专利名称：：西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚甲、乙素及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体是一类从中国南海豆荚软珊瑚(丄o6op/^wwsp.)中分离得到的新西松烷内酯型二碎化合物豆荚软珊瑚甲、乙素(lobophilidesA，B)及其制备方法和用途。该类化合物对多种肿瘤细胞株具有强烈的抑制作用，可作为一类研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为治疗各种临床常见多发癌症的药物。
背景技术：
：珊瑚系低等腔肠门动物，该类海洋生物全球有6100多种，其中中国有496种。软珊瑚是指腔肠门珊瑚纲八放珊瑚亚纲软珊瑚亚目动物。软珊瑚亚目又分6个科，即尸ara/cyo""cbe，v4/qyow7fibe,软珊瑚中富含结构新颖次生代谢产物，其化合物的结构类型主要包括二萜、倍半萜、多羟基甾醇和前列腺素等。豆荚软珊瑚属于」/c""/Wfle科，是最早受到关注也是研究最多的软珊瑚之一，研究范围涉及20多个品种。其化学成分报道最多的是西松烷型和洛贝型二萜。在开发利用我国的海洋生物资源，从中寻找具有生物活性及药用前景的海洋天然产物的过程中，我们发现，中国南海豆荚软珊瑚的乙酸乙酯粗提物在体外抗肿瘤筛选实验中对A549人肺腺癌细胞主株显示良好的抑制活性。进一步的生物活性跟踪研究，导致了新西松烷内酯型二碎化合物豆荚软珊瑚甲、乙素的发现。文献检索表明，豆荚软珊瑚曱、乙素是高度氧化、结构新颖的西松烷内酯型二辟化合物。体外抗肿瘤生物活性筛选实验表明，豆荚软珊瑚曱素对八549人肺腺癌细胞抹显示明显的细胞毒性；豆荚软珊瑚乙素则对A549人肺腺癌细胞抹及P388小鼠白血病细胞抹均有显著的抑制作用。
发明内容本发明的目的在于提供一种从中国南海豆荚软珊瑚中提取分离得到的两个新的西松烷内酯型二碎化合物豆荚软珊瑚曱、乙素。本发明的另一目的是提供上述西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚曱、乙素的制备方法。本发明的还一目的是提供上述西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚曱、乙素在制备治疗癌症和/或肺瘤的药物中应用。本发明的西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚曱、乙素分别具有如下的化学结构式这2个化合物均系首次从中国三亚陵水产豆荚软珊瑚中提取得到,故分别命名为豆荚软珊瑚曱、乙素。豆荚软珊瑚甲素(lobophilideA)豆荚软珊瑚乙素(lobophilideB)本发明提供了从中国南海豆荚软珊瑚中提取分离化合物豆荚软珊瑚曱、乙素的方法，步骤如下1)提取将中国南海豆荚软珊瑚用酮溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏；将该粗浸膏加入NaCl溶液中，混悬均匀后用乙醚萃取，所得萃取液浓缩后得到乙醚浸膏；2)分离步骤1)中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/乙醚梯度洗脱；其中，石油醚/乙醚体积比50:50洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗碼纯化，得到豆荚软珊瑚乙素；石油醚/乙醚体积比20:80洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱纯化，得到豆荚软珊瑚曱素。在步骤1)提取中，所述的酮溶剂优选为丙酮，所述的NaCl溶液优选为0.71.5NNaCl溶液；并且所述酮溶剂提取是采用超声波提取；所述步骤2)中，所述的石油醚/乙醚梯度洗脱是以石油醚/乙醚体积比100:0—90:10—80:20—50:50—20:80—10:90—0:100进行梯度洗脱；所述步骤2)中石油醚/乙醚体积比50:50洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比1:8的石油醚/乙醚，将Rf值在0.250.35处的洗脱液合并、减压浓缩，得到豆荚软珊瑚乙素；所述步骤2)中石油醚/乙醚20:80洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比7:3的石油醚/丙酮，将Rf值在0.45-0.55处的洗脱液合并、减压浓缩，得到豆荚软珊瑚曱素。本发明对西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚曱、乙素进行了抗肿瘤活性测试，表明这些化合物具有明显的抗肿瘤作用。可用于制备治疗癌症和/或肺瘤的药物。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不限此。'H-NMR用VarianInova600型仪测定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Q-TOFMicroLC-MS-MS型质谱仪测定；所使用的硅胶，为青岛海洋化工厂生产；各种溶剂均由国药集团试剂有限公司生产，均为分析纯。如无特殊说明，以下实施例中涉及到的液/液之间比值均为体积比。实施例l:西松烷内酯型二辟化合物豆荚软珊瑚甲、乙素的制备(1)提取中国南海豆荚软珊瑚干重502g,用丙酮1000ml反复超声提取3次，提取液合并后减压浓缩，所得粗浸膏混悬于500mllNNaCl溶液中，以乙醚500ml反复萃取该混悬液3次，所得萃取液合并后减压浓缩得到乙醚浸膏2.5g。(2)分离乙醚浸膏2.5g经200-300目硅胶柱层析，以石油醚/乙醚100:0—90:10—80:20—50:50—20:80—10:90—0:100梯度洗脱，每个梯度用量1000ml;其中，石油醚/乙醚50:50洗脱液浓缩物得146.3mg，该部分经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为石油醚/乙醚1:8,将Rf值在0.25-0.35处的洗脱液合并、减压浓缩即得到豆荚软珊瑚乙素41.3mg;石油醚/乙醚20:80洗脱液浓缩物得520.0mg，该部分经SephadexLH-20凝月交柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂石油醚/丙酮7:3,将Rf值在0.45~0.55处的洗脱液合并、减压浓缩即得到豆荚软珊瑚曱素136.8mg。豆荚软珊瑚曱素的理化性状如下白色固体，光学活性问022+33.8°(c,0.535，CHC13);IR谱中出现3411(-OH),1735(a,P-不饱和酮)，1270,1020(a,p-不饱和羧酸酯)cm"等吸收峰；正离子模式电喷雾质谱给出准分子离子峰m/z355.2[M+Na]+和687.4[2M+Na]+，高分辨正离子模式电喷雾质谱显示其分子式为C2()H2804{w/z355.1883[M+Na]+,A=-0.2mmu}。}H与"CNMR数据见表1。同时，通过测定二维H-H相关谱(DQF-COSY)、H-C相关谱(HMQC)、H-C远程相关谱(HMBC)以及H-H核空间偶极相关谱(ROESY),确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。豆荚软珊瑚乙素的理化性状如下无色油状物，光学活性[a]D22+66.1(c,0.324,CHC13);IR谱中出现3479(-OH)，1732(a,(3-不饱和酮),1270,1027(a，|3-不饱和羧酸酯)等吸收峰；正离子模式电喷雾质谱给出准分子离子峰m/z339.2[M+Na]+和655.1[2M+Na]+,高分辨正离子模式电喷雾质谱显示其分子式为C2()H2803{w/z339.1955[M+Na]+,△=+1.9mmu}。与13CNMR数据见表2。同时，通过测定二维H-H相关谱(DQF-COSY)、H-C相关谱(HMQC)、H-C远程相关谱(HMBC)以及H-H核空间偶极相关谱(ROESY),确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的化学结构。表1.豆荚软珊瑚甲素的核磁共振波谱数据表a'b<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注aVarianInova600MHz;溶剂CDC13，S化学位移单位ppm，'H-NMR和"C-NMR分别以溶剂中残存的氯仿(SH7.26ppm)和氘代氯仿内标(5c77.0);b核磁共振信号的归属是在HMQC、HMBC等二维谱基础上完成的；e由DEPT谱完成信号归属。表2.豆荚软珊瑚乙素的核磁共振波谱数据表a'b<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>94.93，m124.0,d1910a2,31,m24.5,tiop2.28,mlla2.35，m34.6,t9，10,12,13,20UP2.23,m9,10,12,13,2012140.1,s135.22，dd，8.2，7.7124.8，d1,11,14,2014a2.33,m33.5,t14(32.29,m15139.3,s16a5.68,d,2.6122.8,t1，14,1716b6,27,d,2.61,14，15,1717170.2，s181.66,s17.5,q3,4，5,6191.61,s16,8,q7,8,920a4.11,s60.0,t11，12,1320b4.11,s11，12，13注aVarianInova600MHz;溶剂CDC13,5化学位移单位ppm,'H-NMR和^C-NMR分别以溶剂中残存的氯仿(5H7.26ppm)和氖代氯仿内标(5c77.0);b核磁共振信号的归属是在HMQC、HMBC等二维谱基础上完成的；e由DEPT谱完成信号归属。试验实施例1西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚曱、乙素的抗胂瘤活性测试对照组OD值一治疗组OD值肿瘤抑制率=-X100%对照组OD值测试原理MTT法活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氬酶，可将黄色的MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)还原为不溶性的蓝紫色曱臢(Formazan)，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用三联液溶解曱臢后可用酶标仪在570nm处检测光密度值。光密度值与活细胞数成正比。实验方法MTT法按不同肿瘤生成速率，将一定数量处于对数生长期的人肺腺癌细胞抹A-549,小鼠白血病细胞抹P-38890iul/孔分别接种于96孔培养板内，培养24小时后加入受试药液(即豆荚软珊瑚曱素、豆荚软珊瑚乙素的DMSO溶液)lOiul/孔，对每个细胞抹，每个浓度均为三个复孔，对照的新鲜培养基10(il/孔。肿瘤细胞在37。C、5%C02条件下培养48小时后，加无血清培养基新鲜配制的5mg/mlMTT液20pl/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10。/。SDS-5。/。异丁醇-0,01mol/LHCl)50jul/孔，于(302培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。实验结果如下10—5mol/L时对肿瘤细胞的抑制率西松烷内酯型二萜化-A-549P-388合物豆荚软珊瑚甲素^豆荚软珊瑚乙素95.7100总结经体外抗肿瘤药理活性研究表明，西松烷内酯型二薛化合物豆荚软珊瑚曱素对处于对数生长期的人肺腺癌细胞林A-549有显著的抑制作用，西松烷内酯型二辟化合物豆荚软珊瑚乙素对处于对数生长期的人肺腺癌细胞抹A-549和小鼠白血病细胞抹P-388有显著的抑制作用。因此，西松烷内酯型二碎化合物豆荚软珊瑚曱素、乙素可用于制备治疗癌症和/或胂瘤的药物。权利要求1.一类结构式如下的西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚甲素或乙素id="icf0001"file="A2007100380470002C1.gif"wi="101"he="28"top="50"left="46"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>豆荚软珊瑚甲素豆荚软珊瑚乙素。2、一种权利要求1所述的西松烷内酯型二碎化合物豆荚软珊瑚曱素或乙素的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤1)提取将中国南海豆荚软珊瑚用酮溶剂提取，所得提取液浓缩后得粗浸膏；将该粗浸膏加入NaCl溶液中，混悬均匀后用乙醚萃取，所得萃取液浓缩后得到乙醚浸膏；2)分离步骤1)中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚/乙醚梯度洗脱；其中，石油醚/乙醚体积比50:50洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱纯化，得到豆荚软珊瑚乙素；石油醚/乙醚体积比20:80洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱纯化，得到豆荚软珊瑚曱素。3、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤l)中，所述的酮溶剂为丙酮。4、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤1)中，所述的NaCl溶液为0.7-1.5NNaCl溶液。豆荚软珊瑚甲素豆荚软珊瑚乙素5、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤l)中，所述的酮溶剂提取是采用超声波提取。6、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤2)中，所述的石油醚/乙醚梯度洗脱是以石油醚/乙醚体积比100:0—90:10—80:20—50:50—20:80—10:90—0:100进行梯度洗脱。7、如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述步骤2)中石油醚/乙醚体积比50:50洗脱部分，经SephadexLH-20凝月交柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析检测，展开剂为体积比1:8的石油醚/乙醚，将Rf值在0.25~0.35处的洗脱液合并、减压浓缩，得到豆荚软珊瑚乙素；所述步骤2)中石油醚/乙醚20:80洗脱部分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脱，所得洗脱液经薄层层析4企测，展开剂为体积比7:3的石油醚/丙酮，将Rf值在0.45-0.55处的洗脱液合并、减压浓缩，得到豆荚软珊瑚曱素。8、权利要求1所述的西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚曱素或乙素在制备治疗癌症和/或肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明涉及一类从海洋软珊瑚中提取、分离获得的结构式的西松烷内酯型二萜化合物豆荚软珊瑚甲、乙素及其制备方法和用途。经多次体外抗肿瘤活性实验表明，该类化合物具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可望在制备治疗癌症/肿瘤的药物中应用。本发明还可为研制新的治疗各种常见多发癌症药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋生物资源具有重要意义。文档编号A61K31/365GK101265248SQ20071003804公开日2008年9月17日申请日期2007年3月14日优先权日2007年3月14日发明者健丁,周秀红,文张,林莉萍,郭跃伟申请人:中国科学院上海药物研究所