一种银杏根皮中低酸高纯度萜内酯提取物的制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种银杏根皮中低酸高纯度萜内酯提取物的制备工艺，以银杏根皮为原料，经粉碎至粗粉，加高浓度的乙醇提取，浓缩，加水稀释，经聚酰胺吸附树脂吸附洗脱，洗脱液浓缩，乙醇重结晶，得到的粗结晶经高效液相色谱分离，制得萜内酯提取物，其总内酯含量≥95%，总银杏酸含量≤1ppm。本发明方法克服了现有生产技术缺陷，具有生产工艺稳定可控、操作简便、产品质量高且稳定、成品得率高、生产成本较低等特点，且能将银杏根皮变废为宝，充分发挥其经济价值。
【专利说明】一种银杏根皮中低酸高纯度萜内酯提取物的制备工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种银杏根皮中低酸高纯度萜内酯提取物的制备工艺，属于中药制剂【技术领域】。
【背景技术】
[0002]银杏萜内酯是一类银杏叶和银杏根皮中特有的重要活性化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，主要成分包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯。银杏酸(GA)为银杏叶提取物中的毒副作用成分，具有致敏性、细胞毒性和免疫毒性等作用，对人类健康存在潜在危害，主要存在于银杏叶、银杏果及银杏根皮中；德国于1997年开始严格限定银杏叶制剂中GA水平在5ppm以下，欧洲药典在GBE标准中沿用了 5ppm的GA限度要求，中国药典2010年版也限定GBE中GA含量应在IOppm以下。
[0003]银杏萜内酯具有抑制血小板聚集、抑制血栓形成、保护血管内皮细胞、扩张冠状动脉等作用，为强血小板活化因子(PAF)拮抗剂。银杏内酯中每个内酯所起的作用有所不同，其中银杏内酯B的PAF (血小板活化因子)的选择性抗PAF的活性最强，其次为银杏内酯A和银杏内酯C ;银杏内酯A有抗焦虑作用，而银杏内酯B和C则并未有抗焦虑作用；白果内酯为神经系统、精神病的药物，对因年老而出现的呆傻现象有奇异的疗效，也用于治疗神经病、脑病和脊髓病，症状包括:感觉异常，软瘫或麻痹性痴呆，非正常神经反射，肌肉萎缩，肌肉痉挛，震颤，表面性或深度敏感性失调，头痛和四肢痛，语言失调，视力和听力失调，玄晕，神经失调和缺乏集中性，记忆力减退及定向力消失等。
[0004]银杏萜内酯提取物除了作为制药原料以外，在国内还被大量用于保健品和食品的开发，在国外被作为一种优良的膳食补充剂而大量使用，因此，近年来，国内外市场上对萜内酯提取物的需求不断增加。而目前市场上`绝大部分的萜内酯提取物来源于银杏叶，对于银杏根皮中内酯提取物的开发较少。
[0005]由于银杏叶中萜内酯含量较银杏根皮中含量高，且银杏叶提取物中萜内酯含量达6-12%，故目前大多数萜内酯提取物的制备都从银杏叶或银杏叶提取物中分离得到，相关的文献报道也很多，但银杏叶或提取物的原料成本较高。由于银杏根皮中萜内酯总含量仅
0.1-0.2%左右，一般被老百姓视作废料处理，而市场上纯度> 90%的萜内酯提取物价格为数万至十万元每公斤，以价格低廉的银杏根皮为原料产业化制备高纯度萜内酯提取物具有较大的潜在市场。
[0006]经检索，目前关于银杏根皮萜内酯提取物制备的文献和专利较少，例如文献《银杏根皮中萜内酯提取工艺研究》中仅考察了根皮内酯含量测定的提取工艺参数，并非大生产工艺。部分研究报道的制备工艺中采用水、碱水浸泡或回流提取，如专利97107809.2《银杏内酯的提取方法和含有银杏内酯的制剂》、201110071505.3《一种银杏内酯的提取精制方法》和201210116022.5《提取分离银杏内酯A、B、C、J、M及白果内酯的工艺》，由于银杏萜内酯极性较小，难溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂，故采用水提工艺的内酯转移率远低于醇提工艺，提取效率较低；而碱水提取还会破坏其中含量较高的白果内酯。部分研究也有针对其中GA、GC单体的分离，如专利201010294667.9《一种从银杏树根皮中提取银杏内酯A、C的制作工艺》和201110067186.9《从银杏根皮中分离、纯化银杏内酯C的方法》，单体制备分离的工艺相对较复杂，同时损失了其他萜内酯成分，生产成本远高于混合内酯的制备成本，大生产采用有机溶剂萃取对生产设备要求较高，安全性存在一定隐患，且内酯GA、GC单体开发的市场需求量远不如内酯提取物的市场需求大，不适宜大批量制备。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于:利用廉价的银杏根皮原料，提供一种生产工艺稳定可控、操作简便、成品转移率高、产品质量高且稳定、生产成本较低的高纯度银杏萜内酯的制备工艺，将银杏根皮变废为宝，充分发挥其经济价值。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案包括: 本发明提供了一种银杏根皮中低酸高纯度萜内酯提取物的制备工艺，以银杏根皮为原料，银杏根皮粉碎，加乙醇溶液提取；提取液浓缩，加水稀释，经聚酰胺吸附树脂吸附洗脱；收集吸附残液和水洗脱液，浓缩，用乙醇重结晶；经高效液相色谱分离，得到萜内酯提取物，其总内酯含量> 95%、总银杏酸含量< lppm，成品转移率高，工艺恒稳性好。
[0009]本发明具体步骤如下:
步骤1，乙醇提取:取粉碎后的银杏根皮，加10-15倍量的质量分数为60-80%乙醇水溶液回流提取2-3次，提取液浓缩至无醇，得浓缩液；其中乙醇含量< 5%。
[0010]由于根皮中纤维成分较多，粉碎程度不同会直接影响提取效率，因此本发明所述的粉碎后的根皮明确为:粉碎至粗粉，即过24目筛。
[0011]所述的10-15倍量的60-80%乙醇水溶液回流提取2-3次，优选条件为用12倍量的70%乙醇水溶液加热回流提取3次。
[0012]步骤2，聚酰胺吸附树脂纯化:浓缩液加纯化水稀释至密度为1.0-1.lg/mL(50°C )，上聚酰胺吸附树脂，加3-4倍柱体积的水洗脱，收集吸附残液和水洗脱液，浓缩，得稠膏。
[0013]所述的上柱液优选稀释至密度为1.01-1.03 g/mL (50°C)。
[0014]所述的聚酰胺树脂粒度为100-200目。
[0015]所述的水洗的用量优选条件为加3倍柱体积的纯化水洗脱。
[0016]所得稠膏密度为1.2-1.5 g/mL (50°C)，优选条件为1.3-1.4 g/mL。
[0017]步骤3，粗结晶的制备:稠膏加入一定量的乙醇至溶液浓度为20-40%，60°C水浴加热使其完全溶解，过滤，滤液置冰箱冷藏，重结晶；结晶后母液再重复操作，得粗结晶；
所述的乙醇水溶液优选条件为30%乙醇水溶液。
[0018]所述的冰箱冷藏条件为0_4°C，保存8_12h ;优选重结晶冰箱冷藏条件为0_2°C。
[0019]优选母液重结晶次数为3次。
[0020]步骤4，制备分离:粗结晶用适量甲醇水溶解，经高效液相色谱分离，重复进样，合并内酯部位流分，减压浓缩，干燥，即得纯度> 95%的萜内酯提取物。
[0021]所述的适量甲醇水溶解，优选条件为加质量分数为60-80%的甲醇水溶液，温水浴加热，使其处于过饱和溶解状态。
[0022]所述的高效液相色谱分离，优选条件为采用C18制备色谱柱，流动相为30-50%甲醇-水，紫外检测波长为218nm，流速为200-500mL/min，进样量为50_100mL/次，重复进样，收集BB至GB间的五个内酯流分。
[0023]所述的干燥方式优选减压干燥、冷冻干燥或微波干燥之一。
[0024]本发明银杏根皮中低酸高纯度萜内酯提取物的制备工艺，步骤I中采用60-80%乙醇水溶液作为提取溶剂，在保证内酯提取完全的情况下，摒弃了部分大极性成分的进入，减少了干扰，这也是研究工艺不需要采用有机溶剂萃取的主要因素之一。
[0025]步骤2采用聚酰胺吸附树脂进行纯化，可以去除部分脂溶性成分，以减少其对重结晶过程的干扰，尤其是对根皮中的已知毒性成分银杏酸进行了有效的去除，为保证产品质量安全起到了很好的控制作用。
[0026]步骤3通过低醇度乙醇的数次重结晶，所得粗结晶中的总内酯转移率达到80%以上，总内酯含量达到95%左右，达到了良好的重结晶效果。
[0027]步骤4采用高效液相色谱分离，收集从BB到GB在内的5个成分的内酯流分，分离要求就远比分离单体的低得多，采用的流动相甲醇-水可重复回收利用，大幅降低了生产成本，制备量可达到公斤级以上的生产要求，符合生产预期。
[0028]本发明提出的一种银杏根皮中低酸高纯度萜内酯提取物的制备工艺，具有如下优
点
1.按本发明生产的高纯度银杏萜内酯提取物，总内酯含量>95%，总银杏酸含量≤ lppm,广品质量闻且稳定；
2.本发明的成品转移率高，如总内酯转移率达到80%以上，总内酯含量达到95%以
上；
3.本发明方法不需要有机溶剂萃取，具有生产工艺安全、稳定可控，操作简便，生产成本较低，经济效益好的优点。
[0029]具体实施方案:
下面的实施例，用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明尽显于此。实施例中取值为本发明所述范围的任意具体数值，均为可实施。
[0030]本研究采用的银杏内酯含量测定方法见《中国药典》银杏叶提取物的相关项目；高效液相分离的色谱条件如下:
色谱柱:Agilent C18 pursuit制备色谱柱；
流动相:30-50%甲醇-水；
紫外检测波长:218nm ；
流速:200-500mL/min ；
进样量:50-100mL/次。
[0031]实施例1
银杏根皮，去杂，粉碎至粗粉(过24目筛)，取银杏根皮粗粉100kg，加入质量分数为60%的乙醇1000kg，加热回流提取2次，合并两次提取液，减压浓缩至无醇(乙醇含量小于5%)，得浓缩液；加水稀释至50°C下密度为1.0g/mL，稀释液上100目聚酰胺吸附树脂吸附，用3倍柱体积的纯化水洗脱，收集吸附残液和水洗脱液，减压浓缩至密度1.25g/mL (50°C)，得稠膏；加入一定量的乙醇至溶液浓度为20%，60°C水浴加热使其完全溶解，过滤，滤液迅速置冰箱冷藏8h，重结晶，其冰箱冷藏温度为0-4°C ;重结晶后母液再依据上述重结晶方法反复重结晶3次，合并所有结晶，得粗结晶；粗结晶经高效液相色谱分离，重复进样，合并收集BB至GB间的五个内酯流分，浓缩，减压干燥(60°C /0.08MPa)，得高纯度银杏萜内酯提取物。产品总内酯转移率为80.7%，总内酯含量为96.2%，总银杏酸含量为0.52ppm。
[0032]实施例2
取银杏根皮粗粉100kg，加入80%乙醇1200kg，加热回流提取3次，合并两次提取液，减压浓缩至无醇，加水稀释至50°C下密度为1.05g/mL，稀释液上200目聚酰胺吸附树脂吸附，用4倍柱体积的纯化水洗脱，收集吸附残液和水洗脱液，减压浓缩至密度1.42g/mL(50°C )，加入一定量的乙醇至溶液浓度为40%，60°C水浴加热使其完全溶解，过滤，滤液迅速置冰箱冷藏12h，重结晶。重结晶后母液再反复重结晶3次，合并所有结晶，得粗结晶。粗结晶经高效液相色谱分离，重复进样，合并收集BB至GB间的五个内酯流分，浓缩，减压干燥，得高纯度银杏萜内酯提取物。总内酯转移率为86.1%，总内酯含量为97.1%，总银杏酸含量为0.37ppm。
[0033]实施例3
取银杏根皮粗粉500kg，加入70%乙醇7500kg，加热回流提取3次，合并两次提取液，减压浓缩至无醇，加水稀释至50°C下密度为1.10g/mL，稀释液上300目聚酰胺吸附树脂吸附，用4倍柱体积的纯化水洗脱，收集吸附残液和水洗脱液，减压浓缩至密度1.31g/mL(50°C )，加入一定量的乙醇至溶液浓度为30%，60°C水浴加热使其完全溶解，过滤，滤液迅速置冰箱冷藏10h，重结晶。重结晶后母液再反复重结晶3次，合并所有结晶，得粗结晶。粗结晶经高效液相色谱分离，重复进样，合并收集BB至GB间的五个内酯流分，浓缩，减压干燥(60°C /0.08MPa)，得高纯度银杏萜内酯提取物。总内酯转移率为84.3%，总内酯含量为95.8%，总银杏酸含量为0.69ppm。
[0034]实施例4
取银杏根皮粗粉500kg，加入75%乙醇6000kg，加热回流提取3次，合并两次提取液，减压浓缩至无醇，加水稀释至50°C下密度为1.04g/mL，稀释液上100目聚酰胺吸附树脂吸附，用4倍柱体积的纯化水洗脱，收集吸附残液和水洗脱液，减压浓缩至密度1.29g/mL(50°C),加入一定量的乙醇至溶液浓度为30%，60°C水浴加热使其完全溶解，过滤，滤液迅速置冰箱冷藏10h，重结晶。重结晶后母液再反复重结晶3次，合并所有结晶，得粗结晶。粗结晶经高效液相色谱分离，重复进样，合并收集BB至GB间的五个内酯流分，浓缩，减压干燥，得高纯度银杏萜内酯提取物。总内酯转移率为85.3%，总内酯含量为96.4%，总银杏酸含量为
0.28ppm。
[0035]实施例5
取银杏根皮粗粉500kg，加入75%乙醇5500kg，加热回流提取3次，合并两次提取液，减压浓缩至无醇，加水稀释至50°C下密度为1.07g/mL，稀释液上200目聚酰胺吸附树脂吸附，用4倍柱体积的纯化水洗脱，收集吸附残液和水洗脱液，减压浓缩至密度1.35g/mL(50°C )，加入一定量的乙醇至溶液浓度为30%，60°C水浴加热使其完全溶解，过滤，滤液迅速置冰箱冷藏10h，重结晶。重结晶后母液再反复重结晶3次，合并所有结晶，得粗结晶。粗结晶经高效液相色谱分离，重复进样，合并收集BB至GB间的五个内酯流分，浓缩，减压干燥(60°C /0.08MPa)，得高纯度银杏萜内酯提取物。总内酯转移率为84.6%，总内酯含量为95.8%，总银杏酸含量为0.74ppm。[0036]实施例6
依据专利申请号201110071505.3《一种银杏内酯的提取精制方法》的制备方法测定制得成品的转移率，内酯的含量。具体如下:
取银杏根皮粉碎后过40目筛，称取50kg，加乙酸钠溶液200L，浸泡3小时，过滤，弃去滤液，得到滤渣；滤渣加50-70°C热水浸提3次，每次加热水300L，提取时间为4小时/次，过滤，得浸提液；将浸提液浓缩至总体积的1/10，得浓缩液；浓缩液用4倍量的95%乙醇水溶液溶解，搅拌40min，过滤，滤液回收乙醇，至醇度< 5%，即得无醇浓缩液；浓缩液用醋酸乙酯萃取3次，醋酸乙酯与浓缩液的比例为1:2，合并萃取液；萃取液浓缩，减压干燥(600C /0.08MPa),即 得内酯提取物。测得总内酯含量为78.4%，总内酯转移率为56.8%。结果显示，该方法制备内酯提取物转移率较低，且总内酯含量不高。
【权利要求】
1.一种银杏根皮中低酸高纯度萜内酯提取物的制备工艺，以经粉碎的银杏根皮为原料，加乙醇溶液提取；提取液浓缩，加水稀释，经聚酰胺吸附树脂吸附洗脱；收集吸附残液和水洗脱液，浓缩，加乙醇溶液重结晶；再经高效液相色谱分离，得到低酸高纯度萜内酯提取物，其总内酯含量> 95%，总银杏酸含量< Ippm;具体制备步骤如下:1)取粉碎后的银杏根皮，加60-80%乙醇水溶液回流提取2-3次，提取液浓缩至无醇，得浓缩液；2)浓缩液加纯化水稀释至50°C下密度为1.0-1.lg/mL，上聚酰胺吸附树脂，水洗，收集吸附残液和水洗脱液，浓缩，得稠膏；3)稠膏加入一定量乙醇水溶液，60°C水浴加热使其完全溶解，过滤，滤液置冰箱冷藏，重结晶；结晶后母液再重复操作，得粗结晶；4)粗结晶用适量甲醇水溶解，经高效液相色谱分离，重复进样，合并内酯部位流分，减压浓缩，干燥，即得纯度>95%的低酸萜内酯提取物。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是步骤I)所述的60-80%乙醇水溶液为:每公斤银杏根皮加入10-15倍的60-80%乙醇水溶液，回流提取。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是步骤I)所述的浓缩至无醇为:浓缩至乙醇含量小于5%。
4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是步骤2)所述的聚酰胺树脂粒度为100-200目；所述的水洗的用量为3-4倍柱体积；所述的稠膏为50°C下密度为1.2-1.5 g/mT.n
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是步骤3)所述的一定量乙醇水溶液为:加入一定量的乙醇至溶液浓度为20-40% ;所述的滤液置冰箱冷藏为:滤液置冰箱0-4°C，冷沉8-12h。
6.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是步骤3)所述的结晶后母液再重复操作为:结晶后母液浓缩，再用20-30倍量的20-40%乙醇水溶液重结晶，操作3次。
7.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是步骤4)所述的粗结晶用适量甲醇水溶解为:粗结晶一定量加60-80%的甲醇水溶液,温水浴加热,使其处于过饱和溶解状态。
8.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征是步骤4)所述的经高效液相色谱分离为:采用C18制备色谱柱，流动相为30-50%甲醇-水，紫外检测波长为218nm，流速为200-500mL/min，进样量为50_100mL/次，重复进样，收集BB至GB间的五个内酯流分。
【文档编号】A61K36/16GK103610708SQ201310576700
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】姚建标, 王如伟, 叶剑锋, 方玲, 吴旭明, 金辉辉, 胡林水 申请人:浙江康恩贝制药股份有限公司, 浙江康恩贝药品研究开发有限公司