小檗果提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小檗果提取物的新用途，该新用途是小檗果提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用。所述提取物是按如下方法制备的：以小檗果为原料，用水提取，通过两次大孔吸附树脂纯化得到，包括小檗果提取物A、小檗果提取物B。本发明所提供的小檗果提取物对制备治疗糖尿病药物具有重要意义。
【专利说明】小檗果提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种中药材提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用，具体是涉及小檗果提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
【背景技术】
[0002]随着世界人口的老龄化，糖尿病已经成为一种常见病、多发病，在工业发达国家其发病率呈上升趋势。据统计，全世界约有1.5亿糖尿病患者，80%为非胰岛素依赖型糖尿病(2型)，其中我国约有3000万。由糖尿病并发症引起的死亡人数在发达国家已是继心脑血管疾病、癌症之后列第三位，引起了世界各国的高度重视，纷纷对糖尿病的发病机制、药物防治等进行研究。由于I型糖尿病病因已基本明确，只需补充胰岛素即可，而2型糖尿病则较复杂，目前我国医学界对其采取的是包括饮食疗法、药物治疗与其它辅助疗法的综合治疗措施。西药虽然层出不穷，但不能从根本上解决问题，而且西药治疗具有一定的副作用及“治疗失效”。中医药治疗糖尿病历史悠久，临床经验丰富，疗效显著，已成为近年来国内外研究热点。中医学对糖尿病的认识与西医不同，中医强调整体观，以阴、阳二者的变化反映疾病的本质。正常机体是“阴平阳秘”，阴阳平衡，即机体内环境维持稳态，糖代谢也维持稳定；并且中药的毒副作用相对较小，病人可长期服用，这是西药所不能比拟的独特的优势。
[0003]中医认为糖尿病是由肺、胃、肾三脏热灼阴亏，水谷转输失常所致。其基
本病机为阴津亏耗，燥热偏盛，肾阴亏虚为本，肺胃燥热为标，病久则阴损气耗阳伤，而致气阴两伤，阴阳俱虚，脉络瘀阻，筋脉失养，脏腑受损，渐致出现一系列兼症。
[0004]糖尿病的病程是阴损及阳的过程。以阴辨证，从轻到重，则是阴虚一气阴两虚一阴阳两虚的转化。而脉络瘀阻贯穿于本病及兼症的全过程。
[0005]近年来，有的学者探讨了糖尿病中医辨证分型与临床生化指标的关系。从胰岛功能、血脂水平、血浆性激素、皮质激素水平、免疫功能机血液流变学等变化，观察消渴病分型与以上指标改变的相关性，发现各种指标的异常变化，从轻到重，多随阴虚一气阴两虚一阴阳两虚方向发展。体现了中西医结合探讨消渴病分型的物质基础。
[0006]辨证论治是中医理论的精髓。中医根据消渴病的主要病机，辨别燥热与阴虚的标本轻重，用药时重视养阴，有燥热者则须清热，阴阳气血均亏，则阴阳气血并补。根据现代药理概念，对中药抗糖尿病的作用研究主要如下。单味中药:黄连及小檗碱、苦瓜、人参、黄芪、黄芩、桑叶、中药多糖(如银耳多糖，银耳孢子多糖、木耳多糖、猴头多糖、紫菜多糖、麦冬多糖、褐藻淀粉(laminarin)、枸杞多糖-X、枸杞多糖-D、番瓜多糖及丹皮多糖等)、水飞蓟素、大黄。此外，口服黄酮类葛根素(puerarin)或黄皮香豆精(clausenacoumarine)对ALX动物的高血糖也有降低作用。中医治疗糖尿病的基本原则可概括为:滋阴清热、益气养阴、补肾健脾及活血化瘀 等。常用经典方剂有人参白虎汤、六味地黄丸、八位地黄丸及千金黄连丸等，根据不同证型及上述治则组方或用古方进行加减。
[0007]小檗果为小檗科植物红果小檗Berberis nummularia Bge.的干燥成熟果实。收载于1998年《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册》。其性平，具有健胃和中，生津止渴，清热解毒之功效。用于消化不良，痢疾泻下，口渴，口疮，咽炎。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关小檗果的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究表明，小檗果含有小檗碱、药根碱、巴马亭等生物碱类成分，以及天竺葵色素、锦葵色素等花色素类成分。其他化学成分不详；药理作用研究未见报道。
[0008]国内专利检索结果，未见小檗果相关专利。
[0009]上述文献及专利等，尚未见小檗果提取物用于制备治疗糖尿病药物的报道。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供小檗果提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
[0011]本发明是通过如下技术方案实现的:
本发明所用小檗果为小檗科植物红果小檗Berberis nummularia Bge.的干燥成熟果实。
[0012]本发明小檗果提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用，所述小檗果提取物的制备方法为:
(1)小檗果，用水作为溶剂，提取温度50°c-95°c，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为小檗果重量的6-15倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.10-1.18，滤过，得药液A ;
(2)将步骤(1)得到的药液A，通过非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过极性大孔吸附树脂，再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B ;
(3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B，其中一种或两种按一定比例混匀，即得本发明的小檗果提取物。
[0013]小檗果提取物的制备方法为:
(1)小檗果，用水作为溶剂，提取温度50°c-95°c，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为小檗果重量的6-15倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.10-1.18，滤过，得药液A ;
(2)将步骤(1)得到的药液A，通过非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过极性大孔吸附树脂，再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B ;
(3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B混匀，即得本发明的小檗果提取物。
[0014]小檗果提取物的制备方法为:
(1)小檗果，用水作为溶剂，回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为小檗果重量的10倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.12，滤过，得药液A ;
(2)将步骤(1)得到的药液A，通过DlOl非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过LSA-40极性大孔吸附树脂，再用浓度30%、60%的乙醇溶液依次洗脱DlOl非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度70%、95%的乙醇溶液依次洗脱LSA-40极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B;
(3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B混匀，即得本发明的小檗果提取物。
[0015]本发明的小檗果提取物中主要含有:小檗碱、药根碱、巴马亭、木兰花碱、天竺葵色素、锦葵色素。
[0016]本发明的小檗果提取物制备方法特征在于:所采用的非极性大孔吸附树脂为DlOl大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂；所采用的极性大孔吸附树脂为LSA-40大孔吸附树月旨、HPD600大孔吸附树脂。
[0017]本发明的小檗果提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服剂型。
[0018]本发明的小檗果提取物A、小檗果提取物B在制备治疗糖尿病药物中的应用。
[0019]本发明的小檗果提取物与化学药或中药或天然药物组成的治疗糖尿病药物。
[0020]本发明的小檗果提取物A、小檗果提取物B与化学药或中药或天然药物组成的治疗糖尿病药物。
[0021]本发明首次探索研究以小檗科植物红果小檗Berberis nummularia Bge.的干燥成熟果实为原料提取制备治疗糖尿病提取物。动物实验表明，小檗果提取物降血糖效果明显。本实验临床应用研究表明，小檗果提取物能明显降低DN患者尿蛋白及血肌醉，改善肾功能。治疗组优于对照组，但对空腹血糖无显著影响(P>0.05)。治疗组治疗后未发现明显不良反应。
【具体实施方式】
[0022]下面通过具体实 验例和实施例对小檗果提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用做进一步说明，但不限于本发明。
[0023]实施例1:小檗果提取物及单体化合物的制备
(O小檗果15kg，用水作为溶剂，回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为小檗果重量的10倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.12，滤过，得药液A ;
(2)将步骤(1)得到的药液A，通过DlOl非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过LSA-40极性大孔吸附树脂，再用浓度30%、60%的乙醇溶液依次洗脱DlOl非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度70%、95%的乙醇溶液依次洗脱LSA-40极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B;
(3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B混匀，即得本发明的小檗果提取物。
[0024]小檗果提取物进行硅胶柱色谱、制备薄层色谱、以及S印hadex LH 一 20柱色谱，分别得到蜕小檗碱、药根碱、巴马亭、木兰花碱、天竺葵色素、锦葵色素。以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
[0025]实施例2:小檗果提取物及单体化合物的制备
(I)小檗果12kg，用水作为溶剂，提取温度50°C，提取次数为3次，每次提取时间为I小时，每次溶剂用量为小檗果重量的6倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.18，滤过，得药液A ；(2)将步骤(1)得到的药液A，通过AB-8非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过HPD600极性大孔吸附树脂，再用浓度50%的乙醇溶液洗脱AB-8非极性大孔吸附树月旨，收集50%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度95%的乙醇溶液洗脱HPD600极性大孔吸附树脂，收集95%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B ；
(3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B混匀，即得本发明的小檗果提取物。
[0026]小檗果提取物进行硅胶柱色谱、制备薄层色谱、以及S印hadex LH 一 20柱色谱，分别得到蜕小檗碱、药根碱、巴马亭、木兰花碱、天竺葵色素、锦葵色素。以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
[0027]实施例3:小檗果提取物及单体化合物的制备 (1)小檗果18kg，用水作为溶剂，提取温度95°C，提取次数为I次，每次提取时间为4小时，每次溶剂用量为小檗果重量的15倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.10，滤过，得药液A ；
(2)将步骤(1)得到的药液A，通过DlOl非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过HPD600极性大孔树脂，再用浓度95%的乙醇溶液洗脱DlOl非极性大孔吸附树脂，收集95%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度50%的乙醇溶液洗脱HPD600极性大孔吸附树脂，收集50%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B ；
(3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B混匀，即得本发明的小檗果提取物。
[0028]小檗果提取物进行硅胶柱色谱、制备薄层色谱、以及S印hadex LH 一 20柱色谱，分别得到蜕小檗碱、药根碱、巴马亭、木兰花碱、天竺葵色素、锦葵色素。以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
[0029]实施例4:小檗果提取物片剂的制备
取实施例1小檗果提取物260g，加入淀粉55g，混匀，制粒，干燥，过筛，加微晶纤维素23g，硬脂酸镁3.5g，混匀，压制成1000片，即得小檗果提取物片剂。
[0030]实施例5:小檗果提取物胶囊的制备
取实施例2小檗果提取物245g，加入微晶纤维素10g，淀粉40g，混匀，制粒，干燥，整粒，过筛，装胶囊1000粒，即得小檗果提取物胶囊。
[0031]实施例6:小檗果提取物颗粒的制备
取实施例3小檗果提取物265g，加入糊精105g，混匀，制粒，干燥，整粒，即得小檗果提取物颗粒。
[0032]实验例1:小檗果提取物治疗2型糖尿病性肾病微血管病变试验
临床资料:共观察40例患者，男22例，女18例，平均年龄55岁，全部病例均有10年以上糖尿病病史。所有入选病例均符合WHO 1999年颁布的糖尿病诊断标准及高等院校六版教材《内科学》糖尿病肾病的诊断标准。随机分为治疗组、对照组各20例，两组患者在性另O、年龄、病程上无显著差异性(P>0.05)，具有可比性。所有患者均无急、慢性肾炎及其他肾病，无尿路感染、发热及应用肾毒性药物等。
[0033]治疗方法:所有患者均先予降压及降糖治疗，降压药物采用血管紧张素转换酶抑制剂(依那普利)，降糖药应用胰岛素(甘舒森30R)，根据病情调整用量，使空腹血糖降至7mmol/L以下，血压降至18.6/12.0kPa以下。治疗组另予本发明专利实施例4的小檗果提取物制成的片剂，3片/每次，每日3次，2周为I疗程。对照组只用降糖、降压药及对症治疗。观察两组治疗前后空腹血糖(FBG)，24h尿蛋白定量、血肌配、内生肌配清除率变化。统计学处理:计数资料用X2检验，计量资料用t检验。
[0034]治疗结果:两组治疗前后FBG及24h尿蛋白定量、血肌配(SCr)、内生肌配清除率(CCr)的平均值变化。治疗组治疗后比治疗前24h尿蛋白定量、血肌配明显降低(P〈0.01)，内生肌配清除率明显升高(P〈0.01)，且与对照组治疗后比较也有显著差异(P〈0.01)。表明加用小檗果提取物治疗能明显降低DN患者尿蛋白及血肌醉，改善肾功能。治疗组优于对照组，但对空腹血糖无显著影响(P>0.05)。治疗组治疗后未发现明显不良反应。
[0035]实验例2:小檗果提取物对自发性肥胖型糖尿病小鼠降血糖作用试验
实验动物:SPF级，自发性肥胖型糖尿病小鼠(db/db小鼠)50只，6周龄，体重38±2g，随机分组。由中科院动物实验中心提供。
[0036]实验药物及仪器:小檗果提取物、小檗果提取物A、小檗果提取物B (实施例1方法制备得到，批号分别为:20110405、20110406、20110407);阳性对照药为马来酸罗格列酮(葛兰素史克天津药业有限公司)，one touch II血糖仪(强生公司)。
[0037]动物分组:模型对照组:10只，给等量水；阳性对照组:10只，给阳性药；实验药物组:30只，共分为三组，分别给小檗果提取物、小檗果提取物A、小檗果提取物B。
[0038]给药:分组后适应一周开始给药，连续给药2周，给药途径为灌胃。三种提取物的给药量换算为小鼠后为400mg/kg体重,罗格列酮的给药量为5mg/kg体重。
[0039]血糖测定:第7、14天给药I小时后,尾静脉取血用one touch II血糖仪测定动物随即血糖。试验结果见表1。
[0040]表1小檗果各提取物对db/db小鼠血糖浓度的影响
【权利要求】
1.小檗果提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用，所述小檗果提取物的制备方法为: (1)小檗果，用水作为溶剂，提取温度50°c-95°c，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为小檗果重量的6-15倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.10-1.18，滤过，得药液A ; (2)将步骤(1)得到的药液A，通过非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过极性大孔吸附树脂，再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B ; (3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B，其中一种或两种按一定比例混匀，即得本发明的小檗果提取物。
2.根据权利要求1所述小檗果提取物的制备方法为: (1)小檗果，用水作为溶剂，提取温度50°C_95°C，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-4小时，每次溶剂用量为小檗果重量的6-15倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.10-1.18，滤过，得药液A; (2)将步骤(1)得到的药液A，通过非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过极性大孔吸附树脂，再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度50%-95%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B ； (3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B混匀，即得本发明的小檗果提取物。
3.根据权利要求1所述小檗果提取物的制备方法为: (1)小檗果，用水作为溶剂，回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为小檗果重量的10倍；滤过，合并提取液，浓缩至相对密度d=l.12，滤过，得药液A ; (2)将步骤(1)得到的药液A，通过DlOl非极性大孔吸附树脂，先用水洗脱，水洗脱液直接通过LSA-40极性大孔吸附树脂，再用浓度30%、60%的乙醇溶液依次洗脱DlOl非极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物A ;再用浓度70%、95%的乙醇溶液依次洗脱LSA-40极性大孔吸附树脂，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得小檗果提取物B; (3)上述小檗果提取物A、小檗果提取物B混匀，即得本发明的小檗果提取物。
4.根据权利要求1、权利要求2所述的小檗果提取物的制备方法，其特征在于:所采用的非极性大孔吸附树脂为DlOl大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂；所采用的极性大孔吸附树脂为LSA-40大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂。
5.根据权利要求1所述的小檗果提取物A、小檗果提取物B在制备治疗糖尿病药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的小檗果提取物与化学药或中药或天然药物组成的治疗糖尿病药物。
7.根据权利要求1所述的小檗果提取物A、小檗果提取物B与化学药或中药或天然药物组成的治疗糖尿病药物。
8.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3所述的小檗果提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服剂型。
【文档编号】A61P3/10GK103585234SQ201310525368
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】孔倩倩 申请人:济南星懿医药技术有限公司