专利名称：：一种丝氨酸蛋白酶抑制剂及其衍生物在生育调节中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物技术和生育调节领域，具体地说，本发明涉及一种胚胎着床抑制剂及其在生育调节中的应用，所述的抑制剂是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(AEBSF)及其活性衍生物或其药学上可接受的盐。
背景技术：
：胚胎着床(又称胚胎植入)是指处于活化状态的胚胎与处于接受态的子宫相互作用，最后导致胚胎滋养层与子宫内膜建立紧密联系的过程。它是哺乳动物和人类特有的一个生殖生理步骤。因着床过程完成后才算真正怀孕，所以针对胚胎着床过程进行生育调控，不存在伦理问题，是一个理想的生育调控药具作用环节。此外，随着卵母细胞的体外培养和成熟、体外受精、受精卵的体外培养和发育等技术不断提高，移植后胚胎能否顺利着床，目前己成为影响人工辅助生育技术(ART/IVF)成功率的关键。胚胎相对于母体来说，是一个半异体组织，易受母体排斥，只能在一个特定的时间段内(艮卩"着床窗")才能被母体子宫内膜组织接纳。胚胎着床过程的完成有赖于母体子宫与胚胎的同步发育、母体子宫内膜容受性和"着床窗"的形成、以及母体子宫组织局部免疫耐受性的形成，涉及细胞的增殖和分化、局部免疫功能的调节。雌、孕激素在着床中的作用已很明确，现有的笛体类避孕药就是基于它们在生殖过程中的作用发展起来的。但是，由于雌、孕激素是内分泌激素，其作用是全身性的，因此还不是最理想的生育调控因子。在胚胎着床的过程中，胚胎的合体滋养细胞分泌一系列蛋白酶，通过降解子宫内膜的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)，促进子宫内膜的重构。细胞外基质是细胞产生的一些大分子物质，包括胶原蛋白、非胶原糖蛋白和蛋白多糖三大类。人子宫内膜ECM的大多数成分随着月经周期的不同阶段的变化而变化，与着床相关的是分泌中期和蜕膜化。早孕期胚泡粘附在蜕膜化的子宫内膜。着床时，透明带已完全溶解消失，内细胞群侧的滋养层首先与子宫内膜接触，分泌蛋白酶，在内膜溶出一个缺口，然后胚泡陷入缺口，逐渐被包埋其中。为使着床后的胚胎能够存活，合体滋养细胞要破坏蜕膜的毛细血管和静脉血管并穿透螺旋动脉，诱导螺旋动脉成为低阻力高血流的血管，以满足早期胚胎的营养需要。由于种种原因，人们对与胚胎着床有关的因素还知之甚少，目前已知的抑制胚胎着床的也很少，因此本领域迫切需要开发新的可用于抑制胚胎着床的物质。本发明的目的是提供一种新的可用于抑制胚胎着床的抑制剂及其在生育调节中的用途。在本发明的第一方面，提供了一种化合物的用途，所述的化合物是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物被用于制备调节生育的组合物或器具。在另一优选例中，所述化合物是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟。在另一优选例中，所述化合物是下式所示的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐。在另一优选例中，所述活性衍生物是具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟的衍生物。在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。在另一优选例中，所述的药物组合物为抑制胚胎着床的组合物。在另一优选例中，所述药物组合物是避孕药。在另一优选例中，所述的器具是避孕器具包括(但并不限于)阴道环、或宫内节育器等。在本发明的第二方面，提供了一种调节生育的器具，所述器具是用于女性的避孕器具，其中所述的避孕器具还包括用于在阴道或子宫内释放4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐的释放部件。
发明内容在另一优选例中，所述的释放部件设置于或固定于避孕器具的本体。在另一优选例中，所述的释放部件是缓释层。在另一优选例中，所述的器具是避孕器具包括(但并不限于)阴道环、或宫内节育器等。在本发明的第三方面，提供了一种非治疗目的的避孕方法，该方法包括给需要避孕的雌性哺乳动物施用4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。在另一优选例中，所述的施用是局部施用，更佳地为阴道内或子宫内局部施用。在本发明的第四方面，提供了一种化合物的用途，所述的化合物是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物及其药学上可接受的盐的用途，其中所述化合物被用作抑制胚胎着床的抑制剂。在另一优选例中，所述化合物是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟。在另一优选例中，所述化合物是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐。本发明的其它方面由于本文的技术公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。具体实施方式本发明人通过深入研究发现，首次意外地发现4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物(包括药学上可接受的盐)可抑制胚胎着床，而且该抑制作用是可逆的，因此特别适合将这类化合物用于调节生育。具体地，本发明人的研究表明，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟可以非常有效而安全地抑制胚胎的着床。在胚胎着床中起作用的蛋白酶，可根据它们的催化活性分为三大类基质金属蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。在生物学中，对丝氨酸蛋白酶研究最多。它们的共同特点是在其活性中心有丝氨酸残基，在中性pH环境活性最强。它们分布很广，它的种类也最多，共有20多个家族。而目前发现的与着床相关的丝氨酸蛋白酶如tPA，uPA、血管舒缓素、着床丝氨酸蛋白酶-1(ISP1)、着床丝氨酸蛋白酶-2(ISP2)均属于糜蛋白酶的Sl家族。Monzon等发现，人滋养细胞产生的u-PA在体外具有明显的蛋白溶解活性，能降解细胞外的纤维粘连蛋白，在胚胎着床中发挥重要作用。最近，O'Sullivan等发现的两种丝氨酸蛋白酶，ISP1和ISP2也可能在胚胎着床中发挥重要作用。本发明人经研究发现，将抗ISP2抗体注入宫腔，可抑制胚胎着床，并呈剂量效应。4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐对胚胎着床的抑制作用与抗ISP2抗体的抑制作用可能有相似之处。本发明人的研究提示，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐抑制胚胎着床的机理可能是通过抑制丝氨酸蛋白酶(其中可能包括tPA，uPA、血管舒缓素、ISP1、ISP2等糜蛋白酶S1家族的各种丝氨酸蛋白酶)的活性而干扰胚胎的着床。当然，应理解本发明的保护范围并不受该机理的影响。如本文所用，"活性成分"指4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。如本文所用，术语"4-(2-氨乙基)苯磺酰氟"指下式化合物4-(2-氨乙基)苯磺酰氟的英文名4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonylfluoride(縮写AEBSF);分子式C8H1QNS02F。AEBSF是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶、凝血酶及激肽释放酶。如本文所用，术语"本发明化合物"指AEBSF及其活性衍生物，该术语还包括AEBSF及其活性衍生物的药学上可接受的盐。本发明还包括AEBSF的活性衍生物。如本文所用，术语"活性衍生物"是指基本上保持了AEBSF的丝氨酸蛋白酶抑制活性的衍生物。如本文所用，术语"药学上可接受的盐"是指相对无毒的本发明化合物的无机酸加成盐或有机酸加成盐。这些盐可在化合物最后的分离和提纯过程中现场制备，或者是使纯化的化合物以其游离碱形式与适宜的有机或无机酸进行反应，再将形成的盐分离而制成。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。它们可包含基于碱金属和碱土金属的阳离子，如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒胺、季胺和胺阳离子，包括但不限于胺、四甲基胺、四乙基胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。一种优选的盐是无机酸加成盐，特别优选的是AEBSF的盐酸盐，其结构式如下4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的分子式C8H1QNS02FHC1;分子量为239.7。该化合物可溶于水，在PH<7的水溶液中比较稳定，可于4°C储存6个月；在pH〉7的水溶液中，则不稳定，应在使用时配制。如本文所用，术语"哺乳动物"包括(但并不限于)人、猴、牛、羊、猪、兔、鼠、猫、狗等动物。优选的哺乳动物包括灵长动物、啮齿动物、犬科动物和猫科动物以及各种家畜和宠物等。生育调节组合物本发明还提供了一种生育调节组合物，它含有安全有效量的本发明AEBSF以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是避孕有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他避孕剂一起使用。4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐可以口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药(阴道内、或子宫内给药，例如作为粉剂、软膏剂或滴剂)。一种特别优选的施用方式是是局部施用，更佳地为阴道内或子宫内局部施用。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(C)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。用于局部给药的本发明化合物的剂型包括粉剂、软膏剂、散剂、或喷射剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。使用药物组合物时，是将安全有效量的AEBSF蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约l微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、使用对象的健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。避孕器具本发明还提供了一种调节生育的器具，所述器具为含有4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐的避孕器具。在本发明的避孕器具中，包括用于在阴道或子宫内释放4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐的释放部件。在另一优选例中，所述的避孕器具是阴道环、或宫内节育器。应理解，所述的释放部件可以是单独的、也可以是组合的。例如，释放部件可以是一个单独的释放元件或与其他部件组合在一起的组合式释放元件，或者是粘合于或整合于其他部件的释放层。一种优选方式是在常规的阴道环、或宫内节育器上添加一个释放层(例如缓释层)，该释放层可以在阴道内或宫内在一段时间内释放4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐，从而抑制胚胎着床。通常，一个避孕器具中的释放元件宜含有5-5000毫克，更佳地10-2500毫克，最佳地20-1000毫克的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。本发明的主要优点在于，(a)4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐对胚胎着床有明显的抑制作用；(b)通过阴道内或子宫内局部给药4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐，具有很高的安全性好。(c)对胚胎着床的抑制作用是可逆的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例lAEBSF对胚胎着床的抑制作用(一)实验动物的饲养和交配-将8~10周龄的成年雄性ICR小鼠(体重35~40克)和雌性ICR小鼠(体重2530克)按2:1比例合笼饲养，次日早晨通过检查雌小鼠阴道栓以判断是否交配，以见栓当日作为孕D1天，并将同一批检测到得的孕D1天小鼠随机进行分组。(二)注射溶液的配制使用的化合物是AEBSF的盐酸盐，其结构式如下1、AEBSF高剂量组200pg/nL(用生理盐水配制)，2、AEBSF中剂量组20叫/VL(用生理盐水配制)，3、AEBSF低剂量组2lag/pL(用生理盐水配制)。(三)注射时间和方法于孕D3天上午8:0010:00，从小鼠两侧子宫角上端靠近卵巢的部位，用微量注射器将预先配制并在35。C下预热的注射溶液注入子宫腔内，每个子宫角注入15pL溶液。同只小鼠的两个子宫角内注入相同的溶液，不同组小鼠按设定注射不同的注射溶液。于孕D8天(肉眼可见胚胎)上午9:00处死小鼠，将完整的子宫组织和卵巢剥离，对每側子宫角和卵巢的胚胎数和黄体数进行记数。与对照组相比，抑制率为32%，低、中、高剂量组的抑制率分别为16%、53%、87%;有明显的剂量效应。(四)结果:表lAEBSF对胚胎着床的抑制作用组<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>AEBSF抗生育作用的可逆性考虑到避孕药物的抗生育作用必须是可逆的，在本实施例中通过动物实验对AEBSF的抗着床效应的可逆性进行了观察分析。方法如下将同一批次雌性成年小鼠分为两组，于第一次妊娠期的孕第3天分别用生理盐水和200pg/VL浓度的AEBSF处理，观察其妊娠结局；放置-个月后，再次交配，不予以任何处理，观察其妊娠结局。结果如表2所示。结果表明，200pg/nL浓度的AEBSF具有明显的抗生育作用，而且该作用可逆(表2)表2.AEBSF抗生育作用的可逆性研F究结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3含4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的药物组合物在本实施例中，制备一阴道给药的凝胶剂。方法如下:将10千克聚氧乙烯聚氧丙烯聚合物卡波姆941(Poloxamer941)和2千克非离子型表面活性剂(伯洛沙姆Poloxamer188(即F68)，购自上海昌为医药辅料技术有限公司)置于搅拌器中，加入60L0.6M的醋酸缓冲液，在2325。C搅匀，搅拌速度100300rpm，使其完全溶解，过程约34小吋，加入100克4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐，搅拌溶解，在加入0.5L聚二甲基硅氯烷(购自上海阳嘉经贸发展有限公司)，搅拌12小时，静置过夜，离心15min,除去气泡，从而制得含4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的凝胶剂。该凝胶剂可用于阴道给药。实施例4含4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的避孕器具在常规的阴道环内侧或者在阴道环内外侧施涂一层实施例3制备的凝胶剂，干燥后，该凝胶剂形成一含有4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的释放层，从而制得含4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐的避孕器具。在胚胎着床前期，通过阴道环、宫内节育器等子宫局部给药系统，在子宫内释放一定剂量的AEBSF，可抑制胚胎的着床，从而达到避孕节育的目的。参考文献1.SalamonsenLA.Roleofproteasesinimplantation.RevReprod1999,4(1):11-222.SalamonsenLA,NieGY.Proteinaseattheendometrial-trophoblastinterface:theirroleinimplantation.RevEndocrMetabDisord，2002，3(2):133-1433.BarrettAJ"，RawlingsND.Familiesandclansofserinep印tidases.ArchBiocheraBiophys.1995'318(2):247-2504.RawlingsND，BarrettAJ.Evolutionaryfamiliesofp印tidases.BiochemJ.1993,290(1):205-2185.RawlingsND，BarrettAJ.Familiesofserinepeptidases.MethodsEnzymol1994;244:19-616.KataokaH，ItohH，KoonoM.Emergingmultifunctionalaspectsofcellularserineproteinaseinhibitorsint咖orprogressionandtissueregeneration.PatholInt.2002Feb;52(2):89-102.7.TeesaluT,BlasiF，TalaricoD.Expressionandfuncticmoftheurokinasetypeplasminogenactivatorduringmousehemochorialplacentaldevelopment.DevDyn1998，213(1):27-388.Monzon-BordonabaF，WangCL,FeinbergRF.Fibronectinaseactivityinculturedhumantrophoblastsismediatedbyurokinase-typeplasminogenactivator.AmJObstetGynecol1997,176(1):58-659.0'SullivanCM,R肌courtSL,LiuSY，RancourtDE.Anovelmurinetryptaseinvolvedinblastocysthatchingandoutgrowth.Reproduction.2001，122(1):61-71.10.0'SullivanCM,LiuSY，RancourtSL,RancourtDE.Regulationofthestrypsin-relatedproteinaseISP2byprogesteroneinendometrialglandepitheliumduringimplantationinmice.Reproduction.2001,122(2):235-44.11.0'SullivanCM,LiuSY，Karpinka瓜RancourtDE.Embryonichatchingenzymestrypsin/ISPlisexpressedwithISP2inendometrialglandsduringimplantation.MolReprodDev.2002，62(3):328-34.12.H腦gZP，YuH,YangZM，ShenWX,WangJ，ShenQX.Uterineexpressionofimplantationserineproteinase2duringtheimplantationperiodandinvivoinhibitoryeffectofitsantibodyonembryoimplantationinmice.Reproduction,FertilityandDevelopment.2004,16:379-384.在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种化合物的用途，所述的化合物是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物被用于制备调节生育的组合物或器具。2.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述化合物是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物是下式所示的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐或者，所述活性衍生物是具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟的衍生物。4.如权利要求1-3中任一所述的用途，其特征在于，所述的组合物是药物组合物。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为抑制胚胎着床的组合物。6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物组合物是避孕药。7.如权利要求1-3中任一所述的用途，其特征在于，所述的器具是避孕器具，包括阴道环、或宫内节育器。8.—种调节生育的器具，所述器具是用于女性的避孕器具，其特征在于，所述的避孕器具还包括用于在阴道或子宫内释放4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐的释放部件。9.一种非治疗目的的避孕方法，其特征在于，给需要避孕的雌性哺乳动物施用4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物或其药学上可接受的盐。10.—种化合物的用途，所述的化合物是4-(2-氨乙基)苯磺酰氟或其活性衍生物及其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，所述化合物被用作抑制胚胎着床的可逆性抑制剂。全文摘要本发明提供了一种可逆的胚胎着床抑制剂，即4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(AEBSF)及其活性衍生物或其药学上可接受的盐。本发明还公开了AEBSF及其活性衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制胚胎着床的组合物中的用途。文档编号A61K31/135GK101259119SQ200710037928公开日2008年9月10日申请日期2007年3月8日优先权日2007年3月8日发明者孙兆贵,施惠娟,健王,申庆祥申请人:上海市计划生育科学研究所