一株猪流行性腹泻病毒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株及其应用。本发明弱毒株的微生物保藏号是：CGMCC?No.7806。本发明PEDV弱毒株安全性好，对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪均安全。该毒株对3日龄仔猪的主动保护率达100%，被动保护率达94.7%以上，表明本发明对于猪流行性腹泻具有良好的免疫保护效果。
【专利说明】一株猪流行性腹泻病毒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一株流行性腹泻病毒及其应用。
【背景技术】 [0002]猪流行性腹湾(porcine epidemic diarrhoea, PED)是引起猪腹湾的一种重要急性、接触性病毒性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。该病最早于上世纪70年代发生在英国和比利时，1973年先后在我国上海、辽宁、吉林等地分离到PEDV。PEDV可在猪群中持续存在，各种年龄猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤以哺乳仔猪严重，病死率达100%。目前，还没有特效药物抵抗猪流行性腹泻病毒，由于该病发病急，流行快，猪群一旦感染，就会给养殖户带来巨大的经济损失。
[0003]目前，免疫接种是防制该病的重要手段，国内外有使用疫苗的报道，但是效果不尽人意。尤其近几年，原来的疫苗对猪腹泻病的保护效果越发有限，临床上不断出现腹泻病例，在有的地区，猪流行性腹泻抗原阳性率可高达70%多，这表明研制出一种能够有效防制猪流行性腹泻的疫苗迫在眉睫。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明提供一株猪流行性腹泻病毒及其应用。该弱毒株遗传稳定、安全性好，用其制备的疫苗对于猪流行性腹泻具有良好的保护效力。
[0005]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的:
从浙江某猪场送检猪流行性腹泻抗原阳性的病料中分离到PEDV。将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代100代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在Vero细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为484bp。从第105代开始0RF3基因突然出现49个核苷酸的缺失，第105代、125代、145代保持稳定缺失49个核苷酸。
[0006]致弱性试验结果表明，从第105代开始，PEDV对仔猪失去致病性；将PEDV 125代种毒在猪体连传5代，毒力依然很稳定，没有任何返强现象。
[0007]经鉴定，分离到的病毒株为猪流行性腹泻病毒新病毒株，将105~145代致弱毒株种毒命名为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，并于2013年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为=CGMCC N0.7806。
[0008]本发明还提供含有猪流行性腹泻病毒ZJ08株的活疫苗。
[0009]在本发明一个实施方案中，所述的活疫苗中，猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株的含量为≥ IO5.0 TCID50/ml。
[0010]本发明还提供所述毒株在制备治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。
[0011]本发明弱毒株的安全性好，安全试验结果表明，该毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪均安全。[0012]本发明对3日龄仔猪的主动保护率达100%，被动保护率达94.7%以上，而对照组的发病率达100%，表明本发明对于猪流行性腹泻具有良好的免疫保护效果，该效果已高于国内PEDV弱毒疫苗株CV777的免疫效果。
[0013]本发明弱毒株还可应用于制备成单苗或联苗等。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1 PEDV (ZJ08 株)CPE 图片(400 X )。
[0015]图2PEDV (ZJ08 株)分离毒 S 基因 PCR 检测结果。图中，M:DNA Marker DL2000 ；1:样品；2:阴性对照。
[0016]图3 PEDV (ZJ08株)分离毒M基因PCR检测结果。图中，1:样品；2:阴性对照；M: DNA Marker DL2000。
[0017]图4 PEDV (ZJ08株)分离毒M基因系统进化分析结果。
[0018]图5不同代次PEDV (ZJ08株)0RF3序列比对。
[0019]图6 PEDV(ZJ08株)分离毒0RF3基因PCR扩结果。图中，1:样品；2:阴性对照；M: DNA Marker DL2000。
[0020]图7 PEDV (ZJ08株)猪体传代前与猪体连传五代后0RF3序列比对。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022]实施例1猪流行性腹泻病毒的分离鉴定
一、猪流行性腹泻病毒的分离
浙江某猪场送检腹泻猪小肠，取其内容物，用RT-PCR方法进行检测，结果为猪流行性腹泻抗原阳性。
[0023]取送检小肠适量，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例(重量:体积)加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22 μ m滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20 μ g/ml的胰酶，37°C处理1.5小时。
[0024]按常规方法接种长满单层的Vero细胞(接种前用pH7.4的PBS洗三次)，按照10%的比例接种病毒，37°C吸附1小时，补足细胞维持液(含lOPg/ml的胰酶)，37°C温箱培养。如此操作盲传至第10代，观察是否产生CPE。同时设置空白细胞作为对照。
[0025]盲传传至第6代时细胞出现轻微的CPE变化，传至第24代时则出现明显、稳定的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈葡萄串样，细胞出现损伤和脱落。(图1)。
[0026]二、将第24代病毒进行RT-PCR检测
根据S基因设计检测引物对:正向引物为5’ -GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3’ ；反向引物为5，-CGCACTCGGATTACTCACAGC -3，，95°C预变性 5min，95°C 45s ,50°C lmin、72°C 2min 进行32个循环后，72°C 5min延伸。PEDV扩增片段为484bp。结果见图2。
[0027]根据GenBank中PEDV的基因序列设计扩增M基因序列的引物:
PEDV-M-F: GTCTTACATGCGAATTGACC
PEDV-M-R: GGCATAGAGAGATAATGGCA
扩增的M基因片段的大小为:808 bp，结果见图3。将扩增的M基因RT-PCR产物送英骏公司进行测序，对测序结果进行序列分析(序列见SEQ ID N0.5)。结果表明，PEDV (ZJ08株)与中国早期分离野毒株JS-2004-2构成了一个独立分枝；与经典参考株如英国CV777株、比利时Brl/87株、韩国KPD-9F株和日本JMe2株等相比，不在一个进化分支上，已经发生了明显的变异。表明当前国内新出现的PEDV流行株已经发生了明显的变异。结果见图4。
[0028]三、病毒含量测定
将第24代毒用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10—7四个稀释度，每个稀释度分别接种长满VeiO细胞单层的96孔细胞板6孔，100 μ l/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37°C 5% CO2培养箱培养72~120小时，观察细胞病变，细胞颗粒增多，圆缩，细胞破损，脱落判为感染。同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法，计算TCID5Q。经测定，病毒含量为104 5TCID5Q/ml。
[0029]四、动物实验
取TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产的3~5日龄仔猪5头，每头口服2ml第24代病毒，观察7日，统计接种猪的发病情况，对试验猪进行剖检，观察病理变化。刮取发病猪肠粘膜和内容物，提取RNA，按实施例1第二步提到的检测S基因设计的引物，进行RT-PCR检测，并将PCR产物进行序列测定。结果仔猪3/5发病，发病猪表现为腹泻，个别猪出现呕吐，剖检观察发现胃和小肠出现典型的病理变化。从发病猪的肠粘膜及内容物中可扩增出484bp的片段，经序列分析为PEDV S基因。
[0030]经实验室分离鉴定，已成功的从浙江某猪场腹泻猪小肠内容物中分离到猪流行性
腹泻病毒。
[0031]实施例2猪流行性腹泻病毒致弱
一、猪流行性腹泻病毒的致弱培育
将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代100代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在Vero细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为484bp。
[0032]PEDV 0RF3基因序列在第30代、50代、70代、90代处于比较稳定的状态。有个别碱基的变化，但没有对氨基酸造成影响；而第105代开始0RF3基因突然出现49个核苷酸的缺失，第105代、125代、145代保持稳定缺失49个核苷酸(序列见SEQ ID N0.6)。结果如图
5。扩增0RF3序列的引物为:
0RF3-F: TCCTAGACTTCAACCTTACG
0RF3-R: GGTGACAAGTGAAGCACAGA
扩增的0RF3的片段的大小为:833 bp (图6)。
[0033]将第30代、50代、70代、90代、105代、115代、125代、135代及145代病毒分别用DMEM培养液作10倍系列稀释，各代次取适当稀释度，每个稀释度分别接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，100μ I/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37°C 5% C02培养箱培养72~120小时，观察细胞病变，同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法，计算TCID500结果115~145代毒价较高，均达到106 0TCID50/ml以上，详见表1。
[0034]表1 PEDV不同代次病毒含量测定结果
【权利要求】
1.一株猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株，其保藏号为CGMCC N0.7806。
2.含有权利要求1所述毒株的猪流行性腹泻病毒活疫苗。
3.如权利要求2所述的活疫苗，其特征在于，猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株的含量为≥ 105.° TCID50/ml。
4.权利要求1所述毒株在制备治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK103725651SQ201310722106
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】侯艳红, 王贵华, 赵亚荣, 于萍萍, 刘明明, 卢会英, 满坤, 陈翠云 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心, 北京科牧丰生物制药有限公司, 福州大北农生物技术有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司