的肾型、呼吸型鸡传染性支气管炎和新城疫，实现一针两防。
[0009]本发明的目的还在于提供上述一种可预防鸡新城疫、肾型和呼吸型传染性支气管炎的二联三价活疫苗的制备方法，即将鸡新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒K136株同胚接种SPF鸡胚，鸡传染性支气管炎病毒H120株单独接种鸡胚，将大量扩增的三种病毒液按比例混合后加入冻干保护剂制成。
[0010]为实现本发明的上述目的，所采用的技术方案如下:
[0011]一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗，该活疫苗由抗原和冻干保护剂组成，所述抗原包括鸡肾型传染性支气管炎病毒、鸡呼吸型传染性支气管炎病毒以及鸡新城疫病毒。所述冻干保护剂其成分包括10%蔗糖和5%脱脂乳。
[0012]在上述二联三价活疫苗中，所述抗原中包括的鸡肾型传染性支气管炎病毒是指保藏编号为CCTCC-V201320的K136株；所述抗原中包括的鸡呼吸型传染性支气管炎病毒是指H120株；所述抗原中包括的鸡新城疫病毒是指La Sota株。
[0013]鸡新城疫病毒La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒H120株均是经典的疫苗抗原，用其制备的疫苗对我国流行的新城疫和鸡呼吸型传染性支气管炎有良好的防治效果。抗原中包括的K136株病毒是由发明人针对我国目前流行的鸡肾型传染性支气管炎病毒连续鸡胚传代136代致弱的，其有效的克服了经典肾型毒株W93株在疫苗制备过程中副反应大、不适合我国流行株防治的缺点，本发明中用K136株做抗原制备疫苗尚属首次。[0014]本发明还提供了一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗的制备方法，所述制备方法的特征是在于将鸡新城疫La Sota株和传染性支气管炎K136株或传染性支气管炎H120株同胚扩大培养后，与单独扩大培养的传染性支气管炎H120株或传染性支气管炎K136株按比例混合制备成抗原，再将抗原与冻干保护剂按比例混合进行冷冻干燥后制备成疫苗。在制备抗原的过程中，优选将鸡新城疫La Sota株和传染性支气管炎K136株同胚接种鸡胚培养，将传染性支气管炎H120株单独接种鸡胚扩大培养。[0015]一种上述二联三价活疫苗的制备方法，其中包括以下步骤:[0016]I)将NDV-La Sota株和IBV-K136或IBV-H120积混合经尿囊腔接种鸡胚，进行病毒扩大培养；[0017]2)将IBV-H120株或IBV-K136株经尿囊腔单独接种鸡胚，进行病毒扩大培养；[0018]3)分别收获上述两种病毒扩大培养液，经无菌处理并进行病毒含量测定后，等体积混合均匀制备成本发明疫苗的抗原；[0019]4)将疫苗抗原与冻干保护剂等体积混合均匀后冻干，制备成本发明中的疫苗。[0020]上述制备方法具体包括以下步骤:[0021]I)将La Sota株和K136株或H120株分别用生理盐水稀释100-1000倍等体积混合后，接种10日龄鸡胚，收集72小时后死亡的鸡胚胚液作为病毒扩大培养液I ;[0022]2)同时将H120株或K136株用生理盐水稀释50-100倍，单独接种10日龄鸡胚， 37°C孵育50-60小时后收获全部鸡胚胚液作为病毒扩大培养液II ；[0023]3)其次对收获的病毒扩大培养液I和II分别进行无菌处理并分别测病毒含量后， 将两种病毒扩大培养液I和II按照体积比1:1混合作为本发明疫苗的抗原，即为半成品；[0024]4)将疫苗 抗原与冻干保护剂按照体积比1:1进行配比，经冷冻干燥后36_48h后即得疫苗，即为成品。[0025]本发明制备的二联三价疫苗可同时预防鸡新城疫和鸡传染性支气管炎病，实现了一针两防的目的，尤其是IBV肾型株K136株的成功分离、减毒和使用，显著提升了我国鸡肾型传染性支气管炎的防治几率，符合当前我国鸡肾型传染性支气管炎的防治需求，而且有效克服了现有鸡肾型传染性支气管炎病毒作为抗原生产的疫苗制品所产生的副作用。【具体实施方式】[0026]为能进一步说明本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。[0027]实施例1:鸡传染性支气管炎肾型株K136株的筛选[0028]本公司从2003年-2005年分别在我国不同鸡场采集疑似鸡传染性支气管炎病毒分离毒株。病鸡主要表现为精神不振、咳嗽，常听到呼噜声，病理剖检发现除气管环有小出血点外肾脏还有明显病变，经过初步鉴定获得4株肾型传染性支气管炎病毒毒株，分别命名为 CK/IBV/QD03 株、CK/IBV/ZC03 株、CK/IBV/YT04 株和 CK/IBV/SD05 株。使用 10 曰龄SPF鸡胚对四株毒株进行连续传代致弱，每代通过尿囊腔接种4枚鸡胚，37°C孵育，接种后36h冻死鸡胚，收获尿囊液用于下一代接种，连传至136代。期间进行致弱评价，其评价方法是取第 2、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、124、128、132、134、136、140 代的毒株感染I日龄雏鸡，观察雏鸡发病情况。
[0029]结果见表1:
[0030]表14种分离株不同代次对SPF鸡的致病结果
[0031]
【权利要求】
1.一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗，该活疫苗由抗原和冻干保护剂组成，其特征在于所述抗原包括鸡肾型传染性支气管炎病毒、鸡呼吸型传染性支气管炎病毒以及鸡新城疫病毒。
2.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的鸡肾型传染性支气管炎病毒是指保藏编号为CCTCC-V201320的K136株；所述抗原中包括的鸡呼吸型传染性支气管炎病毒是指H120株；所述抗原中包括的鸡新城疫病毒是指La Sota株。
3.根据权利要求1或2所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒是由发明人针对我国目前流行的鸡肾型传染性支气管炎病毒连续鸡胚传代136代致弱获得的。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒在传代致弱评价中，传至第80代病毒株受试鸡开始无死亡，第100代病毒株受试鸡开始无眼观病变，第120代病毒株受试鸡开始无组织学病变。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种鸡传染性支气管炎二价活疫苗，其特征在于所述抗原中包括的K136株病毒在免疫评价中，传至第136代病毒株免疫组分毒率为0/10，对照组分毒率为10/10。
6.一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗的制备方法，其特征是在于将鸡新城疫La Sota株和传染性支气管炎K136株或传染性支气管炎H120株同胚接种鸡胚扩大培养后，与单独接种鸡胚扩大培养的传染性支气管炎H120株或传染性支气管炎K136株按比例混合制备成抗原，再将抗原与冻干保护剂按比例混合进行冷冻干燥后制备成疫苗。
7.根据权利要求6所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤:1)将NDV-LaSota株和IBV-K136或IBV-H120积混合经尿囊腔接种鸡胚，进行病毒扩大培养；2)将IBV-H120株或IBV-K136株经尿囊腔单独接种鸡胚，进行病毒扩大培养；3)分别收获上述两种病毒扩大培养液，经无菌处理并进行病毒含量测定后，等体积混合均匀制备成本发明疫苗的抗原；4)将疫苗抗原与冻干保护剂等体积混合均匀后冻干，制备成本发明中的疫苗。
8.根据权利要求6或7所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗的制备方法，其特征在于在制备抗原的过程中，优选将鸡新城疫La Sota株和传染性支气管炎K136株同胚接种鸡胚培养，将传染性支气管炎H120株单独接种鸡胚扩大培养。
9.根据权利要求6或7所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗的制备方法，其特征在于在抗原制备过程中两种病毒的扩大培养液是等体积混合的。
10.根据权利要求6或7所述的一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联三价活疫苗的制备方法，其特征在于在疫苗制备过程中抗原和冻干保护剂是等体积混合的。
【文档编号】A61K39/215GK103599533SQ201310438190
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】陈冰, 何召庆, 杨保收, 孙美玉, 邢婧珉, 李云霞, 梁武, 李守军 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司