抗鸡新城疫病毒特异性转移因子及口服液制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了一种抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，包括：选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫；监测实验鸡体内新城疫病毒疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到28～29时，无菌取实验鸡的脾脏；处理所述鸡的脾脏得到抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。本发明的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子可以提高鸡体对新城疫病毒抗原的特异性免疫效应，能保护正常机体细胞免受病毒感染，因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸡新城疫病毒感染，保护正常机体细胞免受鸡新城疫病毒侵害的作用，从而降低发病率；同时对于遭到鸡新城疫病毒感染的鸡使用转移因子进行治疗，可有效的改善临床症状，提高治愈率，降低死亡率。
【专利说明】抗鸡新城疫病毒特异性转移因子及口服液制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及抗鸡新城疫病毒特异性转移因子及口服液制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]鸡新城疫(ND)又称亚洲鸡瘟，是由禽副流感病毒型新城疫病毒(NDV)引起的一种主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类的高度接触传染性、致死性疾病。病鸡发病后表现为呼吸困难，咳嗽气喘，出现水样稀粪，重者死亡。新城疫病毒最大的特点就是易发生变异，导致鸡体内已经出现的抗鸡新城疫病毒特异性抗体失去中和病毒的作用，因而使鸡容易感染，甚至造成大规模流行。
[0003]尽管目前已经有一些抗鸡新城疫病毒的药物制剂，但是现有药物制剂的针对性不强，疗效有限，而且，治疗性制剂多是在发病后才应用的，不起预防作用。对于新城疫易感鸡群，定期对鸡群免疫接种新城疫疫苗是预防新城疫的有效方法。其次，应提高鸡体自身免疫力，通过药物干预提高机体抗感染能力或调解免疫力，也是一种预防新城疫的有效方法，转移因子可起到此作用。
[0004]转移因子(transfer factor,TF)是由小于IOKD(道尔顿)大小的分子组成的,是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。
[0005]从免疫学上分 ，TF可分为特异性转移因子和非特异性转移因子两大类。特异性转移因子系采用某种特定病原感染或免疫人群、动物后再提取含该抗原特异活性的转移因子。目前人医临床已经应用有乙型肝炎病毒特异转移因子、各种肿瘤特异转移因子、流行性出血热病毒转移因子、布氏菌转移因子、疱疹病毒转移因子、乙型脑炎转移因子、结核菌转移因子等。
[0006]TF的特异性免疫学活性作用机制为:特异性活性是指TF具有转移特异性细胞免疫反应的能力，转变非免疫的淋巴细胞，使其能与相应抗原结合，此活性的存在依赖于TF供体的免疫状态，活性的检测需要有特异抗原的刺激，活性的表达非常迅速并可用受体TF连续传递。TF的特异性活性表现在如下几个方面:(I)转移皮肤迟发型超敏反应:TF能够转移特异性皮肤迟发型超敏反应。(2)诱导淋巴细胞对特异抗原反应:TF在体内外都可将特异性免疫信息传递给淋巴细胞，使其处于致敏状态。TF抗原特异活性据推测是T细胞直接或间接通过巨噬细胞进行的，经特异性抗原免疫后制成的TF可使受体淋巴细胞或正常非免疫淋巴细胞在体外经TF致敏后，在试管中呈阳性反应。另外，白细胞移动抑制试验(LMI)也是检测TF抗原特异活性的简便方法，存在相关抗原时，细胞移动受到抑制，而非相关抗原则细胞移动不受到抑制。
[0007]传统生产方法生产的转移因子都是关于非特异性转移因子的制备方法，且针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定。原料经预处理、绞碎、匀浆、反复冻融、离心、透析、离心、过滤等工艺制成，经传统生产工艺加工会破坏原材料的生物活性成分，有效成分利用率低，且生产周期长，至少需要7天。此外，传统工艺中绞碎工艺多采用立式胶体磨，灭活多是在37°C灭活24小时，冻融工艺多采用-20°C反复冻融8次以上，离心分离多采用4°C，4200r/min离心15min,效率低,产品易变性。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是现有技术生产的转移因子都是关于非特异性转移因子的。
[0009]本发明的技术方案如下:
[0010]一种抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，包括:选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫；监测实验鸡体内新城疫病毒疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到28~29时，无菌取实验鸡的脾脏；处理所述鸡的脾脏得到抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。
[0011]进一步，所述选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫包括:首次免疫每只实验鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只实验鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只实验鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗；所述无菌取实验鸡的脾脏包括:将实验鸡的脾脏置于无菌玻璃器皿中，用1%的新洁尔灭溶液浸泡半小时，浸泡完后用酒精消毒脾脏表面，用剪刀剪去脂肪及包膜，用pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲(PBS)液洗涤一次，将脾脏剪成小段放入平皿中并用眼科剪将脾脏剪成Im3小块，用pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液洗涤3次，以除去血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞。
[0012]进一步，所述处理所述鸡的脾脏包括:剪摘、称量清洗、初绞、精绞、灭活、冻融、离心分离和超滤。
[0013]进一步:所述初绞的次数为I~3次。
[0014]进一步:所述精绞包括将初绞的猪脾与纯化水按1:1~2的质量比混合，置于胶体磨中研磨得到匀浆，所述精绞的时间为I~3分钟。
[0015]进一步:所述灭活包括将质量占匀衆质量的0.1~0.3%甲醒溶液加入到匀楽:中，所述甲醛溶液中甲醛的质量浓度≥37% ;所述灭活的条件为37~40°C下灭活6~10小时，中间间隔2~4小时震摇I次。
[0016]进一步:所述冻融包括将灭活的匀浆置于_80°C冻融，反复冻融2~4次。
[0017]进一步:所述离心分离采用管式离心机，将冻融的匀浆在室温下以12000~15000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用；所述超滤使用截留分子量为5000~6000道尔顿的中空纤维超滤膜对上清液进行过滤，再用0.20~0.24μπι的微孔滤膜进行过滤除菌。
[0018]本发明所要解决的另一技术问题是现有技术生产的转移因子的口服液都是关于非特异性转移因子的口服液。
[0019]本发明的另一技术方案如下:
[0020]一种如上所述的制备方法制备的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的口服液的制备方法，包括:向抗鸡新城疫病毒特异性转移因子中加入注射用水，加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.3之间，得到抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的口服液。
[0021]本发明的又一技术方案如下:
[0022]一种如上所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的口服液的提高鸡体对新城疫病毒抗原的特异性免疫的用途。
[0023]本发明的技术效果如下:
[0024]1、本发明的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子制备的口服液口服后可以提高鸡体对新城疫病毒抗原的特异性免疫效应，能保护正常机体细胞免受病毒感染，因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸡新城疫病毒感染，保护正常机体细胞免受鸡新城疫病毒侵害的作用，从而降低发病率；同时对于遭到鸡新城疫病毒感染的鸡使用转移因子进行治疗，可有效的改善临床症状，提高治愈率，降低死亡率。
[0025]2、本发明生产的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子制备的口服液主要成分为低分子活性多肽和核糖，是一种低分子肽-核苷酸复合物，而不是蛋白质；其应用安全，过量使用也无毒副作用，无药物残留；活性高，临床用量小，见效快，使用后24~36小时就可发挥作用，效果可持续7天以上。
[0026]3、本发明制备的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液给7日龄雏鸡饮用，每只0.2ml,同时免疫新城疫疫苗，7天后测血清抗体，比普通鸡脾制备的转移因子的鸡只抗体高2~3个滴度。
[0027]4、本发明的灭活和冻融工艺可大大缩短生产周期，本发明改进工艺后生产周期仅需3天，节省了大量的人力物力，提高了转移因子的生产效率，为满足工业化大规模生产提供了可行途径。
[0028]5、本发明的制备方法应用分体胶体磨，优选为JM-F-100分体胶体磨，避免了以前立式胶体磨转速低，液体易与电机直接接触的缺点，以及克服了电机工作中产生的热与磨齿产生的热互串，易使电机发热，从而使被处理物料变性的缺点，有效的保护了原料中原有的生物活性物质不被破坏，极大的提高了生产效率，增加了产量，适合工业化大规模推广应用。
[0029]6、本发明的制备方法应用管式离心机，克服了制备过程中原料粘度大，颗粒小，比重差小，絮状物多等问题；且加工材料原有生物活性成分主要为多肽、氨基酸，本发明制备方法有效的保护了加工材料原有生物活性成分不被破坏；同时采用室温下12000~15000r/min高速连续离心的方法，避免了传统方法中离心温度和时间的限制,节省了生产时间，极大的节省了人力物力，增加了产量，每天产量可达2.5吨，约2500L，提高了收益率，Ikg脾脏大约出2.3L半成品，适用于工业化大规模推广应用。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0031]实施例1:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备
[0032]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备的步骤如下:
[0033]步骤S1:饲喂健康鸡群。
[0034]选取健康的鸡，按常规饲养程序饲喂20~30天。健康鸡是指没有任何疾病、变异或者潜在疾病的鸡。[0035]步骤S2:选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫。
[0036]首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗。
[0037]步骤S3:无菌取实验鸡的脾脏。
[0038]监测实验鸡体内新城疫病毒疫苗免疫抗体水平，第三次免疫后一周，在抗体水平达到28~29时取鸡脾脏。将新鲜的鸡脾脏置于无菌玻璃器皿中，用1%的新洁尔灭溶液浸泡半小时，浸泡完后用酒精消毒脾脏表面，用剪刀剪去脂肪及包膜，用PBS液(pH为7.2~7.4)洗涤一次，再将脾脏剪成小段放入平皿中并用眼科剪将脾脏剪成Im3小块，再用PBS(pH为7.2~7.4)液洗涤3次，以除去血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞。
[0039]步骤S4:初绞。
[0040]将鸡脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞2次，并用洁净物料桶盛装。
[0041]步骤S5:精绞。
[0042]将初绞的鸡脾与纯化水按1:2的质量比混合，置于立式胶体磨装料斗中，按立式胶体磨操作规程将其研磨1.5分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。
[0043]步骤S6:灭活。
[0044]按匀浆总质量的0.1%加甲醛溶液，37°C灭活6小时，间隔2小时震摇I次。甲醛溶液中甲醛的质量浓度> 37%。
[0045]步骤S7:冻融。
[0046]将灭活的匀浆，置于_80°C冷库反复冻融2次，融化温度不超过37°C。
[0047]步骤S8:离心分离。
[0048]将冻融的匀浆置于管式分离机中，室温以13000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。
[0049]步骤S9:超滤。
[0050]使用截留分子量为5000道尔顿的中空纤维超滤膜对上清液进行加压过滤。再用0.22 μ m的微孔滤膜进行过滤除菌，即得超滤液为抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。超滤液在-20°C以下，保存期为12个月。
[0051]步骤SlO:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子检验。
[0052]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，_20°C保存备用。
[0053]步骤Sll:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备。
[0054]将抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的溶液移入配液罐中，根据抗鸡新城疫病毒特异性转移因子含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.0mg/ml，核糖含量不少于30 μ g/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.3之间，混匀，即得抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。
[0055]实施例2:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备
[0056]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备的步骤如下:[0057]步骤S1:饲喂健康鸡群。
[0058]选取健康的鸡，按常规饲养程序饲喂20~30天。健康鸡是指没有任何疾病、变异或者潜在疾病的鸡。
[0059]步骤S2:选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫。
[0060]首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗。
[0061]步骤S3:无菌取实验鸡的脾脏。
[0062]监测实验鸡体内新城疫病毒疫苗免疫抗体水平，第三次免疫后一周，在抗体水平达到28~29时取鸡脾脏。将新鲜的鸡脾脏置于无菌玻璃器皿中，用1.5%的新洁尔灭溶液浸泡半小时，浸泡完后用酒精消毒脾脏表面，用剪刀剪去脂肪及包膜，用PBS (pH为7.2~7.4)液洗涤2次，再将脾脏剪成小段放入平皿中，并用眼科剪将脾脏剪成Im3小块，再用PBS(pH为7.2~7.4)液洗涤2次，以除去血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞。
[0063]步骤S4:初绞。
[0064]将鸡脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞3遍，并用洁净物料桶盛装。
[0065]步骤S5:精绞。
[0066]将初绞的鸡脾与纯化水按1:1.5的质量比混合，置于立式胶体磨装料斗中，按立式胶体磨操作规程将其研磨2分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。
[0067]步骤S6:灭活:
[0068]按匀浆总质量的0.2%加甲醛溶液，37°C灭活8小时，间隔3小时震摇I次。甲醛溶液中甲醛的质量浓度> 37%。
[0069]步骤S7:冻融。
[0070]将灭活的匀浆，置于_80°C冷库反复冻融3次，融化温度不得超过37°C。
[0071]步骤S8:离心分离。
[0072]将冻融的匀浆置于管式分离机中，室温以15000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。
[0073]步骤S9:超滤。
[0074]使用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维超滤膜对上清液进行加压过滤。再用0.22 μ m的微孔滤膜进行过滤除菌，即得超滤液为抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。超滤液在-20°C以下，保存期为12个月。
[0075]步骤SlO:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子检验。
[0076]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，_20°C保存备用。
[0077]步骤Sll:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备。
[0078]将抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的溶液移入配液罐中，根据抗鸡新城疫病毒特异性转移因子含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.0mg/ml，核糖含量不少于30 μ g/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.3之间，混匀，即得抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。
[0079]实施例3:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备
[0080]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备的步骤如下:
[0081]步骤S1:饲喂健康鸡群。
[0082]选取健康的鸡，按常规饲养程序饲喂20~30天。健康鸡是指没有任何疾病、变异或者潜在疾病的鸡。
[0083]步骤S2:选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫。
[0084]首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗。
[0085]步骤S3:无菌取实验鸡的脾脏。
[0086]监测实验鸡体内新城疫病毒疫苗免疫抗体水平，第三次免疫后一周，在抗体水平达到28~29时取鸡脾脏。将新鲜的鸡脾脏置于无菌玻璃器皿中，用1%的新洁尔灭溶液浸泡半小时，浸泡完后用酒精消毒脾脏表面，用剪刀剪去脂肪及包膜，用PBS (pH为7.2~7.4)液洗涤3次，再将脾脏剪成小段放入平皿中，并用眼科剪将脾脏剪成Im3小块，再用PBS (pH为7.2~7.4)液洗涤4次，以除去血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞。
[0087]步骤S4:初绞。
[0088]将鸡脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞3遍，并用洁净物料桶盛装。
[0089]步骤S5:精绞。
[0090]将初绞的鸡脾与纯化水按1:1的质量比混合，置于立式胶体磨装料斗中，按立式胶体磨操作规程将其研磨3分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。
[0091]步骤S6:灭活。
[0092]按匀浆总质量的0.3%加甲醛溶液，40°C灭活10小时，间隔4小时震摇I次。甲醛溶液中甲醛的质量浓度> 37%。
[0093]步骤S7:冻融。
[0094]将灭活的匀浆，置于_80°C冷库反复冻融4次，融化温度不得超过37°C。
[0095]步骤S8:离心分离。
[0096]将冻融的匀浆置于管式分离机中，室温以12000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。
[0097]步骤S9:超滤。
[0098]使用截留分子量为5500道尔顿的中空纤维超滤膜对上清液进行加压过滤。再用0.23 μ m的微孔滤膜进行过滤除菌，即得超滤液为抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。超滤液在-20°C以下，保存期为12个月。
[0099]步骤SlO:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子检验。
[0100]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，-20°C保存备用。
[0101]步骤Sll:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备。[0102]将抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的溶液移入配液罐中，根据抗鸡新城疫病毒特异性转移因子含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.0mg/ml，核糖含量不少于30 μ g/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.3之间，混匀，即得抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。
[0103]实施例4:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备
[0104]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备的步骤如下:
[0105]步骤S1:饲喂健康鸡群。
[0106]选取健康的鸡，按常规饲养程序饲喂20~30天。健康鸡是指没有任何疾病、变异或者潜在疾病的鸡。
[0107]步骤S2:选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫。 [0108]首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗。
[0109]步骤S3:无菌取实验鸡的脾脏。
[0110]监测实验鸡体内新城疫病毒疫苗免疫抗体水平，第三次免疫后一周，在抗体水平达到28~29时取鸡脾脏。将新鲜的鸡脾脏置于无菌玻璃器皿中，用1%的新洁尔灭溶液浸泡半小时，浸泡完后用酒精消毒脾脏表面，用剪刀剪去脂肪及包膜，用PBS (pH为7.2~7.4)液洗涤3次，再将脾脏剪成小段放入平皿中，并用眼科剪将脾脏剪成Im3小块，再用PBS (pH为7.2~7.4)液洗涤4次，以除去血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞。
[0111]步骤S4:初绞。
[0112]将鸡脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞I遍，并用洁净物料桶盛装。
[0113]步骤S5:精绞。
[0114]将初绞的鸡脾与纯化水按1:1.2的质量比混合，置于立式胶体磨装料斗中，按立式胶体磨操作规程将其研磨I分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。
[0115]步骤S6:灭活。
[0116]按匀浆总质量的0.25%加甲醛溶液，39°C灭活7小时，间隔4小时震摇I次。甲醛溶液中甲醛的质量浓度> 37%。
[0117]步骤S7:冻融。
[0118]将灭活的匀浆，置于_80°C冷库反复冻融2次，融化温度不得超过37°C。
[0119]步骤S8:离心分离。
[0120]将冻融的匀浆置于管式分离机中，室温以14000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。
[0121]步骤S9:超滤。
[0122]使用截留分子量为5500道尔顿的中空纤维超滤膜对上清液进行加压过滤。再用0.24μπι的微孔滤膜进行过滤除菌，即得超滤液为抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。超滤液在-20°C以下，保存期为12个月。
[0123]步骤SlO:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子检验。[0124]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，_20°C保存备用。
[0125]步骤Sll:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备。
[0126]将抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的溶液移入配液罐中，根据抗鸡新城疫病毒特异性转移因子含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.0mg/ml，核糖含量不少于30 μ g/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.3之间，混匀，即得抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。
[0127]实施例5:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备
[0128]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备的步骤如下:
[0129]步骤S1:饲喂健康鸡群。
[0130]选取健康的鸡，按常规饲养程序饲喂20~30天。健康鸡是指没有任何疾病、变异或者潜在疾病的鸡。
[0131]步骤S2:选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫。
[0132]首次免疫每只鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1 .0ml油乳剂灭活苗。
[0133]步骤S3:无菌取实验鸡的脾脏。
[0134]监测实验鸡体内新城疫病毒疫苗免疫抗体水平，第三次免疫后一周，在抗体水平达到28~29时取鸡脾脏。将新鲜的鸡脾脏置于无菌玻璃器皿中，用1%的新洁尔灭溶液浸泡半小时，浸泡完后用酒精消毒脾脏表面，用剪刀剪去脂肪及包膜，用PBS (pH为7.2~7.4)液洗涤3次，再将脾脏剪成小段放入平皿中，并用眼科剪将脾脏剪成Im3小块，再用PBS (pH为7.2~7.4)液洗涤4次，以除去血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞。
[0135]步骤S4:初绞。
[0136]将鸡脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞I遍，并用洁净物料桶盛装。
[0137]步骤S5:精绞。
[0138]将初绞的鸡脾与纯化水按1:1.5的质量比混合，置于立式胶体磨装料斗中，按立式胶体磨操作规程将其研磨2分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。
[0139]步骤S6:灭活。
[0140]按匀浆总质量的0.2%加甲醛溶液，37°C灭活8小时，间隔2小时震摇I次。甲醛溶液中甲醛的质量浓度> 37%。
[0141]步骤S7:冻融。
[0142]将灭活的匀浆，置于_80°C冷库反复冻融2次，融化温度不得超过37°C。
[0143]步骤S8:离心分离。
[0144]将冻融的匀浆置于管式分离机中，室温以15000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。
[0145]步骤S9:超滤。
[0146]使用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维超滤膜对上清液进行加压过滤。再用0.22 μ m的微孔滤膜进行过滤除菌，即得超滤液为抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。滤液在-20°C以下，保存期为12个月。
[0147]步骤SlO:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子检验。
[0148]抗鸡新城疫病毒特异性转移因子经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，_20°C保存备用。
[0149]步骤Sll:抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液的制备。
[0150]将抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的溶液移入配液罐中，根据抗鸡新城疫病毒特异性转移因子含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.0mg/ml，核糖含量不少于30 μ g/ml，搅拌30分钟后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.3之间，混匀，即得抗鸡新城疫病毒特异性转移因子口服液。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。
[0151]实施例6:初绞次数对抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的影响
[0152]传统工艺中初绞次数一般为3次，经反复研究确定初绞次数为I次，极大的节省了人力物力。
[0153]本发明的制备方法中，将鸡脾脏使用绞肉机进行不同次数的重复绞碎，每组绞碎的脾脏样品设置3个平行样，其他生产工艺按照实施例2的步骤执行，不同绞碎次数生产出的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子含量检测结果见表1。
[0154]表1不同绞碎次数生产出的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子含量检测结果
[0155]
【权利要求】
1.一种抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征在于，包括: 选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫； 监测实验鸡体内新城疫病毒疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到28~29时，无菌取实验鸡的脾脏； 处理所述鸡的脾脏得到抗鸡新城疫病毒特异性转移因子。
2.如权利要求1所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征在于， 所述选择健康鸡作为实验鸡进行新城疫灭活疫苗强化免疫包括:首次免疫每只实验鸡注射0.5ml弱毒疫苗，14d后进行第二次免疫，每只实验鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，21d时进行第3次免疫，每只实验鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗，28d时进行第四次免疫，每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗； 所述无菌取实验鸡的脾脏包括:将实验鸡的脾脏置于无菌玻璃器皿中，用1%的新洁尔灭溶液浸泡半小时，浸泡完后用酒精消毒脾脏表面，用剪刀剪去脂肪及包膜，用PH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液洗涤一次，将脾脏剪成小段放入平皿中并用眼科剪将脾脏剪成Im3小块，用pH为7.2~7.4的磷酸盐缓冲液洗涤3次，以除去血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞。
3.如权利要求1所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征在于，所述处理所述鸡的脾脏包括:剪摘、称量清洗、初绞、精绞、灭活、冻融、离心分离和超滤。
4.如权利要求3所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征在于:所述初绞的次数为I~3次。
5.如权利要求3所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征在于:所述精绞包括将初绞的猪脾与纯化水按1:1~2的质量比混合，置于胶体磨中研磨得到匀浆，所述精绞的时间为I~3分钟。
6.如权利要求3所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征在于:所述灭活包括将质量占匀浆质量的0.1~0.3%甲醛溶液加入到匀浆中，所述甲醛溶液中甲醛的质量浓度≥37% ;所述灭活的条件为37~40°C下灭活6~10小时，中间间隔2~4小时震摇I次。
7.如权利要求3所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征在于:所述冻融包括将灭活的匀浆置于-80°C冻融，反复冻融2~4次。
8.如权利要求3所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法，其特征在于: 所述离心分离采用管式离心机，将冻融的匀浆在室温下以12000~15000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用； 所述超滤使用截留分子量为5000~6000道尔顿的中空纤维超滤膜对上清液进行过滤，再用0.20~0.24 μ m的微孔滤膜进行过滤除菌。
9.一种如权利要求1~8任一项所述的制备方法制备的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的口服液的制备方法，其特征在于，包括: 向抗鸡新城疫病毒特异性转移因子中加入注射用水， 加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.3之间，得到抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的口服液。
10.一种如权利要求9所述的抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的口服液的提高鸡体对.新城疫病毒抗原的特异性免疫的用途。
【文档编号】A61K35/28GK103599130SQ201310539580
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】薛希娟, 李朝阳, 乔彦良, 吴庆海, 赵锋祥 申请人:山东信得科技股份有限公司