冬青属植物及其提取物在制备抗病毒药物中的应用的制作方法

专利名称：冬青属植物及其提取物在制备抗病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及冬青科冬青属植物的用途。具体地说，本发明涉及冬青科冬青属植物及其提取物在制备抗病毒药物中的用途。
背景技术：
冬青属(Ilex)是冬青科3个属中我国仅有的1个属，共118种，多用于清热解毒、消炎、镇咳、祛痰及治疗心血管疾病，其化学成分主要为三萜及其皂苷、黄酮类、香豆素、木脂素、糖脂类等化合物。
1.心血管药理作用岗梅根以乙醇、硫酸氢钠处理制成的注射液对离体滕鼠心脏灌流有扩张冠状血管、增加冠脉流量和加强心收缩力的作用(湖南医学院医学研究资料1973；(1)26-29)；枸骨对脉鼠离体心脏有增加冠脉流量及心脏收缩力的作用，而对心率影响不大。其冠脉流量及心肌收缩力的增加.可能系通过扩张冠状动脉及改善心肌供氧的缘故(谢宗万.全国中草药汇编(第2版，上册)，北京人民卫生出版社，1996602)；实验用Ca2示踪法研究了毛冬青甲素对免心肌钙离子内外流的影响。结果发现毛冬青(10-5mol/L)对心肌钙离子内流具有明显促进作用(P＜0.05)这种作用可被钙拮抗剂硝苯吡啶(1.4×10-6mol/L)所阻滞，提示药物的作用可能和α或β肾上腺素能受体无关。同时，药物明显增加心肌细胞内的钙离子外流。研究结果提示，毛冬青甲素所具有的正性肌力作用可能是由于药物加快了细胞钙的转运速率所致(贾可亮，等.厂州中医学院学报，1991；8(1)14)；铁冬青树皮醇提取物0.05g/0.2ml一次给药.对离体脉鼠心脏灌流有扩张冠状动脉增加冠脉流量作用，1.6g/Kg静脉注射，对麻醉猫有降血压及对脑垂体后叶所致免实验性心肌缺血有保护作(黄树莲，等.中草药，1981，12(12)554)；从苦丁茶中分离得的三萜化合物为乙酰辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制剂，可作为治疗动脉硬化的新药(J Nat.Prod.1999；62(9)1061-1064)。
2.降压作用苦丁茶提取物0.05g/kg静脉注射正常血压麻醉犬即可产生明显作用，对二肾一夹型高血压大鼠和自发性高血压大鼠降压作用明显，提示该药有望开发成为降压新药(陈一，等.中草药，1995；28(5)250-252)。海南冬青提取物0.25g/kg静脉注射，可使麻醉狗血压迅速下降，降压峰值可达原血压的50.6％，持续10-40min，心率减慢(陈一，等.中草药，1983；14(4)171)。毛冬青粗制剂及黄酮苷对麻醉犬和猫，以及脊髓犬和猫，均能引起缓慢持久的降压作用，静注20-30min降压才明显，1-3h降至最低水平(北京制药工业研究所，等.中草药，1980；11(8)358))。
3.抗炎抗菌作用细叶冬青果实中分得的铁冬青酸具广谱抗菌活性，对细菌、酵母菌和丝状真菌都有作用，其作用机制为破坏细胞膜以及脂质合成，使细胞内容物流出而死亡(Phytotherres，1999；13(2)151-156)。冬青相当于生药0.0125g/ml的稀释水溶液对绿脓秆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、福氏痢疾备杆菌、产碱杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用(南通医学院，中华医学杂志，1973，53(4)204)。铁冬青煎剂试管内能抑制金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、弗氏痢疾杆菌、伤寒杆菌与绿脓杆菌(广东中医学院新中医，1971；(3)30)。
4.降脂消肥作用苦丁茶提取物1.5g/kg灌胃，可显著减少正常和肥胖大鼠腹部皮下脂肪组织指数(陈一，等.中草药，1995；28(5)250-252)。
5.避孕及抗生育作用枸骨叶丙酮提取物的抗生育作用枸骨丙酮提取物灌胃给药，对小鼠早孕、中孕无明显影响；皮下注射给药，对小鼠有明显的抗中孕作用；腹腔注射给药，对小鼠早、中、晚孕有明显中止作用；对大鼠有显著抗早孕作用(谢宗万.全国中草药汇编(第2版，上册)，北京人民卫生出版社，1996602)。
我国20多种可供药用的冬青属植物，分布广泛，资源丰富。而目前国内对冬青属植物的研究大都集中于枸骨、苦丁茶、毛冬青、冬青、铁冬青几个种，其化学成分仅限于三萜及其皂苷的研究，对其它化学成分研究尚较粗浅。迄今为止，尚末见任何冬青(Ilex)属植物用于抗病毒的研究报道。
病毒是最小的病原微生物，其核心是核糖核酸或脱氧核糖核酸(DNA)，病毒的传播最广，是目前世界上发病率最高的传染性疾病之一。由病毒引起的疾病常见的有疱疹、脑炎、麻疹、腮腺炎、小儿麻痹症、传染性肝炎、病毒性心肌炎病、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感、疱疹性角膜炎等。此外，病毒与肿瘤、某些心脏病、先天性畸形等也有一定关系。在临床上较多的疾病与病毒感染有关。据国外统计资料报道，近3/4的传染病是由病毒引起的，1984年国际病毒分类学会(ICTV)已公布的55种病毒中有18种属于致病病毒，不同的病毒感染引起不同的疾患，需要不同的抗病毒药物治疗。
目前临床上用的抗病毒药物虽然较多，但大多为核苷类衍生物，其作用是以病毒DNA聚合酶为靶点，它们以酶反应底物类似物的形式与正常底物竞争，直接降低或阻断DNA聚合酶的活性，其共同的缺点是易产生耐药毒株，抗病毒谱窄，毒副作用大，价格高昂或药理特性不明显。抗病毒药，有的只抑制DNA型病毒，如阿苷洛韦(无环鸟苷)、阿糖腺苷、阿糖胞苷、环胞苷、三氟尿苷等；有的则对RNA型病毒也有作用，如三氮唑核苷。除上述者外，尚有金刚胺、干扰素及其诱导剂也有较好的抗病毒作用。许多中草药，如穿心莲、板蓝根、大青叶、金银花、地丁、黄芩、紫草、贯众、大黄、茵陈、虎杖等也可用于某些病毒感染性疾病的防治。双嘧达莫也可用于抗病毒感染，对小儿病毒性上呼吸道感染和小儿疱疹性咽喉炎有治疗作用。

发明内容
本发明人经长期筛选研究发现，冬青属(Ilex)植物具有较强的抗病毒活性，可用于由病毒引起的多种疾病的治疗。本发明的目的是提供冬青属(Ilex)植物用于制备治疗由病毒引起的多种疾病的药物中的用途，尤其是用于制备治疗尤其是由病毒引起的疱疹、脑炎、麻疹、腮腺炎、小儿麻痹症、传染性肝炎、病毒性心肌炎病、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感、疱疹性角膜炎等疾病中的用途。
本发明提供冬青属(Ilex)植物用于制备治疗由病毒引起的多种疾病的药物中的用途。所述的冬青(Ilex)属植物选自岗梅(Ilex asprella Champ.)；铁冬青(Ilex rotunda Thunb)；苦丁茶(Ilex kudingcha C.J.Tseng)；毛冬青(Ilex pubescens Hook.et Arn.)；海南冬青(Ilex hainanensis Merr)；米碎木(Ilex godajam(Colebr.)Wall.)；冬青(Ilex purpureaHassk)；大叶冬青(Ilex latifolia Thunb.)；枸骨(Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.)；满树星(llex aculeolata Nakai)；珊瑚冬青(llex corallina Franch)；榕叶冬青(llexficoidea Hemsl.)；山枇耙(llex franchetiana Loes.)；长梗冬青(llex pedunculosa Miq.)；猫儿刺(llex pernyi Franch.)；大果冬青(llex macrocarpa Oliv.)；硬毛冬青(llex serrataThunb.)；三花冬青(llex triflora Bl.)；亮叶冬青(llex viridis Champ.)；秃毛冬青(Ilexpubescens Hook.et Arn.var.glabra Chang)任意一种或几种。优选地，所述的冬青属植物选自枸骨；苦丁茶；岗梅；冬青；大叶冬青中的任意一种或几种。
本发明还提供一种用于制备治疗由病毒引起的多种疾病的药物的冬青属(Ilex)植物提取物，具体的说是以冬青属(Ilex)植物原生药或冬青属(Ilex)植物的水或有机溶剂的提取物为活性成分制备所述的药物。所述的提取物来自所述植物的根、茎、皮、叶或果实。
其中在所述的冬青属植物提取物中，主要成分是皂苷、黄酮。
在所述冬青属植物的提取过程中，所使用的有机溶剂为甲醇、乙醇、正丁醇或丙酮。所述的提取方法选自浸泡提取、回流提取、超声提取、逆流提取、超临界萃取和树脂吸附中的一种或几种。
本发明还提供一种药物组合物，所述组合物包括上述的冬青(Ilex)属植物提取物和药学上可接受的载体或辅助性成分。
上述的冬青(Ilex)属植物及其提取物可用于制备治疗由病毒引起的疾病特别是疱疹、脑炎、麻疹、腮腺炎、小儿麻痹症、传染性肝炎、病毒性心肌炎病、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感、疱疹性角膜炎等疾病的药物。
优选地，所述冬青属植物及其提取物可用于治疗疱疹、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感、疱疹性角膜炎等疾病。
本发明冬青属植物，例如枸骨，在治疗急性上呼吸道感染时的用量按重量计为10-5000mg/kg/日，较优选用量为300-400mg/kg/日。本发明冬青属植物，例如枸骨提取物在治疗急性上呼吸道感染时的用量按重量计为1-400mg/kg/日，较优选用量为10-40mg/kg/日。由于存在不同个体的自身免于能力不同，本发明的植物或其提取物的使用量不限于所述范围。
冬青属植物用于治疗由病毒引起的疾病的药物时，可以是将冬青属植物原生药直接加工成药物，也可以是对冬青属植物原生药进行分离提取，将各种提取物制成药品，也可以是将冬青属植物原生药或各种提取物配合其他药物制成复方制剂，还可以是冬青属植物原生药或各种提取物与其他抗病毒类传统中药配伍组成复方中药及其制剂。
用冬青属植物原生药(根、茎、皮、叶或果实)任一种为原料，直接加工成药品。可以是将上述原生药净制后粉碎，过60-200目筛，制成细粉，再将细粉装胶囊，或制备成片剂、丸剂、颗粒剂、散剂。
用冬青(Ilex)属植物原生药(根、茎、皮、叶、果实)任一种为原料，进行初步提取后制备成药品。可以采用现代技术中的各种常规提取方法进行提取，例如，以水为溶剂提取，或者以乙醇、甲醇等有机溶剂提取，优选乙醇提取。所得的提取物，加上药学上可接受的载体，如淀粉、乳糖、蔗糖、怡糖、糊精、纤维素类、琼脂、硬脂酸镁、滑石、植物油、阿拉伯胶，明胶等，可以制成胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、注射液、粉针等多种剂型。
用冬青(Ilex)属植物原生药任一种为原料，提取分离出皂苷后制备成药品。可以采用以下常规皂苷分离提取方法将原药材经过净制后粉碎为粗粉，用水，甲醇或乙醇，室温或加热(包括回流)提取1-3小时，可重复提取1-3次，然后滤去药渣，滤液在常压或减压下浓缩至一定浓度的浓缩液，静置备用。将上述提取浓缩液经沉淀剂后用大孔树脂吸附，然后用浓度为30-90％的乙醇洗脱大孔树脂，洗脱液减压回收后，得浸膏，经真空、冷冻干燥或喷雾干燥成干粉。也可将上述浸膏经进一步分离纯化为皂苷类单体或混合苷。
冬青(Ilex)属植物原生药，或其水提物，或其有机溶剂提取物、或其皂苷提取物或其中药复方制备的药物及其制剂具有显著的抗病毒药理作用。
由于冬青(Ilex)属植物原生药，或其水提物，或其有机溶剂提取物，或其皂苷提取物或其药物复方制备的药物及其制剂，具有显著的抗病毒作用，可将其制成胶囊、片剂、颗粒剂、口服液或注射液、粉针等多种剂型，适用于由病毒引起的疾病特别是疱疹、脑炎、麻疹、腮腺炎、小儿麻痹症、传染性肝炎、病毒性心肌炎病、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感、疱疹性角膜炎等疾病的治疗，具有疗效显著、价格低廉、使用安全方便等优势特点，也为制备由病毒引起的疾病特别是疱疹、脑炎、麻疹、腮腺炎、小儿麻痹症、传染性肝炎、病毒性心肌炎病、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感、疱疹性角膜炎等疾病的药物提供一种新的药源植物。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式
实施例1制备方法1 岗梅(Ilex asprella)、毛冬青Ilex pubescens Hook.et Arn.)原生药药品的制备 以冬青(Ilex)属植物中一种为原料，即岗梅根，或毛冬青根，净制后按常规方法粉碎，过筛，制成粒度小于120目的细粉，细粉装入胶囊，0.5g/粒，灭菌，分装即成。
制备方法2 铁冬青(Ilex rotunda Thunb.)、米碎木(Ilex godajam(Colebr.)Wall.)的水提取物的制备 以冬青(Ilex)属植物中一种为原料，即铁冬青树皮、或米碎木的树皮，除去杂质，取原生药500g，粉碎后加入10倍量水，加热回流提取2小时，滤渣再加10倍量水，加热回流提取2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩干燥后得到铁冬青水提取物88克(编号KV-1)，或米碎木水提取物93克(编号KV-2)。
制备方法3 苦丁茶(Ilex dingcha C.J.Tseng)、海南冬青(Ilex hainanensis Merr)、大叶冬青(llex latifolia Thunb.)、冬青(Ilex purpurea Hassk.)、枸骨(Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.)乙醇提取物的制备以冬青(Ilex)属植物中一种为原料，即苦丁茶的叶、或海南冬青的叶、或大叶冬青的叶、或冬青的叶、或枸骨的叶，除去杂质，取原生药500g，粉碎后加70％乙醇溶液4升，加热回流提取2小时，滤渣再加70％乙醇溶液3升，加热回流提取2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩干燥后得到苦丁茶乙醇提取物114g(编号KV-3)、或海南冬青乙醇提取物106g(编号KV-4)、或大叶冬青乙醇提取物113g(编号KV-5)、或冬青乙醇提取物109g(编号KV-6)、或枸骨乙醇提取物99g(编号KV-7)。
制备方法4 枸骨(Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.)皂苷提取物的制备 以枸骨叶为原料，除去杂质，取原生药1000g，粉碎后加入10倍量水，加热回流提取2小时，滤渣再加10倍量水，加热回流提取2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩至一定浓度，提取液加95％乙醇使含醇量到60％，取上清液，浓缩至无醇味，再用AB-8型大孔树脂吸附，先用水和30％稀乙醇液洗脱柱子，然后用含70％稀乙醇液洗脱柱子，收集70％稀乙醇洗脱液，洗脱液减压回收后，得浸膏，真空干燥成干粉，得到约20g提取物干粉(编号KV-8)，经测定含有皂苷57％。
制备方法5 岗梅(Ilex asprella)皂苷提取物的制备 以岗梅根为原料，取原生药1000g，碎成粗粉，用75％乙醇回流提取，过滤，回收乙醇适量至无醇味，加蒸馏水适量，过滤，用D-101型大孔树脂吸附，先用水和30％稀乙醇液洗脱柱子，然后用含70％稀乙醇液洗脱柱子，收集70％稀乙醇洗脱液，洗脱液减压回收后，得浸膏，真空干燥成干粉，得到约18g提取物干粉(编号KV-9)，经测定含有皂苷61％。
制备方法6 毛冬青Ilex pubescens Hook.et Arn.)总皂苷提取物的制备 以毛冬青根为原料，取原生药1000g，碎成粗粉，加入10倍量水，加热回流提取两次，每次2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩至一定浓度，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇萃取液浓缩至无醇味，再用XDA-6型大孔树脂吸附，先用水和30％稀乙醇液洗脱柱子，然后用含70％稀乙醇液洗脱柱子，收集70％稀乙醇洗脱液，洗脱液减压回收后，得浸膏，真空干燥成干粉(编号KV-10)，得到约15g提取物干粉，经测定含有皂苷59％。
制备方法7 大叶冬青(llex latifolia Thunb.)总皂苷提取物的制备 以大叶冬青叶为原料，取原生药1000g，碎成粗粉，加入10倍量水，加热回流提取两次，每次2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩至一定浓度，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇萃取液浓缩至无醇味，再用D-101型大孔树脂吸附，先用水和30％稀乙醇液洗脱柱子，然后用含70％稀乙醇液洗脱柱子，收集70％稀乙醇洗脱液，洗脱液减压回收后，得浸膏，真空干燥成干粉，得到约17g提取物干粉(编号KV-11)，经测定含有皂苷52％。
制备方法8 铁冬青(Ilex rotunda Thunb.)总皂苷提取物的制备 以铁冬青树皮为原料，取原生药1000g，碎成粗粉，用8倍量75％乙醇回流2次，每次2小时，合并提取液，浓缩至无醇味，离心，上清液用AB-8型大孔树脂吸附，先用水和30％稀乙醇液洗脱柱子，然后用含70％稀乙醇液洗脱柱子，收集70％稀乙醇洗脱液，洗脱液减压回收后，得浸膏，真空干燥或喷雾干燥成干粉，得到约19g提取物干粉(编号KV-12)，经测定含有皂苷62％。
制备方法9 苦丁茶(Ilex kudingcha C.J.Tseng)总皂苷提取物的制备 以苦丁茶叶为原料，取原生药1000g，碎成粗粉，加入10倍量水，加热回流提取2小时，滤渣再加10倍量水，加热回流提取2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩至一定浓度，离心，上清液再用D-101型大孔树脂吸附，先用水和30％稀乙醇液洗脱柱子，然后用含70％稀乙醇液洗脱柱子，收集70％稀乙醇洗脱液，洗脱液减压回收后，得浸膏，真空干燥成干粉，得到约21g提取物干粉(编号KV-13)，经测定含有皂苷52％。
制备方法10 冬青(Ilex purpurea Hassk.)总皂苷提取物的制备 以冬青叶为原料，取原生药1000g，碎成粗粉，加入10倍量水，加热回流提取2小时，滤渣再加10倍量水，加热回流提取2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩至一定浓度，离心，上清液再用D-101型大孔树脂吸附，先用水和30％稀乙醇液洗脱柱子，然后用含70％稀乙醇液洗脱柱子，收集70％稀乙醇洗脱液，洗脱液减压回收后，得浸膏，真空干燥成干粉，得到约18g提取物干粉(编号KV-14)，经测定含有皂苷54％。
实施例2 KV-1～KV-14体外抗病毒试验研究KV-1～KV-14等提取物，配成每毫升含生药1克溶液。阳性对照药双黄连注射液(山西太行药业股份有限公司生产)，为棕红色的澄明液体。试验用的病毒有柯萨奇病毒B3、B4、A16(CVB3、CVB4、CVA16)，新型肠道病毒71型(EV71)，以上四种病毒来源于中国药品生物制品检定所，脊髓灰质炎病毒III型(PVIII)，埃可病毒6型(ECHO6V)，腺病毒III型(AdVIII)，单纯疱疹病毒I型(HSV-I)、呼吸道合胞病毒(RSV)，单纯疱疹病毒II型(HSV-2)、流感病毒(A3V)，以上七种病毒来源于中国预防科学院病毒学研究所，麻疹病毒(MV)，风疹病毒(RV)、人巨细胞病毒(HCMV)，以上三种病毒来源于中国科学院武汉病毒研究所。所用14种病毒分别接种于来源于中国预防科学院病毒学研究所的人羊膜细胞(FL)，人胚肾细胞(293)，人宫颈癌细胞(Hela)和人喉癌细胞(Hep-2)细胞，以测定其敏感性，细胞按照常规方法传代。同时制成3×105/L的细胞悬液，每孔0.1毫升，24小时后形成单层细胞备用。本试验采用组织细胞半数感染量(TCID50)微量法测定病毒毒力，采用不同病毒的100～200TCID50/0.1ml。初筛的过程为形成单层的细胞孔弃去培养液，加入对细胞无毒性浓度的药物作用24小时，吸出药液加入病毒液，均采用37℃吸附1小时后吸出，加入含药的维持液，置37℃、5％CO2恒温培养箱培养48～96小时，待病毒对照孔病变达+++～++++，细胞对照正常时测定结果。将初筛有意义的病毒分4组试验，探讨药物的具体作用环节。I组为感染前24小时给药，吸出药液，用Hank’S液洗4次，加入病毒液；II组为感染后给药，先加病毒液置37℃吸附1小时，洗去病毒，加含药维持液；III组为药液与病毒液同时加入细胞层；IV组为药液与病毒液混合，置37℃作用2小时后加入细胞层。以上均设正常对照组及相应的病毒对照组、阳性对照组。光镜下观察细胞病变(CPE)。根据CPE程度，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)能被活细胞内脱氢酶还原而染色的特性，使用酶标测定仪在570nm测定A值。药物对组织细胞保护率用下式计算保护率(％)＝(加药孔A值-病毒对照孔A值)/细胞对照孔A值×100％。
1∶32以上稀释的KV-1～KV-14提取物、1∶16以上稀释的双黄连注射液，对FL、Hela、293和Hep-2细胞未见明显的细胞毒性作用。
选用药液与病毒液同时加入上述4种细胞层的方法，测定了1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256等5个浓度KV-1等14个系列提取物的抗病毒作用。结果1∶16、1∶32、1∶64、1∶1284个稀释度的14个提取物均有明显的抗病毒效应(p＜0.01)。根据毒性测定结果，本实验采用1∶32稀释双黄连注射液和14个提取物。
初筛结果利用光镜检查CPE，结果表明14个提取物均可不同程度地抑制14种病毒对组织细胞的CPE(见表1，以KV-13提取物为代表)。而且提取物(以KV-13提取物为代表)的抗病毒作用谱比与双黄连注射液的抗病毒作用谱广，效果显著，见表2。
表1KV-13对病毒所诱导CPE的影响

-无细胞病变效应；±细胞出现病变效应的时间推迟；++++3/4的细胞发生细胞病变效应表2KV-13与双黄连注射液对病毒的病变效应比较结果


-无细胞病变效应；±细胞出现病变效应的时间推迟；++++3/4的细胞发生细胞病变效应分组结果在镜下观察CPE的基础上，用MTT染色测定A值，以便客观地反映加药与不加药之差别。I组实验的目的是观察药物能否进入细胞或吸附于细胞表面，以组织病毒的吸附与进入，结果表明，14个提取物对A3V、AdVIII、MV、RSV、HSV-1、HSV-2、CVB3、CVB4、CVA16等9种病毒均有抗病毒作用(p＜0.05)；II组实验目的是观察药物能否对已进入细胞内的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟释放，结果表明，14个提取物对A3V、AdVIII、MV、RSV、HSV-1、HSV-2、CVB3、CVB4、CVA16、EV71等10种病毒有意义(p＜0.05)；III、IV组为药物与病毒再不同条件下作用，观察药物对病毒的直接灭活作用，结果表明，在KV-1～KV-14提取物中，其中KV-13提取物对细胞的保护率可高达96％，详见表3～6。
表314个提取物对组织培养细胞病毒感染的保护率比较(％)(组I)

表414个提取物对组织培养细胞病毒感染的保护率比较(％)(组II)


表514个提取物对组织培养细胞病毒感染的保护率比较(％)(组III)

表614个提取物对组织培养细胞病毒感染的保护率比较(％)(组IV)

对KV-1～KV-14提取物在不同种细胞上的抗14种RNA及DNA病毒作用结果表明，KV系列提取物具有明显及较广的抗病毒效应，特别对呼吸合胞病毒、流感病毒和疱疹病毒有显著效果。关于KV-1～KV-14提取物的抗病毒作用机理，从分组实验结果看出，其作用是多途径的，不仅有直接灭活病毒的作用，而且对吸附于细胞表面和进入细胞内的病毒均有抑制作用。本研究证明KV-1～KV-14提取物的抗病毒作用强于双黄连。而且在KV-1～KV-14提取物中，其中KV-13、KV-8、KV-7等提取物的抗病毒作用最强。
实施例3 枸骨(Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.)总皂苷抗柯萨奇B3(CVB)病毒引起心肌炎的实验研究制备方法4的方法制的提取物干粉(编号KV-8)，配成药液A液2.5mg/ml，B液2mg/ml，C液1.5mg/ml；将254只小鼠随机分为8组，其中预防组(A、B、C液)、治疗组(A、B、C液)和模型组采用腹腔接种0.2mlCVB3以诱导小鼠病毒性心肌炎模型。正常对照组同法接种0.2ml不含病毒的Eagle液，预防组在接种前2天给药。治疗组在接种病毒后1小时以200ml/kg灌胃给药，每日1次。病毒对照组及正常组小鼠给等量生理盐水灌胃。连续观察小鼠表现，分别在3、5、7、10、15天乙醚麻醉活杀各KV-8组6只小鼠。各对照组3只小鼠，对在实验治疗期死亡小鼠亦收取心脏检测。心脏巨检及心脏做组织学检查，HE染色，光学显微镜下观察各组小鼠心肌组织病变程度及心肌炎发生率。
结果见表7，显示出药物对心肌有较强的保护作用，这种保护作用在预防组中更明显。
表7KV-8体内抗病毒保护心肌作用

心室段横切面+孤立病灶；++＜5个小灶性坏死散病灶；+++＞5个片状坏死；*P＜0.05；**P＜0.01实施例4 苦丁茶(Ilex kudingcha C.J.Tseng)总皂苷对流感病毒性肺炎的实验研究制备方法9的方法制的提取物干粉(编号KV-13)，配成不同浓度的药液；小白鼠随机分8组，每组10只，p o给药，每天2次，连续5天，正常对照组及病毒对照组灌服相同体积的生理盐水，阳性药物对照灌服病毒唑，于第6天在乙醚麻醉下，用流感病毒FM1株15个LD 50量滴鼻感染，同时设生理盐水滴鼻对照，感染后96小时解剖小白鼠，取肺称重，算出肺指数，肺指数值大，表示肺病变程度严重。结果在0.05g/kg及以上剂量的苦丁茶总皂苷均能抑制流感病毒引起的小白鼠肺炎，见表8。
肺指数＝肺重(g)/体重(g)×100肺指数抑制率％＝(病毒对照组肺指数均值-试验组肺指数均值)÷病毒对照组肺指数均值×100％表8KV-13对流感病毒性肺炎的影响(x±s)


**与病毒对照相比p＜0.01结果可见，感染后小鼠肺指数值明显增大，苦丁茶总皂苷在所试剂量范围内对流感病毒感染小鼠引起的肺炎有明显的抑制作用，肺指数值明显降低。表明苦丁茶总皂苷对流感病毒感染小鼠所致肺病变有抑制作用。
实施例5 枸骨叶乙醇提取物(KV-7)治疗带状疱疹临床观察制备方法3的方法制得枸骨叶提取物干粉(编号KV-7)，配成一定浓度的口服液诸位治疗组，每支10ml，含提取物3g，每天3次，每次1支；对照组口服无环鸟苷片，每次200mg，每天5次。
疗效观察按临床缩短病程及疼痛减轻最早天数进行对比。两组均在治疗过程中记录停止出现新疱时间(简称止疱)、水疱干涸时间(简称结痂)、疼痛减轻时间(按病人自我感觉疼痛开始减轻时间)、痊愈时间及全程。治愈皮疹全部消退，疼痛消失；有效皮疹消退40％以上，疼痛减轻；无效皮疹消退40％以下，或疼痛未减轻。以治疗日开始计算，结果见表9结果表明枸骨叶乙醇提取物(KV-7)治疗带状疱疹疗效优于无环鸟苷。
表9KV-7治疗带状疱疹临床观察

*与对照组比较(x2检验)P＜0.05 **与对照组比较(x2检验)P＜0.01实施例6 枸骨(Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.)总皂苷胶囊治疗急性上呼吸道感染的临床研究制备方法4的方法制的提取物干粉(编号KV-8)，制备胶囊，用每日3次，每次1g的剂量口服，并以双黄连口服液(河南竹林众生制药股份有限公司生产)做对照，每支10mL，每次2支，每日2次，疗程与治观察急性上呼吸道感染发热患者202例，疗程3d。
总体疗效判定参照《中药新药治疗感冒的临床研究指导原则》的要求，按痊愈、显效、有效、无效四级评定疗效。痊愈服药72h内，体温恢复正常(腋温降至37℃以下，不再回升)，症状消失，异常理化指标恢复正常。显效服药72h内，体温恢复正常，主要症状大部分消失，异常理化指标接近正常。有效服药72h内，体温较以前降低，主要症状部分消失，异常理化指标有所改善。无效不符合以上标准者。枸骨总皂苷胶囊愈显率92.23％，双黄连口服液愈显率66.67％，前者疗效优于后者(P＜005)。结果见表10。
表10KV-8胶囊、双黄连口服液两组治疗急性上呼吸道感染的疗效比较

注与双黄连口服液组相比*P＜005实施例7 苦丁茶(Ilex kudingcha C.J.Tseng)总皂苷治疗流行性出血性结膜炎临床试验对照组用0.1％羟苄唑眼药水和0.1％利福平眼药水交替滴眼，口服病毒灵，每次0.1g，每日3次，用药7天。
治疗组局部眼药治疗与对照组相同，同时口服苦丁茶(Ilex kudingcha C.J.Tseng)总皂苷，制备方法9的方法制的提取物干粉(编号KV-13)，制成的胶囊，每粒含提取物0.3g，每次3粒，每日2次，用药7天。
疗效标准治愈眼刺痛发痒、畏光流泪、异物感、灼热感等症状完全消失，无沙涩不适感，无分泌物，眼睑不红肿，结膜充血水肿消退，结膜下出血吸收；显效眼刺痛发痒、畏光流泪、异物感、灼热感、沙涩不适感明显减轻或消失，无分泌物，眼睑不红肿，结膜充血水肿基本消退，结膜下出血大部分吸收；好转眼刺痛发痒、畏光流泪、沙涩异物感减轻或仍部分存在，分泌物减少，眼睑红肿、结膜充血水肿减轻，结膜下出血部分吸收；无效用药7天后，上述诸症无明显改善。结果见表11。
表11KV-13治疗结果及疗效比较

注*与对照组比较，P＜0.01。
对照组平均治愈天数为5.3天，治疗组为3.2天，经统计学处理，治疗组治愈时间明显短于对照组(P＜0.01)。
权利要求
1.冬青属植物及其提取物在制备治疗由病毒引起的疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述的冬青属植物选自岗梅；铁冬青；苦丁茶；毛冬青；海南冬青；米碎木；冬青；大叶冬青；枸骨；满树星；珊瑚冬青；榕叶冬青；山枇耙；长梗冬青；猫儿刺；大果冬青；硬毛冬青；三花冬青；亮叶冬青；秃毛冬青中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1或2的用途，其特征在于，所述的冬青属植物选自枸骨；苦丁茶；岗梅；冬青；大叶冬青中的任意一种或几种。
4.根据权利要求1或2的用途，其特征在于，以冬青属植物原生药或冬青属植物的水或有机溶剂的提取物为活性成分制备所述的药物。
5.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述的由病毒引起的各种疾病是疱疹、脑炎、麻疹、腮腺炎、小儿麻痹症、传染性肝炎、病毒性心肌炎病、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感或疱疹性角膜炎。
6.根据权利要求5的用途，其特征在于，所述的由病毒引起的各种疾病是疱疹、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感或疱疹性角膜炎。
7.一种冬青属植物提取物，其特征在于，所述的提取物来自所述植物的根、茎、皮、叶或果实。
8.根据权利要求7的冬青属植物提取物，其特征在于所述组合物主要含皂苷、黄酮。
9.根据权利要求7或8的冬青属植物提取物，其特征在于，提取过程中使用的有机溶剂为甲醇、乙醇、正丁醇或丙酮；提取方法选自浸泡提取、回流提取、超声提取、逆流提取、超临界萃取和树脂吸附中的一种或几种。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括冬青属植物原生药或提取物和药学上可接受的载体或辅助性成分。
全文摘要
本发明涉及冬青属植物及其提取物在制备治疗由病毒引起的疾病的药物中的用途。所述的冬青属植物原生药，具有显著抗病毒作用，可将其制成多种剂型，适用于由病毒引起的多种疾病治疗，尤其是由病毒引起的疱疹、脑炎、麻疹、腮腺炎、小儿麻痹症、传染性肝炎、病毒性心肌炎病、病毒性肺炎、病毒性呼吸道感染、流感、疱疹性角膜炎等疾病。所述药物具有疗效显著、价格低廉、使用安全方便等优势特点。
文档编号A61P11/00GK1872105SQ200610074298
公开日2006年12月6日 申请日期2006年4月8日 优先权日2006年4月8日
发明者冯秀明 申请人:冯秀明