包含重组组织型纤溶酶原激活剂的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种包含重组组织型纤溶酶原激活剂的药物组合物；包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白。该蛋白从N端到C端依次包含人TNK-tPA、柔性肽接头和人IgG天然或变体Fc。该融合蛋白具有与人TNK-tPA类似的体外和体内生物学活性，以及大大延长的血浆半衰期。
【专利说明】包含重组组织型纤溶酶原激活剂的药物组合物
【技术领域】[0001]本发明涉及分子医学领域，更具体地，本发明涉及一种重组长效组织型纤溶酶原激活剂突变体TNK-tPA的Fe融合蛋白，另一方面涉及所述融合蛋白的制备工艺及其在医疗上的应用，特别是在治疗急性心肌梗塞、急性肺栓塞、急性缺血性脑卒中等多种与需要血栓快速溶解相关的疾病以及它在与人类血液或组织接触的医疗器械或生物医学材料表面的涂层药物方面的新用途。
【背景技术】
[0002]组织型纤溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator, tPA)是纤溶酶原激活剂的一种，主要由血管内皮细胞合成和释放，它是一种丝氨酸蛋白酶，主要存在于哺乳动物血浆中。tPA高效特异的与血栓中的纤维蛋白结合，所产生的tPA-纤维蛋白复合物能快速高效地激活血凝块中的纤溶酶原，产生纤溶酶，使纤维蛋白降解成可溶性产物，达到血栓溶解且栓塞的血管重新畅通的目的。tPA于1987年由美国FDA批准作为治疗急性心肌梗塞的基因工程药物投放市场，1990年FDA批准其用于治疗急性肺栓塞。1996年，再被批准用于急性缺血性脑卒中，tPA是目前治疗卒中的唯一急救药物。
[0003]成熟的tPA分子是含527个氨基酸的单链糖蛋白，分子量67~72KD，包含17对二硫键。在溶纤过程中，tPA分子在Arg275-1le276位点被蛋白酶切割，形成活性更高的双链分子，N端275个氨基酸残基形成重链，C端252个氨基酸形成轻链，轻、重链之间由一个二硫键相连。重链含4个结构域，分别为指区(Finger，F)、生长因子区(EGF)、主区I(Kringlel, Kl)、主区2 (Kringle2, K2) ;F区位于4_50位氨基酸序列,含纤维蛋白结合位点(高亲和力结合功能域)；EGF区位于51-87位氨基酸序列，含细胞膜受体结合位点，该区介导t-PA与肝细胞和血管内皮细胞结合，对半衰期有重要影响；K1区位于87-176位氨基酸序列，为受体结合部位或与纤维蛋白低亲和结合有关的结构；K2区位于176-262位氨基酸序列，其与Kl区功能相似,含纤维蛋白结合位点；轻链含丝氨酸蛋白酶结构域(serineprotease, Ser Pr区)，由His322、Asp371和Ser478组成活性中心，催化纤溶酶原转化成纤溶酶。
[0004]tPA最大特点是与纤维蛋白特异的高亲和力结合，与纤维蛋白结合的tPA其激活纤溶酶原的能力比游离状态的tPA高100倍。因正常人血液中极少有纤维蛋白生成，tPA不会使正常人发生系统性纤溶状态。正是由于tPA的高效、特异溶栓作用，是早期利用基因工程技术开发的首批生物药之一，也是到目前为止治疗栓塞性疾病的理想药物。但tPA用于溶纤治疗也有一定的局限性。一方面它进入血液后能与纤溶酶原激活剂抑制剂(Plasminogen activator inhibitor,PAI)形成复合物,导致其迅速失去活性；另一方面存在于肝细胞膜上的tPA特异性受体可快速与tPA结合，致使tPA在血液中的半衰期很短，仅为4~6分钟。因此，tPA的治疗剂量高达100~150mg，这样就增加了由系统性纤溶引起出血的风险。
[0005]近年来，研究人员从tPA的结构入手，以构效关系为原则，利用DNA重组及蛋白质工程技术构建了一系列tPA变异体,如瑞替普酶(reteplase)、孟替普酶(monteplase)、兰替普酶(Ianoteplase)、帕米普酶(pamiteplase)等，它们在延长其体内半衰期、增加与纤维蛋白的结合亲和力及提高对纤溶酶原的催化活性等方面均有较大改善，较之天然tPA有更广阔的应用前景。其中，TNK-tPA (TNKase)是由美国基因泰克公司研制开发的tPA多点突变体，于2000年被美国FDA批准用于治疗急性心肌梗塞。此突变体综合了提高tPA与血纤维蛋白结合专一性和降低对PA1-1结合敏感性的KHRR296-299AAAA突变(K)，降低体内清除速率、延长半衰期的Thrl03Asn突变(T)和缺乏高甘露糖侧链的Asnll7Gln突变(N) (KeytB A, Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:3670-3674)。TNK-tPA 具有许多优良特性如半衰期延长(约15~19分钟)，仅需单次弹丸式静脉注射给药，与纤维蛋白特异性结合增加14倍；与PA1-1特异性结合降低80倍，几乎不影响机体凝血系统，内在致血栓作用小于其他纤溶酶原激活剂等(Cohen M，Am J Emerg Med, 2004, 22:14-23)。这决定了其血管再通更迅速、更持久，血栓溶解作用更强、更完全，对富含血小板的血栓作用更明显。
[0006]通常认为，延长溶栓药物的半衰期，对于有出血倾向的患者可能会导致其出血风险增加。然而TNKase的安全性由ASSENT2 (新溶栓剂安全性和有效性评估)得到了确认。这是一项国际性研究，16919例病人、在发生胸痛6小时内接受单一制剂TNKase或tPA的加速输入，比较30天死亡率。研究结果显示,两组病人的30天死亡率相似(TNKase组和tPA组均为6.2%)。脑出血的发生率也相似(颅内出血均为0.9% )，中风(tPA组1.7%;TNKase组1.8%)。用TNKase治疗的病人非颅内大出血并发症和tPA分别为4.7%比5.9%。这说明TNKase延长的半衰期并未增加患者的脑出血及中风发生率。半衰期延长的tPA变体在临床上应用更方便、高效、减少用药剂量且不增加出血风险。
[0007]此外，tPA还存在治疗时间窗短的问题，最重要的原因是其溶栓率低。制约急性脑缺血溶栓治疗效果及溶栓治疗得以广泛开展的关键问题是溶栓后脑出血。
[0008]脑缺血溶栓治疗时间窗是脑缺血开始发病至开始治疗的时限，超过这一时限，tPA等溶栓药物不但无效，反而会增加出血的风险性。超过3小时(尤其是累及到豆纹动脉一因豆纹动脉是终末分支，缺 乏侧枝循环，脑血管壁因缺血而易受损)的脑缺血再灌注后，脑出血的危险性大大增加。作为第二代溶栓药物的代表，在脑梗死发病3小时以内，用tPA经静脉内溶栓已得到国际上的普遍认可，而最近一项分析证实在卒中首发症状出现4.5小时内使用tPA仍是安全和有效的，从而使tPA溶栓时间窗从3小时延长至4.5小时，但还有更令人鼓舞的消息:TNKase用于缺血性卒中患者6小时时间窗的小样本RCT研究显不与标准剂量tPA(0.9mg / kg)相比，TNKase治疗(0.1mg / kg或者0.25mg / kg)的患者再灌注率更高(P=0.004)，临床改善更显著(P〈0.001)，大剂量TNKase组所有疗效终点指标均优于低剂量TNKase组和tPA组，并且不增加症状性颅内出血和其他不良事件的发生率。如果TNKase的疗效在大样本的RCT研究中得到进一步证实，将很可能取代tPA从而将急性卒中治疗的时间窗进一步延长到6小时。
[0009]此外，其他溶栓药物相对于tPA，半衰期和治疗时间窗也均有延长，如尿激酶半衰期为13~20分钟，其治疗急性缺血性卒中的时间窗为6小时。从吸血蝙蝠唾液中提取的一种新型纤溶酶原激活物去氨普酶拥有长达约4小时的半衰期，德国科学家一系列研究有望使其溶栓时间窗增宽至9小时。半衰期长的药物，一次给药后，药物浓度可以在长时间维持在有效浓度范围内发挥疗效。可从现有经验可推知，溶栓药物的半衰期延长，其对应的治疗时间窗也相应拓宽。然而，在我国的临床工作中，只有少数病人能在发病几小时内接受溶栓治疗，即使发达国家也不超过脑缺血患者的10%。因而研制半衰期长、治疗时间窗更宽的新型溶栓药物是十分必要的。
[0010]IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天，而Fe片段是IgG保持体内很长半衰期的最主要原因，同时还具有稳定蛋白的作用。大量文献报道将目的蛋白与Fe段融合后并不影响其生物学活性且获得了延长的半衰期(参见，如 Capon 等人，Nature, 337:525-531,1989 ；Chamow 等人，Trends Biotechnol.，14:52-60,1996 ;美国专利N0.5，116，964和5，541，087)。然而，这对tPA而言并非是顺理成章的结果，黄庆生等(军事医学科学院，2001年，博士后论文)将tPA与IgGlFc段融合，预期提高tPA在体内半衰期，但实验结果令人遗憾，二者的融合导致tPA活性的丧失，分析原因可能是Fe段与tPA融合后影响了 tPA的正确折叠，从而使其失去活性。tPA是一个拥有17对二硫键、五个结构功能域的丝氨酸蛋白酶，位于轻链的丝氨酸蛋白酶结构域(Ser Pr)与重链的4个结构域通过一对二硫键相连。靠近C-末端的丝氨酸蛋白酶结构域(Ser Pr)由His322、Asp371和Ser478组成活性中心，可专一性裂解纤溶酶原Arg560_Val561处肽键，将其转化为纤溶酶，tPA与纤维蛋白结合后，其活性将显著增加，这受Fl结构域和C-末端K2区的影响，可见这五个结构域对于tPA的生物活性和特异性结合是相互关联的。早期的研究结果证实，tPA的空间结构较为复杂也是比较脆弱的，蛋白翻译后能否正确折叠，形成有活性的空间构象对于tPA的酶活性是十分关键的。tPA的C-末端的丝氨酸结构域以及与其活性相关的其它结构域如Fl和K2区对其保持酶活性都是举足轻重的。换言之，tPA的C端的氨基酸与其功能密切相关，故对tPA进行基因工程改造时通常避开C端，也不宜将tPA的C-末端与其他蛋白进行融合。因而，tPA作为一种丝氨酸蛋白酶，位于C-末端的催化活性中心对维持其生物活性是必须的，因此在构建TNK-tPA的Fe融合蛋白时必需要预先考虑到如何克服因C-末端连接Fe段带来的 空间位阻效应而导致其活性丧失的后果。
[0011]由于在一级结构上位于活性中心的三个氨基酸相对靠近全长TNKase序列的C-末端，特别是478位的丝氨酸位点，这使得TNK-tPA的Fe融合蛋白的构建有其本质上的困难。迄今为止尚没有关于TNK-tPA融合蛋白的研究报道，且其他蛋白酶的Fe融合体也尚未有被批准用于临床的先例。目前研究进展最快的两个蛋白酶类Fe融合蛋白，即凝血因子VII和凝血因子IX也还处于临床研究阶段。因此，TNK-tPA的Fe融合蛋白的构建与表达及其生产工艺研究是一项具有前瞻性和开创性的工作，有望进一步延长tPA变体在体内的半衰期且可能获得拓宽的治疗时间窗。
[0012]虽然，早在20世纪80年代中期，我国就有研究机构用基因工程方法开发重组天然tPA，但至今没有动物细胞表达生产的重组天然tPA或TNK-tPA的国产药品上市。国内上市的第一代重组天然tPA类产品，完全依赖进口，商品名“爱通立”，50mg /支，售价高达5717元。而采用大肠杆菌表达的第二代tPA类产品，即瑞替普酶，由山东阿华生产的“瑞通立”和北京爱德药业开发的“派通欣”分别于2007年和2010年获准上市。然而，tPA类产品的价格高昂、据公开的药品价格，可知阿替普酶和瑞替普酶一次的治疗费用约为2750美元，替奈普酶一次的治疗费用也高达2196美元，很难在临床上推广应用。价格高昂的主要原因一是开发难度大，tPA分子结构复杂(含17对二硫键的糖基化分子)，体外表达困难，表达产率低；二是临床用药剂量大，第一代重组tPA临床用药剂量为IOOmg /支，第三代仍需20~50mg/ 支。
[0013]由于TNK-tPA是迄今为止最安全有效且使用最方便的溶栓药，而具有广阔的应用前景，因而成为各国制药企业争相研发的热点。TNKase最早由美国Genentech公司研制，即替奈普酶。美国的TNK-tPA既没有在我国申请专利保护，产品也未能进入中国市场。在国内仅有广州铭康公司正在开发第三代tPA类产品TNK-tPA，据报道已完成临床研究。广州铭康公司采用哺乳动物细胞CHO表达TNK-tPA，连续灌流培养工艺，培养密度达到2 X IO7 /ml，产量约为50-150mg / L。就生产工艺而言，广州铭康公司采用的连续灌流培养技术较Genentech采用的分批培养具有无可比拟的优势。同其他方法相比，灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并可带走代谢产物，同时细胞保留在反应器系统中，可以达到很高的细胞密度，产率可以提高一个数量级。然而，连续灌注培养需在收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基，成本很高，且使下游蛋白纯化工作增加了很多困难。目前，已公开的tPA重组类产品都是采用连续灌注培养技术，主要源于tPA蛋白自身稳定性差，细胞株表达量低，灌流培养工艺是更适宜的选择。
[0014]综上，TNK-tPA产品在临床应用上仍存在一定的局限性，如半衰期相对较短、治疗时间窗不够宽。此外，构建的表达细胞株产量较低，所采用的灌流生产工艺使生产成本增加，且使得下游蛋白纯化更为复杂和困难。
【发明内容】
[0015]本发明旨在提供一种重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白，其具有与天然tPA类似或更高的体外生物学活性，以及延长的体内半衰期。重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白是指组织型纤溶酶原激活剂突变体TNK-tPA的Fe融合蛋白，其中，TNK-tPA与Fe之间通过柔性接头连接。
[0016]为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白。该重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白从N端至C端依次含有TNK-tPA、柔性肽接头以及人的IgG Fe，其中，人IgG Fe包括天然的人IgG Fe及人IgG Fe变体。
[0017]进一步地，人IgG Fe变体选自如下组:(i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；(ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域;(iii)含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl 绞链区、CH2 和 CH3 区域。
[0018]进一步地，柔性肽接头含有2-20个氨基酸，且柔性肽接头含有两个或更多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
[0019]进一步地，柔性肽接头的氨基酸残基序列如SEQ ID NO:7所示(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)。
[0020]进一步地，TNK-tPA是天然tPA或具有相似功能的tPA变体。
[0021]进一步地，TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4或6所示。
[0022]进一步地，TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的氨基酸序列是去除了 I到35位氨基酸残基的TNK-tPA前导肽之后的SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列。
[0023]根据本发明的另一个方面，提供一种编码上述重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的DNA序列。
[0024]根据本发明的再一个方面，提供一种DNA序列，该DNA序列具有SEQ ID N0:l、3或5所示的DNA序列。
[0025]根据本发明的再一个方面，提供一种载体。该载体包含上述DNA序列。
[0026]根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述载体。
[0027]进一步地，宿主细胞是CHO的衍生细胞株。
[0028]根据本发明的再一个方面，提供一种药物组合物。该药物组合物包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白。
[0029]根据本发明的再一个方面，提供一种上述重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的制备方法。该制备方法采用上述宿主细胞制备重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白。
[0030]根据本发明的再一个方面，提供一种上述重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白在制备用于预防和治疗与需要血栓快速溶解相关的疾病的药物中的应用。
[0031]进一步地，疾病包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、急性缺血性脑卒。
[0032]根据本发明的再一个方面，提供一种上述重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白在制备与人类血液或组织接触的医疗器械或生物医学材料表面的涂层药物方面应用。
[0033]综上，在本发明中，发明人创造性地对TNK-tPA进一步改造，将其C端通过一段通用的柔性肽接头(linker)与IgG Fe片段融合，获得了半衰期更长且具有较好生物学活性的TNK-tPA的Fe融合蛋白。
[0034]以下具体介绍本
【发明内容】
:
[0035]融合蛋白及其制备方法
`[0036]本发明提供了一种重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白，该融合蛋白从N端到C端依次含有人TNK-tPA、肽接头和人IgG天然或变体Fe，并且人IgG Fe变体选自下组:
[0037]⑴含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
[0038](ii)含有 Ser228Pro 和 Leu235Ala 突变的人 IgG4 绞链区、CH2 和 CH3 区域；
[0039](iii)含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro33ISer 突变的人 IgGl 绞链区、CH2 和 CH3区域。
[0040]其中，肽接头，较佳地，使用约2-20个氨基酸长度的、含有以下2种或多种氨基酸构成的柔性肽接头:甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸，如本发明实施例中所公开的优选序列为 SEQ ID N0.:7 (GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)。
[0041]本发明所述的TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2、4或6所示，其成熟蛋白为去除了 TNK-tPA前导肽(I到35位氨基酸残基)之后SEQ ID N0:2、4或6所示的氨基酸序列，人IgG Fe含有绞链区、CH2和CH3区域。变体Fe其CH2区域在228、234、235和331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而降低Fe的效应子功能(美国专利 N0.6，797，493 和 6，900，292)。
[0042]Fe 元件
[0043]IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天，其在血浆中的高稳定性主要得益于其高达150kD的分子量和与其受体FcRn的结合，与FcRn结合可以避免抗体进入溶酶体而被降解。将蛋白与抗体Fe融合获得类抗体的结构，不仅可延长蛋白药物的体内半衰期，而且还由单价分子变成了双价分子，提高了其与靶蛋白的结合力。FcRn在成年上皮组织中有活性，并且在肠腔、肺气管、鼻腔、阴道、结肠和直肠的上皮细胞中表达。由IgG或Fe段组成的融合蛋白可通过FcRn介导的胞转作用，有效地穿梭上皮屏障。另外，包含Fe段的融合蛋白被表达FcRn的细胞内吞和保护。这些融合蛋白不被标记为降解，而是再次进入循环系统，因而增加了这些蛋白的体内半衰期。这种方法已被用于一些临床上很重要的细胞因子(如IL-2和IFN-a 2a)和可溶性受体(如TNF-Rc和VEGF-Rc)，Fe融合蛋白在体内半衰期都有不同程度的延长(美国专利N0.5，349，053和6，224，867)。由美国Immunex公司研制的药物Enbrel就是用CHO细胞表达的重组人P75肿瘤坏死因子受体与人IgGl Fe融合蛋白二聚体，该药于1998年申请上市，在1999年被FDA批准用于减轻中重度活动性累风湿性关节炎患者症状的治疗，并于2002年被FDA批准用于减轻银屑病性关节炎患者的症状。
[0044]肽接头
[0045]连接肽的长度对融合蛋白的活性非常重要。已有人报道了促红细胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，与EPO单体相比，含有2个完整的EPO区域(相隔3到7个氨基酸肽接头)的融合蛋白表现出减弱的活性(Qiu H等，JBiol Chem，1998，273:11173-6)。然而，当这两个EPO区域间的肽接头的长度为17个氨基酸时，二聚体EPO分子的体外和体内生物活性明显提高(SytkowskiAJ 等，JBiol Chem, 1999，274 =24773-8 ;美国专利 N0.6，187，564)。这可能解释为融合蛋白两部分问增加的连接肽，使该分子的两部分能分别行使其功能(Ashkenazi A 等，Curr Opin in Immunol, 1997，9:195-200)。
[0046]本发明经过长期而深入的研究，首次设计了一种独到的绞链区肽接头来降低空间位阻效应，可以制得TNK-tPA的C端与Fe连接的融合蛋白，中间有柔软的肽接头，如本发明实施例中所公开的优选序列为 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。令人意外的是，此融合蛋白不仅没有导致TNK-tPA的生物学功能丧失，反而能够维持、甚至提高TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的生物活性。
[0047]此外，本 发明还发现，在TNK-tPA和人IgG Fe变体间添加的肽接头以两种方式提高重组TNK-tPA-L-Fc的体外生物活性:(I)使Fe区域远离TNK-tPA上的结构域，和(2)使一个TNK-tPA远离另一个TNK-tPA的结构域，从而降低空间位阻效应。
[0048]根据本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法，包括以下步骤:
[0049](a)将编码重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；
[0050](b)流加培养这种CHO衍生的细胞系，从而表达重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白；和
[0051](c)纯化步骤(b)表达的重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白。
[0052]所述的编码重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的DNA具有SEQ ID NO:1、3或5所示的核苷酸序列。
[0053]步骤(a)中，融合蛋白从N端到C端依次含有TNK-tPA、柔性肽接头和人IgG Fe变体(可表示为TNK-tPA-L-vFc)，其表现出很好的体外生物活性，即在摩尔基础上，具有与NK-tPA类似或更高的体外生物活性，以及更长的体内半衰期；其中在TNK-tPA和IgG Fe变体间存在含有约2-20个氨基酸的柔性肽接头；和柔性肽接头含有2个或多个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fe变体含有选自以下的人IgG的绞链区、CH2 和 CH3 区域:Pro331Ser 突变的人 IgG2 ；Ser228Pro 和 Leu235Ala 突变的 AIgG4 ；和 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl。[0054]步骤(b)中，重组TNK-tPA-L-vFc融合蛋白在其生长培养基中每24小时内，在表达超过20(较佳地为30) yg/106(百万)个细胞的条件下，培养转染的CHO衍生的细胞系。动物细胞培养可选用分批培养、灌流培养或流加培养工艺，本发明的一优选实施例中，选用流加培养工艺，高产量CHO衍生的细胞株在IOOmL摇瓶中培养13天，其表达的重组融合蛋白累积产量为1.90g/L(图6)。在细胞培养的第6天至第10天间，活细胞数目最多约为22 X IO6个/ mL，在此条件下，分泌率测定为30 μ g / IO6个细胞/ 24小时。
[0055]步骤(C)中，重组TNK-tPA-L-vFc融合蛋白的纯化方法优选ProteinA亲和层析法，经一步纯化，蛋白纯度即可达到90%以t上。
[0056]与现有技术相比，本发明的融合蛋白及其制备方法的优点概括如下:
[0057]1.Fe与TNK-tPA偶联形成的重组TNK-tPA-L-vFc融合蛋白，在CHO细胞中具有很高的表达量，比重组TNK-tPA在CHO细胞中表达量高10倍以上。
[0058]2.因TNK-tPA与Fe融合表达，使蛋白的稳定性增强，因而宿主细胞可采用流加培养工艺，较灌流培养大大减少了培养基的用量，且减少了培养液收获体积，纯化工作量大大减少，大幅降低了材料成本和人力成本。
[0059]3.重组TNK-tPA- L-vFc融合蛋白采用Protein A亲和层析法进行纯化,纯化步骤简单、高效、大幅降低纯化的成本。
[0060]4.重组TNK-tPA-L-vFc融合蛋白具有与重组tPA更高的体外生物学活性(摩尔比活性)。
[0061]5.重组TNK-tPA-L-vFc融合蛋白具有大大延长的血清半衰期而不增加患者的出血风险，从而降低了实现类似药效所需的剂量，且可使针对急性脑卒中患者的溶栓治疗时间窗拓宽。
[0062]药物组合物
[0063]本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明的重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白。
[0064]本发明的重组TNK-tPA-L-vFc融合蛋白一般地应用于TNK-tPA先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病的预防和治疗以及血友病A或B患者的自发或手术性出血的预防和治疗或其他相关的出血性疾病。
[0065]进一步讲，本发明提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-90wt% ；较佳的0.l-50wt% ;更佳的，5-40wt% )的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中PH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0066]药学上可接受的载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
[0067]本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
[0068]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
[0069]涂层药物
[0070]另一方面，本发明涉及TNK-tPA-L-vFc融合蛋白用作涂层药物的新用途，更具体地，涉及与人类血液或组织相接触的介入性医疗器械或生物医学材料表面涂层药物的新用途，如用于血液透析系统、体外循环系统、人工心脏瓣膜、心脏起搏器、人工血管、血管支架、外科手术线和导管等。其中用作药物载体的生物医学材料的涂层材料需具有良好的组织相容性，可选自聚合物、纳米材料等，如常见的药物载体有丙烯酸甲脂、硫酸软骨素、聚乳酸及其共聚物、聚己内酯、磷酸胆碱等。所述的融合蛋白可通过吸附或化学方式结合在载体材料的表面。
【专利附图】
【附图说明】
[0071]图1显示了根据本发明实施例的在TCDNA3表达载体内Spel-EcoRI片段的TNK-tPA-L-vFcY2的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。人TNK-tPA由信号肽(1-35)、成熟TNK-tPA蛋白(36-562)构成。成熟的融合蛋白含有人TNK-tPA(36-562)、柔性肽接头(563-578)和 Fcy2 变体(579-801)。
[0072]图2显示了根据 本发明实施例的在P⑶NA3表达载体内Spel-EcoRI片段的TNK-tPA-L-vFcY4的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。人TNK-tPA由信号肽(1-35)、成熟TNK-tPA蛋白(36-562)构成。成熟的融合蛋白含有人TNK-tPA(36-562)、柔性肽接头(563-578)和 Fcy4 变体(579-807)。
[0073]图3显示了根据本发明实施例的在P⑶NA3表达载体内Spel-EcoRI片段的TNK-tPA-L-vFcYl的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。人TNK-tPA由信号肽(1-35)、成熟TNK-tPA蛋白(36-562)构成。成熟的融合蛋白含有人TNK-tPA(36-562)、柔性肽接头(563-578)和 Fcy4 变体(579-805)。
[0074]图4显示了根据本发明实施例的所构建TNK-tPA-L-vFc融合蛋白基因的真核表达质粒的基因图谱。该表达质粒全长9997bp，含有10个主要基因片断，包括LhCMV启动子；2.目标基因 TNK-tPA-L-vFc ；3.EMCV IRES ；4.mDHFR 筛选基因；5.bGH 中止序列；6.SV40 启动子-J.卡拉霉素抗性基因；8.SV40中止序列；9.ColEl复制子；10.氨苄青霉素抗性基因。
[0075]图5显示了根据本发明实施例的在300ml摇瓶内细胞株的生长及其分泌TNK-tPA-L-vFc融合蛋白的浓度趋势曲线图。
[0076]图6显示了根据本发明实施例的TNK-tPA-L-vFc纯化蛋白的体外活性。【具体实施方式】
[0077]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0078]实施例1.构建编码TNK-tPA-L-vFc Y融合蛋白的基因
[0079]编码TNK-tPA前导肽和成熟蛋白的基因序列是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，经化学合成办法获得的。为了便于将目的片段插入表达载体的特定位点，在所合成的片段5，和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为SpeI和BamHI。全长1705bp的DNA片段插入转移载体如PUC57中的EcoRV限制性酶切位点间，获得了中间质粒，其所含TNK-tPA基因序列由DNA测序验证。
[0080]柔性肽接头和人IgG Fe区域Fcy2变体vFcy2 (Pro331Ser突变)、Fcy4变体 vFcY4(Ser228Pro 和 Leu235Ala 突变)、Fcyl 变体 vFcYl (Leu234Val、Leu235Ala 和Pro331SSer突变)的融合基因也是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为BamHI和EcoRI。由DNA测序验证L_vFcY三种基因序列。将获得的DNA片段经插入到哺乳动物细胞表达载体P⑶NA3 (Invitrogen)的BamHI和EcoRI位点，得到PCDNA3-L-vFCy三个质粒。再将获得的TNK-tPA片段经NheI / BamHI双酶切后，插入到质粒PCDNA3-L-vFc Y的相应酶切位点间，得到了三个融合基因表达质粒praNA3-TNK-tPA-L-vFcY，该质粒含巨细胞病毒早期启动子，它是哺乳动物细胞高水平表达外源基因所需的增强子。该质粒还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，PCDNA3表达载体含有小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增TNK-tPA-L-vFcgamma融合基因和DHFR基因(美国专利4，399，216)。
[0081]在人TNK-tPA和Fe部分间存在的的柔性肽接头增加了 TNK-tPA区域的柔性且提高了它的生物活性。对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少(但不能少于2个)氨基酸的肽接头。宜使用含有或由2个或更多选自以下氨基酸构成的肽接头:甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。一种肽接头的例子含有
图1、图2、图3分别显示了含三种Fcy变体融合基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列，它们共同含有编码人TNK-tPA、16-氨基酸肽接头(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)和各自含有编码 Fcy2 变体 vFcy2(TNK_tPA-L_vFcY2)、Fcy4 变体vFc y 4 (TNK-tPA-L-vF c y 4)或 Fcy1 变体 vFcYl (TNK-tPA-L-vFc gamma ^ 的序列。三种变体的TNK-tPA vFc融合蛋白都在CHO细胞中表达，纯化和进行体外活性测定，它们所表现的相关特性非常类似。以下实施例选取TNK-tPA-L-vFc Y 2为代表进行表述，TNK-tPA-L-vFc Y 1；TNK-tPA-L-vFc Y 4以及其具有血栓快速溶解功能的突变体在下述实验中的结果相当，在此不再赘述。
[0082]实施例2.融合蛋白在转染细胞系中的表达
[0083]将重组的表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达TNK-tPA-L-vFcgamma融合蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(美国专利N0.4，818，679)。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染和原生质融合。在电穿孔中，用设置为210V电场和1050 μ Fd电容的Gene PulserElectroporator (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，在比色杯内的 2 ~3X IO7 个细胞中加入20μ8用PvuI线性化后的质粒。在转染两天后，将培养基改成含0.6mg / mL G418的生长培养基。用抗人IgG Fe的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。也可用抗人tPA的ELISA进行融合蛋白表达量的定量。通过极限稀释96孔培养板，亚克隆产生高水平Fe融合蛋白的孔。
[0084]为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。用极限稀释的亚克隆能在高达5yg / mL MTX培养基中生长的转染子。测定分泌率对亚克隆的细胞系进行进一步的分析。分泌率水平超过约20(较佳地约30) μ g / IO6(即百万)个细胞/ 24小时的细胞系适应使用无血清生长培养基的悬浮培养。然后用条件培养基纯化融合蛋白。
[0085]实施例3.融合蛋白的生产
[0086]实施例2优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养。待细胞适应这些培养条件后，然后在300ml摇瓶中进行补料添加培养或通过每天更换培养基的办法模拟灌注培养。上述CHO衍生的细胞株在100ml体积的摇瓶中补料培养13天，其表达的重组融合蛋白累积产量为1.90g / L(图6)。在细胞培养的第6天至第10天间，活细胞密度最高可达到22X IO6个/ mL。为了得到更多的TNK-tPA-L-vFc重组蛋白，也可以选用2000ml摇瓶培养。另一种培养方法，上述CHO衍生的细胞株在100ml体积的摇瓶中每天更换培养基，其表达的重组融合蛋白每天累积产量约为
0.20-0.35g / L，在摇瓶中活细胞密度最高可达到31 X IO6个/ mL。以上两种方法生产的重组融合蛋白的测定的体外生物学活性相当。
[0087]实施例4.融合蛋白的纯化与定性
`[0088]用IN NaOH将含有实施例3的融合蛋白的条件培养基滴定到pH7~8，然后用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲液盐水(PBS)平衡的MabSelect?Protein A柱(GE Healthcare)上。待融合蛋白结合于Protein A后,弃去流出的组分。用PBS洗漆该柱,直到280nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M glycyltryosin,2M NaCl,0.04% Tween20, pH4.58缓冲液洗脱结合的融合蛋白，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在-70°C。在还原条件下，由SDS-PAGE测得纯化的单链tPA蛋白(注射用阿替普酶，勃林格殷格翰生产)分子量约为65kDa。纯化的TNK-tPA-L-vFc蛋白迁移至约90kDa。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。
[0089]实施例5.直接发色底物法测定TNK-tPA-L-vFc融合蛋白体外活性
[0090]直接发色底物法采用DiaPharma公司的tPA活性测定试剂盒，该方法用色原性底物S-2288测定纯化tPA的活性。检测原理是基于tPA是一种丝氨酸蛋白酶,可使纤溶酶原单链分子中Arg-Val处肽键断裂。在纯化体系中，该酶可水解三肽色原性底物。因而，可通过测定对硝基苯胺(Para-Nitroaniline, pNA)的释放量计算出tPA的活性。分光光度法在405nm波长下测定OD值的变化，反映出生成pNA的量的多少。图6显示了纯化的重组tPA蛋白(注射用阿替普酶，勃林格殷格翰生产)或纯化的重组TNK-tPA-L-vFc蛋白在相同的摩尔浓度(nM)下的体外活性对应关系。在上述条件下，tPA的EC5tl值为43.2nM，而TNK-tPA-Fc为19.5nM，所以在相同摩尔浓度条件下，TNK-tPA-L-vFc的体外活性是tPA的2.5倍。流加培养上清液中的融合蛋白也能用上述方法测定其体外生物学活性。
[0091]实施例6.融合蛋白的药代动力学测定
[0092]SD大鼠三种剂量(6，0.9，0.18mg / Kg)尾静脉注射TNK-tPA-L-vFc样品，选取不同时间点抽取SD大鼠的血液样品，静置I小时，离心后的上清液用ELISA方法测定血浆中的融合蛋白含量。用ELISA测定时，用羊抗人的Fe的多抗进行包埋、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人tPA的单抗来检测。实施例4中纯化TNK-tPA-L-vFc样品在大鼠血浆半衰期在高中低剂量分别109.1 ±3.5分钟，112.6± 1.5分钟和124.8±3.5分钟，而重组TNK-tPA药品相似剂量血浆半衰期约为19分钟，所以本发明中重组TNK-tPA-L-vFc体内半衰期大幅度延长。
[0093]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白，其中重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白从N端至C端依次含有TNK-tPA、柔性肽接头以及人的IgG Fe，所述人IgG Fe包括天然的人IgG Fe及人IgGFe变体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述人IgGFe变体选自如下组: (i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl 绞链区、CH2 和 CH3 区域。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述柔性肽接头含有2-20个氨基酸，且所述柔性肽接头含有两个或更多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述柔性肽接头的氨基酸残基序列如SEQ ID NO:7所示。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述TNK-tPA是天然tPA或具有相似功能的tPA变体。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4或6所示。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的氨基酸序列是去除了 I到35位氨基酸残基的TNK-tPA前导肽之后的SEQ ID NO:2、4或6所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，编码所述的重组TNK-tPA-L-Fc融合蛋白的DNA序列具有SEQ ID NO: 1、3或5所不的DNA序列。
【文档编号】A61P9/10GK103623396SQ201310445879
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年4月7日 优先权日:2013年4月7日
【发明者】李强, 孙乃超, 周若芸, 刘瑞贤, 金宜慧 申请人:安源生物科技(上海)有限公司