Pcbp1基因制备放疗增敏试剂盒的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了PCBP1基因在制备放疗增敏试剂盒中的应用，具体涉及PCBP1基因在制备包括重离子射线在内的电离辐射作为肿瘤放疗增敏试剂盒中的应用。其中所述PCBP1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其构建在真核表达质粒中。PCBP1协同重离子束，调控肿瘤转移和侵袭相关的CD44v6基因表达，抑制了HeLa肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭；显著下调细胞周期调节蛋白Cyclin D1，促使细胞发生G0／G1期阻滞，增加HeLa细胞中对辐射敏感性；此外，上调促凋亡蛋白Tap73、线粒体凋亡通路MCL表达，下调抑制凋亡DelNp73蛋白，诱发更多HeLa细胞发生凋亡。
【专利说明】PCBP1基因制备放疗增敏试剂盒的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多聚胞啼陡结合蛋白I (poly C binding proteinl，PCBPl，或 heterogeneous nuclear ribonuclear protein El, hnRNP El 或 a-complex proteinl, a CPI)基因的新用途，具体涉及PCBPl基因在制备放疗增敏药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是我国常见的女性生殖道恶性肿瘤之一。宫颈癌发病率已成为大中城市中 死亡率增长最快的癌症，且发病年龄表现为逐渐年轻化，已成为严重危害我国妇女健康的 疾病之一。
[0003] 放射治疗是肿瘤治疗的常规手段之一，70%?80%的恶性肿瘤患者在治疗过程中 需接受放疗。同化疗一样，放疗还是重要的姑息治疗手段。依据循证医学的资料严格估算， 52%的肿瘤患者在其肿瘤治疗过程中会接受至少一次放射治疗。常规外照射对各类实体肿 瘤的局控率是不相同的，同一病理类型肿瘤放疗的有效率也不一致。临床上将其主要归因 于肿瘤细胞的内在放射抵抗性、放射后肿瘤细胞加速再增殖、总体肿瘤负荷和氧合状态等 因素。如何提高放射治疗疗效已成为放疗领域的一大热点话题，药物增敏已有多年的历史， 但其疗效和稳定性方面一直不是很理想。由于分子生物技术的迅猛发展，肿瘤基因放射治 疗是近年来发展起来的具有良好前景的抗肿瘤治疗新方法。该方法是将放射治疗与基因治 疗联合起来应用于肿瘤治疗。在对肿瘤实施局部放疗的同时诱导治疗基因的表达，射线和 基因对肿瘤形成联合杀伤。基因放射治疗具有提商肿瘤治疗基因的局部表达量、降低有效 照射剂量、减轻受照部位正常组织的放射损伤等诸多优点。而该方法面临的难题之一是如 何筛选到辐射敏感相关的靶基因。将放射治疗与基因治疗相结合，事半功倍，已成为肿瘤治 疗研究的重要方向之一。因此开展新的基因的研究是当前恶性肿瘤基因-放射治疗的研究 重点之一。
[0004] 近年来，多聚胞啼陡结合蛋白I (poly C binding proteinl, PCBP1,或 heterogeneous nuclear ribonuclear protein El, hnRNP El 或 a-complex proteinl, a CPI)的研究进展为我们这项发明的提出提供了契机。PCBPl功能多样，在多个水平广泛 参与了基因的表达调控，调控的靶基因涉及细胞增殖、物质代谢、细胞分化、造血调控、胚胎 发育和病毒复制等多方面，它的异常会引起这些靶基因的表达水平的改变，从而导致如肿 瘤等。目前，国内外科研工作者对RNA结合蛋白，尤其是对PCBPl的研究取得了一些初步的 进展。通过酵母双杂交系统发现了 8个PCBPl相互作用蛋白，提示这些PCBPl可能参与细 胞周期、白噬、免疫应答等过程[酵母双杂交系统3筛选人源核不均一核糖核蛋白El的功 能伙伴.中国组织工程研究与临床康复.2010年第14期]。PCBPl或其保守序列未发生变 化的变异多肽或其活性片段或其活性片段衍生物在制备预防或治疗帕金森病药物中具有 重要的应用[参见，申请号为201210555379. 3的发明专利申请，其发明名称为"多聚胞嘧啶 结合蛋白1在制备预防及治疗帕金森病药物中的应用"]。在慢性粒细胞白血病急性发作 期BCR / ABL融合基因的表达增高，导致PCBPl蛋白水平升高。而PCBPl能够抑制该基因 的表达，最终抑制细胞分化，导致肿瘤的发生。PCBPl可参与STAT3介导的对NF-κ B活化通 路的抑制作用，有利于细胞处于抗凋亡状态[核不均一核糖核蛋白（hnRNPs)与肿瘤关系的 研究进展.广州医学院学报.2007年第35期]。在人肝癌细胞中，PCBPl调控细胞表面粘 连分子CD44基因的选择性剪接[PCBP1调控人肝癌细胞CD44选择性剪接参与的肿瘤细胞 的侵袭.FEBSLett. 2012年第586期，第10卷，页码：431-438]。Cancer Cell上发表文章， PCBPl调控肿瘤相关基因的表达[PCBP1抑制和肿瘤侵袭相关的PRL-3蛋白磷酸化.Cancer Cell. 2010年第18期，第1卷，页码：52-62]。这些研究的发现给大家提供了治疗肿瘤疾病 的新线索。通过调节这些能够与肿瘤相关基因的mRNA3或者5非编码区相结合的PCBPl蛋 白，抑止或者上调肿瘤相关基因的表达水平而达到阻碍肿瘤疾病的发生与发展的目的。那 么PCBPl是否是一个新的肿瘤增敏的靶标？这方面的研究目前国内外尚无报道。本研究率 先展开直接将PCBPl在人的宫颈癌细胞HeLa中过表达，研究该基因在辐射增敏中的作用， 从而可望提高宫颈癌病人的生存率。因此，本发明提供了 PCBPl基因制备放疗增敏药物的 潜在应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供PCBPl (poly C binding proteinl，多聚胞啼陡结合蛋白1)基 因的新功能，即PCBPl基因在制备放疗增敏试剂盒中的应用。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是=PCBPl基因在制备放疗增敏试剂盒 中的应用。具体地，脂质体介导的真核表达质粒PCDNA3-PCBP1在制备放疗增敏试剂盒中的 应用。
[0007] 本发明同时要求保护一种放疗增敏试剂盒，所述放疗增敏试剂盒的活性成分包括 携带PCBPl基因的真核表达质粒。在一个优选的实施方案中，所述携带PCBPl基因的真核 表达质粒为脂质体介导的真核表达质粒PCDNA3-PCBP1。
[0008] 本发明还提供了一种应用脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-PCBP 1增强肿 瘤细胞对放疗敏感性的方法。所述方法包括：放疗前将脂质体介导的真核表达质粒 pcDNA3-PCBPl导入肿瘤细胞，使PCBPl基因在肿瘤细胞中表达，然后进行放疗。
[0009] 上述技术方案中，真核表达质粒pcDNA3_PCBPl的制备方法为现有技术，可以参见 文献：张林、侯艳红、王孟薇、吴本俨、李楠.中华肿瘤防治杂志.2008 (16)。
[0010] 其中所述的PCBPl基因来源于人，基因文库中的标号为NM006196。其基因序列为：
[0011] atggatgccggtgtgactgaaagtggactaaatgtgactctcaccattcggcttcttatgcacggaaag gaagtaggaagcatcattgggaagaaaggggagtcggttaagaggatccgcgaggagagtggcgcgcggatcaacat ctcggaggggaattgtccggagagaatcatcactctgaccggccccaccaatgccatctttaaggctttcgctatga teatcgacaagctggaggaagatatcaacagctccatgaccaacagtaccgcggccagcaggcccccggtcaccctg aggctggtggtgccggccacccagtgcggctccctgattgggaaaggcgggtgtaagatcaaagagatccgcgagag tacgggggcgcaggtccaggtggcgggggatatgctgcccaactccaccgagcgggccatcaccatcgctggcgtgc cgcagtctgtcaccgagtgtgtcaagcagatttgcctggtcatgctggagacgctctcccagtctccgcaagggaga gtcatgaccattccgtaccagcccatgccggccagctccccagtcatctgcgcgggcggccaagatc ggtgcagc gac gctgc gggctacccccatgccacccatgacctggagggaccacctctagatgcctactcgattcaaggaca acacaccatttctccgctcgatctggccaagctgaaccaggtggcaagacaacagtctcactttgccatgatgcac ggcgggaccggattcgccggaattgactccagctctccagaggtgaaaggctattgggcaagtttggatgcatcta ctcaaaccacccatgaactcaccattccaaataacttaattggctgcagtaatcgggcgccaaggcgccaacatta atgagatccgccagatgtccggggcccagatcaaaattgccaacccagtggaaggctcctctggtaggcaggtta ctatcactggctctgctgccagtattagtctggcccagtatctaatcaatgccaggctttcctctgagaagggca tggggtgcagctag(SEQ ID Ν0·1)〇
[0012] 上述技术方案中，所述肿瘤细胞包括但不限于宫颈癌细胞。
[0013] 本发明还提供一种增强肿瘤细胞对放疗的敏感性的方法。所述方法包括：在放疗 之前，向所述肿瘤细胞转染包含PCBPl的真核表达载体；待PCBPl在转染的肿瘤细胞中表达 后，对所述肿瘤细胞施加放疗。
[0014] 在一个优选的实施方案中，本发明所述的"放疗"是指重离子辐照疗法。并且，所 述肿瘤细胞包括但不限于宫颈癌细胞。
[0015] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0016] (I)PCBPl协同重离子束，调控肿瘤转移和侵袭相关的-⑶44ν6基因表达，抑制了 HeLa肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。
[0017] (2)PCBPl协同重离子束，显著下调细胞周期调节蛋白Cyclin D1，促使细胞发生 GO / Gl期阻滞，增加 HeLa细胞中对辐射的敏感性。
[0018] (3)PCBPl协同重离子束，上调促凋亡蛋白Tap73、线粒体凋亡通路MCL的表达，下 调抑制凋亡DelNp73的蛋白，诱发了更多的HeLa细胞发生凋亡。
[0019] 本发明所述PCDNA3-PCBP1转染联合放疗对人宫颈癌HeLa细胞诱导凋亡的作用高 于单一放疗组，呈现明显放疗增敏协同效应。因此，本发明从肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、周 期阻滞和凋亡的多个层面上提供了 PCBPl基因制备放疗增敏试剂盒的潜在应用价值。
[0020] 综上所述，本发明提供下述技术方案：
[0021] I. PCBPl基因在制备放疗增敏试剂盒中的应用。
[0022] 2.根据第1项所述的应用，其中所述PCBPl基因构建在真核表达质粒中，其中所述 PCBPl基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
[0023] 3.根据第2项所述的应用，其中所述PCBPl基因构建在pcDNA3质粒中。
[0024] 4.根据第1项所述的应用，其中所述试剂盒用于治疗宫颈癌。
[0025] 5.根据第1项所述的应用，其中所述放疗为重离子辐照治疗。
[0026] 6. -种放疗增敏试剂盒，其中所述放疗增敏试剂盒的活性成分包括携带PCBPl基 因的真核表达质粒。
[0027] 7.根据第6项所述的放疗增敏试剂盒，其中所述PCBPl基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
[0028] 8.根据第6项所述的放疗增敏试剂盒，其中所述携带PCBPl基因的真核表达质粒 为脂质体介导的真核表达质粒PCDNA3-PCBP1。
[0029] 9.根据第6项所述的放疗增敏试剂盒，所述试剂盒用于治疗宫颈癌。
[0030] 10.根据第6项所述的放疗增敏试剂盒，其中所述放疗是重离子辐照疗法。
[0031] 11. 一种增强肿瘤细胞对放疗的敏感性的方法，所述方法包括：在放疗之前，向所 述肿瘤细胞转染包含PCBPl的真核表达载体；待PCBPl在转染的肿瘤细胞中表达后，对所述 肿瘤细胞施加放疗。
[0032] 12.根据第11项所述的方法，其中所述包含PCBPl的真核表达载体为包含PCBPl 的pcDNA3载体，其中所述PCBPl墓因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
[0033] 13.根据第11项所述的方法，其中所述放疗为重离子辐照疗法。
[0034] 14.根据第11项所述的方法，其中所述肿瘤细胞为宫颈癌细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0036] 图1是PCBPl细胞模型的建立。PCBPl在人宫颈癌HeLa细胞中调控抑制凋亡蛋白 DeltaNp73的表达。NC表示无重离子辐照，且有空载体导入；siPCBPl表示PCBPl基因表达 受到干扰，降低表达；overEpl表示PCBPl超表达；overEp2表示PCBPl超表达。与对照组比 较：*，Ρ〈0· 05。**，Ρ〈0· 01 ;***，Ρ〈0· 001。
[0037] 图2是PCBPl协同重离子辐射抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖。A图显示通过结晶 紫染色方法观察PCBPl协同重离子辐射对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。B图显示通过罗 氏细胞增殖试剂盒分析PCBPl协同重离子辐射对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。A图中， NC表示无重离子辐照，且有空载体导入；NC+IR表示4Gy重离子照射剂量，且有空载体导入； over Exp表示有PCBPl基因的超表达；IR+over Exp表示4Gy的重离子照射，且有PCBPl基 因的超表达。B图中以吸光值为纵坐标，处理为横坐标。NC表示无重离子辐照；NC+Control 表示无重离子福照，且有空载体导入；4Gy表示重离子照射剂量；4Gy+over Exp表示4Gy的 重离子照射，且有PCBPl基因的超表达。
[0038] 图3是PCBPl协同重离子辐射降低了人宫颈癌HeLa细胞侵袭、周期阻滞以及凋亡 基因的表达。NC表示无重离子辐照，且有空载体导入；siPCBPl表示PCBPl基因表达受到干 扰，降低表达；overEpl表示PCBPl超表达；overEp2表示PCBPl超表达。与对照组比较：*， Ρ〈0·05〇 #，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001〇
[0039] 图4是PCBPl协同重离子抑制肿瘤细胞的迁移。NC表示无重离子辐照，且有空载 体导入；over Exp表示有PCBPl基因的超表达。
[0040] 图5是PCBPl协同重离子辐射降低了人宫颈癌HeLa细胞侵袭力。NC表示无重离 子福照，且有空载体导入；IR表示4Gy的重离子照射,且有空载体的导入；IR+over Exp表示 4Gy的重离子照射，且有PCBPl基因的超表达。
[0041] 图6是激光共聚焦显微镜观察PCBPl协同重离子辐射促进凋亡蛋白Tap73的表达 (IOOx)。蓝色荧光为DAPI复染的细胞核；红色荧光为PCBPl的荧光染色；绿色荧光为Tap73 的免疫染色。
[0042] 图7是激光共聚焦显微镜观察PCBPl协同重离子辐射降低了抑制凋亡蛋白 DeltaNp73的表达。蓝色荧光为DAPI复染的细胞核；红色荧光为DeltaNp73的荧光染色。
【具体实施方式】
[0043] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发 明并不限于这些具体的实施例。
[0044] 实施例I. PCBPl协同重离子射线对人宫颈癌HeLa肿瘤的辐射增效作用
[0045] 1.实验材料
[0046] 人宫颈癌HeLa细胞最初购白中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心（目 录号：TCHul87)，之后在本实验室中培养和保存；D-MEM培养基干粉、小牛血清、胰酶粉末购 白Gibco公司；碘化丙啶（PI)购白江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜（DMSO)、琼脂 糖和Tween-20购白上海高科技生物工程有限公司；抗PCBP1、Tap73、和DeltaNp73等抗体 购白美国SantaCruzs生物技术公司。Lipofectamine?2000转染试剂购白美国Invitrogen 公司。分别用重离子辐照细胞实验材料。用中国科学院兰州近代物理研究所的高能12C重 离子束作为射线来源。
[0047] 2.实验方法
[0048] 2. 1细胞培养和转染
[0049] 按照常规重组质粒构建方法构建重组真核表达质粒pcDNA3_PCBPl，构建方法可 参见文献：张林、侯艳红、王孟薇、吴本俨、李楠.中华肿瘤防治杂志.2008 (16)。插入片段 PCBPl的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0050] HeLa细胞培养于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100万U / L青霉素和链霉素的 D-MEM培养基。细胞置于5% C02,37°C培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细 胞用于实验。
[0051] 转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数，以合适的密度接种6孔板，置于CO2培养箱 中培养过夜，使转染当日细胞融合度为70%?90%。在铺板和转染期间避免使用抗生素。 转染溶液配制：按照质粒：Lipofectamine2000用量比为Iyg /孔：2. 5μ1/孔。2yg/ 孔 DNA 加入 100 μ 1 / 孔 D-MEM 混匀，室温静置 5min，备用；5 μ 1 / 孔 Lipofectamine2000 加入100 μ 1 /孔基础D-MEM混匀，室温静置5min，备用；将稀释的DNA同稀释的脂质体试 剂混合，在室温保温30min后，加入800 μ 1 /孔基础D-MEM备用。用PBS及无抗生素的基 础DMEM洗涤细胞，每孔加入Iml转染混合液，5% C02, 37°C培养5h。5h后，弃去含转染试剂 的培养液，加入新鲜的完全培养基，继续培养后，72h内完成实验即为瞬时转染。转染后通过 荧光定量PCR进行转染鉴定。
[0052] 2. 2辐照处理
[0053] 12C6+离子束照射在兰州重离子加速器研究装置（HIRFL，中国科学院近代物理研究 所）的深层肿瘤治疗终端上进行。坪区照射，能量为250MeV，剂量吸收率为IGy / min，照 射剂量为4Gy(空气电离室检测剂量）。对数生长期的细胞用于辐照。转染实验24h后进行 重离子辐照，辐照48h收样。
[0054] 2. 3RNA提取、逆转录及荧光定量PCR
[0055] 首先按RNA抽提操作手册（大连宝生物工程公司）的方法提取对照和处理样品 RNA，提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm 吸光度值而计算RNA的纯度与浓度。然后通过宝生物的反转录试剂盒合成cDNA。PCR反应 体系如下：SYBR Pre mix ExTaqTMlOy 1，Forward Primer (10 μ mol / 1)0. 4 μ 1，Reverse ?1^1^1(1(^111〇1/1)0.4 4 1，。0嫩模板2.(^1，蒸馏水加至2(^1。采用祀〇-1^(1105实 时定量PCR仪进行应，反应条件为：95°C变性30s，60°C退火30s，95°C延伸5s，共40个循环。
[0056] 表1荧光定量PCR引物
[0057]
【权利要求】
1. PCBP1基因在制备放疗增敏试剂盒中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其中所述PCBP1基因构建在真核表达质粒中，其中所述 PCBP1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
3. 根据权利要求2所述的应用，其中所述PCBP1基因构建在pcDNA3质粒中。
4. 根据权利要求1所述的应用，其中所述试剂盒用于治疗宫颈癌。
5. 根据权利要求1所述的应用，其中所述放疗为重离子辐照疗法。
6. -种放疗增敏试剂盒，其中所述放疗增敏试剂盒的活性成分包括携带PCBP1基因的 真核表达质粒。
7. 根据权利要求6所述的放疗增敏试剂盒，其中所述PCBP1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
8. 根据权利要求6所述的放疗增敏试剂盒，其中所述携带PCBP1基因的真核表达质粒 为脂质体介导的真核表达质粒PCDNA3-PCBP1。
9. 根据权利要求6所述的放疗增敏试剂盒，所述试剂盒用于治疗宫颈癌。
10. 根据权利要求6所述的放疗增敏试剂盒，其中所述放疗为重离子辐照疗法。
【文档编号】A61K48/00GK104338150SQ201410005151
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】狄翠霞, 张红, 周鑫, 孙超, 司婧, 甘露, 刘圆圆 申请人:中国科学院近代物理研究所