痰热清在制备抑制细菌分裂的产品中的新用途
【专利摘要】本发明公开了痰热清在制备抑制细菌分裂的产品中的一种新用途。本发明提供了痰热清在制备抑制细菌分裂的产品中的应用。本发明还保护痰热清在制备抑制细菌自溶的产品中的应用。本发明还保护痰热清在制备通过抑制细菌自溶而抑制所述细菌分裂的产品中的应用。本发明发现了痰热清具有抑制细菌自溶、抑制细菌分裂的作用，即痰热清是通过抑制细菌自溶而抑制所述细菌分裂，并且本发明证明了细菌分裂可以作为抗细菌药物的新靶点。本发明对于抗细菌以及抗细菌药物的研发具有重大价值。
【专利说明】痰热清在制备抑制细菌分裂的产品中的新用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及痰热清在制备抑制细菌分裂的产品中的一种新用途。
【背景技术】
[0002]细菌耐药性问题日益严重，越来越多的致病菌对现有抗生素产生了耐药性，开发新靶点的抗生素迫在眉睫。细胞分裂是细菌繁殖的基本过程，可以作为一个具有潜力的药物作用全新靶点。 [0003]痰热清注射液是由上海凯宝药业有限公司生产、具有独家知识产权的国家中药二类新药，由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘等科学组方，严格按照中药指纹图谱生产而成，有清热解毒、化痰、解痉、抑茵、抗病毒、解热、免疫调节等作用。临床主要可用于肺炎、支气管炎、肝炎、病毒性脑炎、传染性单核细胞增多症等多种痰病的治疗。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供痰热清在制备抑制细菌分裂的产品中的一种新用途。
[0005]本发明提供了痰热清在制备抑制细菌分裂的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC9 Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0006]本发明还保护痰热清在制备抑制细菌自溶的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATOT Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0007]本发明还保护痰热清在制备通过抑制细菌自溶而抑制所述细菌分裂的产品中的应用。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC11 Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0008]本发明还保护一种抑制细菌分裂的产品，其活性成分为痰热清。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCCs Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0009]本发明还保护一种抑制细菌自溶的产品，其活性成分为痰热清。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC16Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0010]本发明还保护一种通过抑制细菌自溶而抑制所述细菌分裂的产品，其活性成分为痰热清。所述细菌可为金黄色葡萄球菌，具体可为ATCC151 Number为25923的金黄色葡萄球菌。所述痰热清可为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。所述痰热清注射液具体可为上海凯宝药业股份有限公司生产的痰热清注射液。
[0011]本发明发现了痰热清具有抑制细菌自溶、抑制细菌分裂的作用，即痰热清是通过抑制细菌自溶而抑制所述细菌分裂，并且本发明证明了细菌分裂可以作为抗细菌药物的新靶点。本发明对于抗细菌以及抗细菌药物的研发具有重大价值。本发明对于公共健康事业具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】[0012]图1为实施例1的结果。
[0013]图2为实施例2的结果。
[0014]图3为实施例3的结果。
【具体实施方式】
[0015]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。扫描电子显微镜:HITACHI，S3400N。透射电子镜显微镜:HITACHI，H-7650。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus): ATCCT Number:为 25923。
[0016]LB培养基:取胰蛋白胨IOg(英国OXOID公司)、酵母提取物5g(英国OXOID公司)、NaCllOg (北京市庆盛达化工技术有限公司)，溶于去离子水并用去离子水定容至1L。基础培养液为含0.25g/100mL葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)的LB培养基。
[0017]痰热清注射液(上海凯宝药业股份有限公司):为由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘五味中药提取物，国药准字Z20030054 ;使用时，将痰热清注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，痰热清浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0018]青霉素钠注射液，又称注射用青霉素钠:华北制药股份有限公司，批号X1108105 ；使用时，将青霉素钠注射液冷冻干燥得到干粉；实施例中将干粉溶于基础培养液，青霉素钠浓度以每毫升培养液中含有的干粉微克数计。
[0019]实施例1、通过扫描电镜观察痰热清对细菌分裂的影响
[0020]取6孔板，每个孔内加入一个洗净消毒的玻璃片(0.5X0.5cm)，本实施例中对玻璃片进行的操作都是在六孔板的各孔中进行的，依次进行如下步骤:
[0021]1、将玻璃片浸入OD6tltol=0.05金黄色葡萄球菌菌液，37°C静置24h (在玻璃片的上表面生成成熟的细菌生物膜)。
[0022]2、将玻璃片分成3组，每组设置5个重复处理，分别进行如下处理:
[0023]第一组(对照组):浸入基础培养液，37°C静置24h ；
[0024]第二组(青霉素钠组):浸入含20 μ g/ml青霉素钠的基础培养液，37°C静置24h ；
[0025]第三组(痰热清组):浸入含2063 μ g/ml痰热清的基础培养液，37°C静置24h。
[0026]4、前固定:将玻璃片浸入4%戊二醛溶液，4°C固定l_2h，然后用PBS缓冲液漂洗1-3 次(5min/次)。[0027]5、后固定:将玻璃片浸入1%锇酸溶液，4°C固定l_2h，然后用PBS缓冲液漂洗1_3次(5min/ 次)。
[0028]6、脱水:取玻璃片，依次用30%乙醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗涤I次(15-20min/次)，然后用乙醇洗涤2次(15_20min/次)。
[0029]7、叔丁醇置换:将玻璃片浸入叔丁醇，_20°C静置30min。
[0030]8、冷冻干燥:取玻璃片，用真空冷冻干燥仪冷冻干燥3_4h。
[0031]9、喷金:取玻璃片，用导电胶粘在样品台上，喷金后用扫描电镜观察并拍照。
[0032]步骤2至步骤9中，均保持细菌生物膜向上。
[0033]照片见图1 (右图为左图方框内部分的放大图)。对照组的细菌生物膜中，细菌饱满、大小均匀、表面平滑，细菌分裂完好，细菌相互聚结、疏密有秩。青霉素钠组的细菌生物膜中，细菌形状各异、大小不一，与对照组相比细菌表面结构较稀疏、基质表层粗糙、但依然分裂完好。与对照组相比，痰热清组的细菌生物膜中，细菌表面较为平滑、大小不均，很多细菌不能完成正常的分裂过程，出现两、三个甚至四个子细胞团(如图中箭头所示)。各组中，5个重复处理的结果一致。结果表明，痰热清能够阻止细菌的分裂。
[0034]实施例2、通过透射电镜观察痰热清对细菌分裂的影响
[0035]1、分组处理如下(每组设置5个重复处理):
[0036]第一组(对照 组):取离心管，加入10毫升基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌并使其初始浓度为7X 107CFU/mL，37°C静置培养24h。
[0037]第二组(青霉素钠组):取离心管，加入10毫升含20 μ g/ml青霉素钠的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌并使其初始浓度为7X 10TCFU/mL，37°C静置培养24h。
[0038]第三组(痰热清组):取离心管，加入10毫升含2063 μ g/ml痰热清的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌并使其初始浓度为7X 10TCFU/mL，37°C静置培养24h。
[0039]2、完成步骤I后，3000rpm离心IOmin,弃上清。
[0040]3、前固定:完成步骤2后，加入4%戊二醛溶液并4°C固定l_2h，然后用PBS缓冲液漂洗1-3次(5min/次)。
[0041]4、后固定:完成步骤3后，加入1%锇酸溶液并4°C固定l_2h，然后用PBS缓冲液漂洗 1-3 次(5min/次)。
[0042]5、脱水:完成步骤4后，依次用30%乙醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗涤I次(15-20min/次)，然后用乙醇洗涤2次(15_20min/次)。
[0043]6、浸透
[0044]完成步骤5后，按如下步骤进行浸透:
[0045]①丙酮:包埋剂=2:1 (体积比)，室温、2h ；
[0046]②丙酮:包埋剂=1:1 (体积比)，室温、2h ；
[0047]③包埋剂，室温、2h。
[0048]7、包埋
[0049]取步骤6得到的组织块，包埋在多孔橡胶包埋模板中每孔顶端，置烤箱(370C 12h — 45°C 12h — 60°C 24h)，形成包埋块。
[0050]8、取步骤7得到的包埋块，用超薄切片机切片。
[0051]9、取步骤8得到的切片，先用醋酸铀室温染色20min，然后去离子水漂洗4次(每次Is),然后用柠檬酸铅室温染色20min，然后去离子水漂洗4次(每次Is)，晾干后用透射电镜观察并拍照。
[0052]照片见图2。对照组中，细菌形态完整，处于分裂期，细胞壁层次分明，外表面平整，细胞质与细胞壁密度差较大，分界清晰，细菌内二分裂处细胞壁界限分明，细菌与细菌之间有颗粒物质分布。青霉素钠组中，细菌处于分裂期，细胞壁表面平整，与对照组相比细胞壁层次较不清晰且局部界限不清，有颗粒物质分布于细胞壁上及细菌之间。痰热清组中，细菌处于分裂期，形态完整，旧细胞壁表面较为光滑，表面无颗粒物，细胞壁和细胞质的电子密度大致相同且明显小于对照组，细胞质电子密度较为均一，新生细胞壁不成形、层次不清晰，两个子细胞之间没有明显的界限。各组中，5个重复处理的结果一致。结果表明，痰热清能够阻止细菌的分裂。
[0053]实施例3、自溶曲线的测定
[0054]本实施例中，用triton x_100诱导细菌自溶，通过测定OD值，检测了痰热清对细菌数量的影响。
[0055]1、分组处理如下(每组设置5个重复处理):
[0056]第一组(对照组):取离心管，加入10毫升基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌并使其初始浓度为7X 107CFU/mL，37°C静置培养24h。
[0057]第二组(青霉素钠组):取离心管，加入10毫升含20 μ g/ml青霉素钠的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌并使其初始浓度为7X 10TCFU/mL，37°C静置培养24h。
[0058]第三组(痰热清组):取离心管，加入10毫升含2063 μ g/ml痰热清的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌并使其初始浓度为7X 10TCFU/mL，37°C静置培养24h。
[0059]第四组(痰热清组):取离心管，加入10毫升含4125 μ g/ml痰热清的基础培养液，然后接种金黄色葡萄球菌并使其初始浓度为7X 10TCFU/mL，37°C静置培养24h。
[0060]2、完成步骤I后，3000rpm离心IOmin,弃上清,每个重复处理得到的沉淀用5毫升含0.05% (体积比)triton χ-100的PBS缓冲液重悬。
[0061]3、取步骤2得到的菌液，吸取200 μ I到微孔板中，采用酶标仪测595nm的初始吸光度(初始OD值)，每小时测定595nm的OD值，以时间为横坐标、以相对OD值(每个时间点的OD值与初始OD值的比)为纵坐标做自溶曲线。
[0062]自溶曲线见图3。青霉素钠组、两个痰热清组的相对OD值均大于对照组，即自溶率均小于对照组。各 组中，5个重复处理的结果一致。结果表明，痰热清能抑制细菌自溶。
[0063]综合实施例1、实施例2和实施例3的结果，可以得出如下结论:痰热清抑制了细菌自溶素的分泌或阻止了自溶素和细胞壁的结合，从而导致细菌的自溶率下降，细菌无法进行正常的二分裂，出现两、三个甚至四个子细胞团；因此可以推断，痰热清是蛋白抑制类药物。
【权利要求】
1.痰热清在制备抑制细菌分裂的产品中的应用。
2.痰热清在制备抑制细菌自溶的产品中的应用。
3.痰热清在制备通过抑制细菌自溶而抑制所述细菌分裂的产品中的应用。
4.如权利要求1至3中任一所述的应用，其特征在于:所述细菌为金黄色葡萄球菌。
5.如权利要求1至5中任一所述的应用，其特征在于:所述痰热清为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。
6.一种抑制 菌分裂的产品，其活性成分为痰热清。
7.一种抑制细菌自溶的产品，其活性成分为痰热清。
8.—种通过抑制细菌自溶而抑制所述细菌分裂的产品，其活性成分为痰热清。
9.如权利要求6至8中任一所述的产品，其特征在于:所述细菌为金黄色葡萄球菌。
10.如权利要求6至9中任一所述的产品，其特征在于:所述痰热清为痰热清注射液或痰热清注射液的冻干品。
【文档编号】A61K35/32GK103690611SQ201410005141
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】王毅, 刘冲, 刘绍勇, 刘宜善, 王国明, 王艺竹, 于友华, 李连达 申请人:上海凯宝药业股份有限公司