一种降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物及其制备方法

一种降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物及其制备方法
【专利摘要】本发明属生物【技术领域】，涉及种降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物及其制备方法。本发明采用生物技术手段降低纳米递药材料体内外毒性，通过采用生物技术手段干预细胞自噬调控纳米材料的体内外毒性，减少纳米材料的不良副作用，从而提高纳米材料应用的安全性。本发明具体提供了自噬干预手段包括但不限于自噬干预药物（化合物/多肽）、自噬相关基因、自噬相关信号通路蛋白阻断剂与纳米材料组合而成的复合物。
【专利说明】一种降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物及其制备方法

【技术领域】
:
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及调控纳米递药材料体内外毒性的方法，具体涉及一种降低纳米递药材料体内外毒性的药物复合物及其制备方法和用途，更具体地讲，是提供一种利用生物技术手段干预细胞自噬进行调控纳米递药材料的体内外毒性。

【背景技术】
:
[0002]现有技术公开了有关纳米材料主要包括纳米颗粒、纳米线、纳米薄膜、纳米管和纳米固体材料等，由于这类材料尺寸处于原子簇和宏观物体交界的交汇区域，纳米医药材料具有普通宏观材料所不具备的物理化学特性，因而广泛应用于药物递送、疾病诊断、组织工程、治疗药物开发等领域(McCarthy JR, WeisslederR.Multifunct1nal magnetic nanoparticles for targeted imaging and therapy.Adv Drug Deliv Rev2008;60:1241-1251.Petros RA，DeSimone JM.Strategies inthe design of nanoparticles for therapeutic applicat1ns.Nat Rev DrugDisCOV2010;9:615-627.)。作为理想的药物递送材料，纳米医药材料被广泛用于病毒感染、肿瘤治疗等研究中(Mukerjee A, Ranjan APj Vishwanatha JK.Combinatorialnanoparticles for cancer diagnosis and therapy.Curr Med Chem2012;19:3714-3721.Wang Bj Navath RS，Menjoge AR,Balakrishnan B，Bellair R，Dai H，RomeroRjet al.1nhibit1n of bacterial growth and intramn1tic infect1n ina guinea pig model of chor1amn1nitis using PAMAM dendrimers.1nt JPharm2010;395:298-308.)。
[0003]实践显示，尽管纳米医药材料在药物递送领域具有广泛的应用前景，但其仍存在一定的安全性问题。因此纳米递药材料在分子、细胞、器官及生物个体水平引发的特殊生物学效应被广泛研究，如研究发现碳纳米管在生物体内可产生R0S，引起氧化应激反应、脂质过氧化反应、线粒体损伤及细胞形态改变(Lanone S，Andujar P, KermanizadehA, Boczkowski J.Determinants of carbon nanotube toxicity.Adv Drug DelivRev.2013 ;do1:10.1016/j.addr.2013.07.019.);聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)对肺表皮细胞具有细胞毒性，可引起线粒体功能损伤，诱发强烈的免疫反应，诱导炎性细胞因子的释放(Grabowski N，Hillaireau H, Vergnaud J，Santiago LA, Kerdine-Romer S，PallardyM，Tsapis N，Fattal E Toxicity of surface-modified PLGA nanoparticles towardlung alveolar epithelial cells.1nt J Pharm.2013;454(2):686-94.);聚乙烯亚胺(PEI)阳离子纳米颗粒对人正常支气管表皮细胞具有细胞毒性(Zhang H，Xia T, MengH，Xue M，George S，Ji Zj Wang X，Liu Rj Wang M，France B，Rallo Rj Damoiseaux R，CohenYj Bradley KA，Zink JIj Nel AE Differential express1n of syndecan-lmediatescat1nic nanoparticle toxicity in undifferentiated versus differentiated normalhuman bronchial epithelial cells.ACS Nan0.201126; 5:2756-69.);树枝状大分子聚合物可引起急性肺损伤，导致血液斑块形成，影响血小板的功能(Li C，Liu H, Sun Y, WangH，Guo F，Rao S，Deng Jj et al.PAMAM nanoparticles promote acute lung injury byinducing autophagic cell death through the Akt-TSC2_mT0R signaling pathway.J Mol Cell B1l2009;1:37-45.Jones CF，Campbell RA, Brooks AE，Assemi S，TadjikiSj Thiagarajan G，Mulcock C，et al.Cat1nic PAMAM dendrimers aggressively initiateblood clot format1n.ACS Nano2012;6:9900-9910.Jones CF，Campbell RA, FranksZj Gibson CCj Thiagarajan G，Vieira-de-Abreu A，Sukavaneshvar S，et al.Cat1nicPAMAM dendrimers disrupt key platelet funct1ns.Mol Pharm2012;9:1599-1611.)。为了保证纳米医药材料在准确投递药物的同时减少其对正常器官组织的不良作用，目前多采用化学修饰手段将纳米递药材料与具有靶向性的多肽、化合物等结合，使纳米递药材料具有专一靶向性。研究人员发现胆碱衍生物修饰的多枝状左旋聚赖氨酸纳米材料可实现脑革巴向基因药物递送(Li J, Zhou L, Ye D, Huang S，Shao K, Huang R, Han L, etal.Choline-derivate-modified nanoparticles for brain-targetinggene delivery.Adv Mater2011 ;23:4516-4520.);基质金属蛋白酶2可剪切肽、酸激活受体特异性肽配体修饰后的纳米递药材料均可有效实现肿瘤祀向(Huang S，Shao K, Liu Y, Kuang Y, LiJj An S，Guo Y，et al.Tumor-targeting and microenvironment-responsive smartnanoparticles for combinat1n therapy of antiang1genesis and apoptosis.ACSNano2013; 7:2860-2871.Han L，Guo Y，Ma H，He X，Kuang Y，Zhang N，Lim E，et al.AcidActive Receptor-Specific Peptide Ligand for In Vivo Tumor-Targeted Delivery.Small2013.do1: 10.1002/smll.201300279.);此外，豆蔻酸修饰后的聚乙烯亚胺/DNA纳米材料可用于神经胶质瘤的靶向基因治疗，RGDyK修饰的脂质体也可用于神经胶质瘤的靶向分子治疗(Li Jj Gu B，Meng Qj Yan Zj Gao H，Chen X，Yang X，et al.The use of myristicacid as a ligand of polyethylenimine/DNA nanoparticles for targeted genetherapy of gl1blastoma.Nanotechnology2011;22:435101.Li C，Shen Jj Wei Xj XieC，Lu W.Targeted delivery of a novel palmitylated D—peptide for antigl1blastomamolecular therapy.J Drug Target2012; 20:264-271.) □然而，纳米递药材料引发特殊生物学效应的机制目前仍不清楚，作用机制的不明确给纳米递药材料的大规模走向市场安全应用带来了巨大的挑战。
[0004]近年来大量研究发现细胞自噬与纳米递药材料的不良反应密切相关。已有的前瞻性初步研究发现多种纳米递药材料都能诱导细胞自噬，但目前仅局限于现象的研究，对于深入的分子机理研究了解较少(Man N，Yu Lj Yu SHj Wen LP.Rare earth oxidenanocrystals as a new class of autophagy inducers.Autophagy.2010;6:310-1.Hussain Sj Garantz1tis S.1nterplay between apoptotic and autophagy pathwaysafter exposure to cerium d1xide nanoparticles in human monocytes.Autophagy.2013do1:10.4161/aut0.22266.)。
[0005]细胞自噬(autophagy)是原核和真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，负责讲解细胞内长寿蛋白及损伤的细胞器等，是维持细胞内环境稳定的重要手段(Levine B, Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease.Cell2008; 132:27-42.) 0细胞自噬的主要特征是双层膜结构的形成，其发生与mTORCl的抑制，自噬相关蛋白(Atgs)的表达及相关信号通路的激活密切相关(Corradetti MN, GuanKL.Upstream of the mammalian target of rapamycin:do all roads pass throughmT0R?0ncogene2006;25:6347-6360.He C, Kl1nsky DJ.Regulat1n mechanisms andsignaling pathways of autophagy.Annu Rev Genet 2009;43:67-93.)? 细胞自曬(autophagy)又叫II型程序性死亡(type II programmed cell death),是真核生物体内常见的“自我消化”(cellular degradat1n)的现象，能分解细胞内受损或多余的细胞器和蛋白产生核苷酸，氨基酸等小分子物质供细胞合成新的蛋白质，并能维持细胞内微环境的稳定。近年来随着分子生物学及基因技术的发展和对细胞自噬的深入认识，发现其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切。根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自卩遼可分为三种方式:大自曬(macroautophagy)、小自卩遼(microautophagy)和分子伴侣介导的自卩遼(chaperone-mediated autophagy, CMA)。主要概述的大自卩遼(以下简称自曬)与肿瘤发展及治疗关系最为密切(Sridhar S, Botbol Y, Macian F，et al.Autophagyand disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012;226(2):255-73.)。自噬是胞浆大分子物质和细胞器在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程。该过程大致能分为4个阶段:1.在饥饿、缺氧、药物干扰等某些因素的刺激下，自噬泡的双层膜结构开始逐渐形成并包围在被降解物的周围。2.自噬泡完全成型并将要被降解的物质完全隔离于细胞质。3.自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。4.自噬溶酶体最终被溶酶体中的水解酶溶解，降解产物可以在细胞内再循环利用。(Martinez-Borra J, Lopez-LarreaC.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012; 738:169-84.)。自卩遼能对细胞对外部环境改变及各种刺激产生应激反应。细胞在生长条件下能发生较低水平的自噬，称基础自噬。然而，一旦受到外界的刺激，如饥饿、缺氧、高温、高细胞密度或是生长因子剥夺等，细胞自噬的水平将会迅速上调。如在营养物质缺乏的情况下，细胞自噬能分解体内坏死细胞器产生氨基酸等供细胞合成新的蛋白质，维持细胞的存活(①Piacentini M, D’ElettoM，Falasca Lj et al.Transglutaminase2at the crossroads between cell death andsurvival.Adv Enzymol Relat Areas Mol B1l.2011;78:197-246 ;② Cook KLj ShajahanAN，Clarke R.Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.Expert RevAnticancer Ther.2011; 11 (8): 1283-94.；(3) Wirawan Ej Vanden Berghe T，Lippens S，etal.Autophagy: for better or for worse.Cell Res.2012;22(I):43-61.)0
[0006]研究还显示，自噬能降解折叠错误的蛋白质、损伤的细胞器等，延缓机体衰老的发生。集体衰老相关疾病一神经退行性疾病可以被归类为蛋白构象错误疾病，一般是由于大量折叠错误的蛋白质在细胞内堆积从而引发细胞毒性而造成的。研究表明，大量衰老性疾病，如神经退行性疾病和恶性肿瘤都与细胞自噬密切相关(① Martinez-Borra Jj Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp MedB1l.2012;738:169-84.;② Caballero B, Coto-Montes A.An insight into the roleof autophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.Histol Histopathol.2012;27(3):263-75.；③ Mendelsohn AR, Larrick JW.Rapamycinas an antiaging therapeutic?:targeting mammalian target of rapamycin to treatHutchinson-Gilford progeria and neurodegenerative diseases.Rejuvenat1nRes.2011:14(4):437-41.)。
[0007]细胞自噬在生物体的发育和分化过程中起了重要作用。据报道，自噬基因缺失或者突变的线虫生长发育缺陷、衰老加速并缩短寿命；并且自噬也参与果蝇变态的发生。此外自曬在哺乳动物成年个体组织器官发育和分化中也起了重要作用(Mizushima N, KomatsuΜ.Autophagy:renovat1n of cells and tissues.Cell.2011;147 (4):728-41.)。
[0008]此外作为程序性细胞死亡的一种，细胞自噬能通过多种途径直接或是间接导致细胞死亡。(Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell death by autophagy: facts and apparentartefacts.Cell Death Differ.2012;19(I):87-95.)。
[0009]细胞在一些特定的条件下，由于一系列因素的影响导致了各类基因突变从而导致的细胞各类遗传性状及功能改变。这类改变可能将具有正常功能和特性的细胞转变为具有分裂迅速、抗凋亡等恶性特征的细胞即癌细胞。研究表明，肿瘤的发生与发展和自噬的关系极为密切。
[0010]一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞中，自噬都普遍被保留下来，并且在一般情况下都维持着基础自噬。但是自噬究竟是抑制还是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素，一些已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并且对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自曬缺乏可引起自曬底物p62积聚，通过NF-κ B信号途径引起肿瘤形成(TrocoliA,Djavaher1-Mergny M.The complex interplay between autophagy and NF- κ Bsignaling pathways in cancer cells.Am J Cancer Res.2011; I (5):629-49.)。然而在肿瘤生长到一定程度时，尤其是当肿瘤内还没有形成足够的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞也可以通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情况下约3h，HeLa细胞中的自噬部分从4%上升到37%。这也说明了在营养缺乏等条件下自卩遼也是肿瘤细胞的一种自我保护的机制(Baldwin AS.Regulat1n of celldeath and autophagy by IKK and NF-κ B:critical mechanisms in immune funct1nand cancer.Tmmunol Rev.2012;246(I):327-45.) ?
[0011]越来越多的证据表明，细胞自噬影响很多关键的细胞过程，如程序性细胞死亡、细胞增殖、炎症反应和固有免疫功能等，因此，细胞自噬可能在纳米递药材料的安全应用中起决定性作用。研究发现富勒烯能够在细胞内产生ROS并诱导细胞自噬，可促进化疗药物阿霉素和顺钼杀伤肿瘤细胞的能力(Zhang Q, Yang W，Man N, Zheng F，Shen Y, Sun Κ, LiY, et al.Autophagy-mediated chemosensitizat1n in cancer cells by fullereneC60nanocrystal.Autophagy2009; 5:1107-1117.);此外,基因运输载体阳离子脂质体，纳米胶束等纳米递药材料均能诱导细胞自曬，其具体机制仍有待进一步研究(Man N, ChenY,Zheng F，Zhou W，Wen LP.1nduct1n of genuine autophagy by cat1nic lipids inmammalian cells.Autophagy2010;6:449-454.Halamoda Kenzaoui B, Chapuis BernasconiC, Guney-Ayra S, Juillerat-Jeanneret L.1nduct1n of oxidative stress, lysosomeactivat1n and autophagy by nanoparticles in human brain-derived endothelialcells.B1chem J2012;441:813-821.)。
【发明内容】
:
[0012]本发明的目的是一种调控纳米递药材料体内外毒性的方法，具体涉及通过制备细胞自噬干预药物与纳米递药材料的复合物，实现通过干预细胞自噬降低纳米材料体内外毒性，减少纳米材料的副作用和不良反应，提高纳米材料应用的安全性。尤其涉及一种降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物及其制备方法。
[0013]本发明提供了通过自噬干预手段与纳米材料联合作用，制得降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，所述自噬干预手段包括但不限于自噬干预药物(化合物/多肽)、自噬相关基因、自噬相关信号通路蛋白阻断剂与纳米材料组合而成的复合物。
[0014]更具体的，本发明的种降低纳米递药材料体内外毒性药物组合物由纳米材料与细胞自噬干预药物组成。
[0015]本发明中，所述纳米递药材料包括但不局限于树枝状大分子(PAMAMDendrimers)，聚乳酸聚乙二醇酸共聚物(PLGA)，碳纳米管，聚乙烯亚胺(PEI )，量子点。
[0016]本发明中，所述细胞自噬干预药物包括但不限于3-甲基腺嘌呤、氯喹、羟基氯喹、渥曼青霉素、LY294002、放线菌酮、巴伐洛霉素Al等细胞自噬抑制剂、雷帕霉素、海藻糖等细胞自噬激活剂，自噬相关基因的siRNA，shRNA。
[0017]本发明中，所述复合物的形成方法包括但不限于药物与纳米材料之间离子相互作用、化学键形成反应、物理结合和生物反应。
[0018]本发明中，所述复合物以选自以下一组中的形式进行配方:具体包括但不限于固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体、纳米微球等。
[0019]本发明中，所述复合物中的组成成分序贯使用能减轻纳米材料的体内和体外毒性,增强纳米材料的安全性。
[0020]在本发明的实施例中，公开了一种细胞自噬干预药物如氯喹与纳米递药材料如树枝状大分子形成复合物或序贯使用的方法。正常的BALB/C雌鼠通过腹腔注射树枝状大分子(PAMAM dendrimers)可引起纳米材料中毒反应,具体表现为体重急剧减轻,肝功能损伤，细胞自噬水平提高。采用细胞自噬抑制剂干预树枝状大分子诱导的细胞自噬，可明显减轻树枝状大分子对正常BALB/C雌鼠的毒性及肝损伤。
[0021]本发明还提供了细胞自噬干预药物与纳米递药材料复合物的用途，具体为:包括但不限于药物递送、医学影像、疾病诊断、肿瘤治疗。

【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1、PAMAM树枝状大分子引起人肝细胞生长抑制。
[0023]图2、PAMAM树枝状大分子引起人肝细胞发生细胞凋亡。
[0024]图3、PAMAM树枝状大分子引起人肝细胞线粒体膜电位降低。
[0025]图4、PAMAM树枝状大分子引起人肝细胞细胞自噬体形成。
[0026]图5、PAMAM树枝状大分子引起人肝细胞自噬相关荧光产生。
[0027]图6、PAMAM树枝状大分子引起人正常肝细胞LC3-1I表达量增加。
[0028]图7、3-甲基腺嘌呤抑制细胞自噬削弱PAMAM引起的肝细胞生长抑制。
[0029]图8、3-甲基腺嘌呤抑制细胞自噬削弱PAMAM引起的肝细胞LC3-1I表达减少。
[0030]图9、氯喹抑制细胞自噬削弱PAMAM引起的肝细胞生长抑制。
[0031]图10、氯喹抑制细胞自噬削弱PAMAM引起的肝细胞LC3-1I表达增加。
[0032]图11、NAC抑制活性氧削弱PAMAM引起的肝细胞生长抑制。
[0033]图12、NAC抑制活性氧削弱PAMAM引起的肝细胞LC3-1I表达增加。
[0034]图13、氯喹可明显削弱PAMAM树枝状大分子引起的动物体重降低。
[0035]图14、氯喹可明显削弱PAMAM树枝状大分子引起的动物肝重降低。
[0036]图15、氯喹可明显削弱PAMAM树枝状大分子引起的动物肝损伤。
[0037]图16、氯喹抑制细胞自噬削弱树枝状大分子引起的肝脏关键酶指标异常。
[0038]图17、抑制细胞自噬可明显削弱量子点引起的肾细胞生长抑制。
[0039]图18、抑制细胞自噬可明显削弱PAMAM引起的神经细胞的生长抑制。

【具体实施方式】
[0040]以下结合附图并通过具体实施例进一步说明但不限定本发明。
[0041]实施例1、树枝状大分子对人肝细胞具有细胞毒性
[0042]人正常肝细胞HL7702，肝癌细胞SMMC7721，HepG2用不同浓度的PAMAMdendriemrs (12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)处理24小时，以未处理的细胞为阴性对照采用MTT法测定相对细胞活力，实验结果如图1所示；采用Annexin V/PI对细胞进行染色,采用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测，实验结果如图2所示；采用JC-1对下次报进行染色，采用流式细胞仪对线粒体膜电位的崩塌情况进行检测，实验结果如图3所示。
[0043]实施例2、树枝状大分子诱导人肝细胞发生细胞自噬
[0044]人正常肝细胞HL7702，肝癌细胞SMMC7721，HepG2用100 μ g/ml的树枝状大分子处理24h后，进行石蜡包埋、切片、染色，在透射电子显微镜下观察细胞亚显微结构，结果如图4所示，给药组细胞内有大量的典型的双层膜结构自噬体，而对照组则未发现。
[0045]人正常肝细胞HL7702，肝癌细胞SMMC7721，HepG2用100 μ g/ml的树枝状大分子处理24h后，采用Cyto-1D细胞自噬检测荧光染料进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图5所示，给药组细胞和雷帕霉素作用组细胞可观察到明显的绿色荧光，而对照组绿色荧光强度很弱。
[0046]人正常肝细胞HL7702，肝癌细胞SMMC7721，HepG2细胞用100 μ g/ml的树枝状大分子处理不同时间后，将离心收集到的细胞用PBS洗I次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20 μ g进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3b和β -actin抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色。人正常肝细胞HL7702，肝癌细胞SMMC7721，HepG2细胞经过树枝状大分子处理不同时间或不同浓度处理后，通过Western Blot的检测，实验结果如图6所示,与对照组相t匕，给予树枝状大分子细胞的LC3 II的表达水平增强。
[0047]实施例3、3_甲基腺嘌呤抑制细胞自噬削弱树枝状大分子引起的肝细胞生长抑制
[0048]人正常肝细胞HL7702 用不同浓度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)处理24小时，给药前3h加入3-甲基腺嘌呤处理细胞，24h后采用MTT法测定各组的细胞活力。实验结果如图7所示，3-甲基腺嘌呤预处理可明显削弱树枝状大分子引起的肝细胞的生长抑制。将离心收集到的细胞用PBS洗I次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20yg进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3b和β -actin抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色。实验结果如图8所示。实施例4、氯喹抑制细胞自噬削弱树枝状大分子引起的肝细胞生长抑制
[0049]人正常肝细胞HL7702 用不同浓度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)处理24小时，给药前3h加入3-甲基腺嘌呤处理细胞，24h后采用MTT法测定各组的细胞活力。实验结果如图9所示，3-甲基腺嘌呤预处理可明显削弱树枝状大分子引起的肝细胞的生长抑制。将离心收集到的细胞用PBS洗I次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20yg进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3b和β -actin抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色。实验结果如图10所示。
[0050]实施例5、抑制活性氧可削弱树枝状大分子引起的肝细胞生长抑制
[0051]人正常肝细胞HL7702 用不同浓度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)处理24小时，给药前3h加入NAC处理细胞，24h后采用MTT法测定各组的细胞活力。实验结果如图11所示，NAC预处理可明显削弱树枝状大分子引起的肝细胞的生长抑制。将离心收集到的细胞用PBS洗I次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20 μ g进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3b和β -actin抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色。实验结果如图12所示。
[0052]实施例6、氯喹抑制细胞自噬削弱树枝状大分子引起的肝损伤
[0053]BALB/C雌鼠分为4组，分别为对照组，PAMAM处理组(100mg/kg )，氯喹处理组(50mg/kg),联合用药组(PAMAM100mg/kg+CQ50mg/kg)。每天记录体重变化，实验结果如图13所示；实验10天后，处死小鼠，记录肝重变化，实验结果如图14所示；将各组肝组织进行切片并HE染色观察，实验结果如图15所示。
[0054]实施例7、氯喹抑制细胞自噬削弱树枝状大分子引起的肝脏关键酶指标异常
[0055]将各实验组动物肝脏研磨，采用酶标仪测定各组实验动物肝脏中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、甘油三酯、总胆固醇含量的变化，实验结果如图16所示。
[0056]实施例8、抑制细胞自噬削弱量子点引起的肾细胞生长抑制
[0057]人正常肾细胞用40nM的量子点处理不同时间，给药前3h加入3_甲基腺嘌呤、氯喹或氯化铵处理细胞，24h后采用MTT法测定各组的细胞活力。实验结果如图17所示，抑制细胞自噬可显著削弱量子点引起的肾细胞生长抑制。
[0058]实施例9、抑制细胞自噬削弱树枝状大分子引起的神经细胞生长抑制
[0059]人神经胶质瘤细胞U118米用100 μ g/ml PAMAM dendrimers G5处理24h,给药前3小时加入4μ M氯喹处理细胞，24h后采用MTT法测定各组的细胞活力。实验结果如图18所示，抑制细胞自噬能显著削弱PAMAM引起的神经细胞的生长抑制。
[0060]以上实施例仅起说明的作用。不能也不应将它们视为对本发明范围或精神的限制。本领域技术人员可以理解对于本发明的目的而言，可使用其他变化或替代形式。而本发明的目的仅由本说明书和所附权利要求书定义。
【权利要求】
1.一种降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，该药物复合物由纳米递药材料与细胞自噬干预药物组成药物复合物。
2.如权利要求1所述的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，所述纳米递药材料选自树枝状大分子(PAMAM Dendrimers),聚乳酸聚乙二醇酸共聚物(PLGA),碳纳米管，聚乙烯亚胺(PEI)或量子点。
3.如权利要求1所述的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，所述细胞自噬干预药物选自细胞自噬抑制剂、细胞自噬激活剂或自噬相关基因。
4.如权利要求3所述的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，所述细胞自噬抑制剂选自3-甲基腺嘌呤、氯喹、羟基氯喹、渥曼青霉素、LY294002、放线菌酮或巴伐洛霉素Al。
5.如权利要求3所述的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，所述细胞自噬激活剂选自雷帕霉素或海藻糖。
6.如权利要求3所述的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，所述自噬相关基因是siRNA或shRNA。
7.如权利要求1所述的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，所述复合物由一种或多种自噬干预药物与一种或多种所述的纳米材料组成。
8.如权利要求7所述的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，所述复合物的组成方法为药物与纳米材料之间离子相互作用、化学键形成反应、物理结合或生物反应。
9.如权利要求1所述的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物，其特征在于，所述复合物选自以下一组中的形式进行配方:固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米微球。
10.权利要求1的降低纳米递药材料体内外毒性药物复合物在制备药物递送、医学影像、疾病诊断或肿瘤治疗制剂中的用途。
11.如权利要求10的用途，其特征在于，所述的药物复合物的组分序贯使用。
【文档编号】A61K48/00GK104511017SQ201310460943
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】鞠佃文, 李玉彬, 曾贤, 钱晓璐, 王绍飞, 王子玉, 范佳君, 孙筠, 宋平, 冯美卿 申请人:复旦大学