一种组织工程界面修饰材料、其修饰方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种组织工程界面修饰材料以及使用该修饰材料修饰组织工程界面的方法。该修饰材料包含PEG、细菌或细菌感染响应性肽和细胞粘附肽，其细胞粘附肽的端头使其具有较强的促进细胞粘附和生长能力，当面对细菌感染时，其细菌或细菌感染响应性肽对细菌产生响应，从而抑制细菌在界面上形成生物膜。该组织工程界面修饰材料具有智能的双响应性，比现有的界面修饰材料更具多功能和智能化，具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种组织工程界面修饰材料、其修饰方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学材料领域，尤其涉及一种双响应的组织工程界面修饰材料、其修饰方法及应用。
【背景技术】
[0002] 界面修饰材料在组织工程方面有着相当广泛的用途，在生物环境中，细胞和材料的相互作用实际上是细胞表面受体与细胞外生物材料所能提供的相应配体之间的相互间分子识别，从而产生特异性相互作用。当材料植入体内，细胞膜表面的受体积极寻找与之接触的材料表面所能提供的信号，以区别所接触的材料为自体或异体。只有生物相容性适宜，植入材料才能被生物体认同。表面修饰旨在抑制非特异性相互作用，引入特异性相互作用位点，使细胞在类似体内细胞外基质(ECM)中发挥其功能。
[0003]为了创造一个良好的人工ECM环境，达到细胞正常生长的需求，表面修饰后的生物材料应达到如下要求:(1)良好的生物相容性；(2)良好的抗凝血性；(3)适宜的表面亲水-疏水平衡；(4)较强的细胞特异性识别能力；(5)较强的消除非特异性识别能力。而植入物感染是组织工程材料在手术植入时最严重的并发症，由于细菌易在界面形成生物膜，使得感染具有极强的耐药性，形成难以根治的持续性慢性感染，只能将植入物去除，导致手术失败。因此，作为界面修饰材料，不仅需要具有以上的生物相容性还需要具有良好的抗感染抗生物膜形成能力。
[0004]将多肽类用于组织工程界面修饰，可使界面具有非常好的特异性识别性能(如受体识别)以及生物相容性和可降解性能。与细胞表面受体真正起反应的是细胞外基质上3~20个氨基酸的多肽链。现有技术中，可在界面材料表面直接固定多肽，制成受体专门性材料，以促进受体介导的细胞对界面材料表面的黏附，从而来提高其生物相容性。目前主要使用的细胞粘附肽是RGD，RGD可被固有黏附蛋白受体特异性组合，在生物材料表面自发形成分子层，为与受体介导的细胞反应提供了位点，进而促进细胞黏附、伸展。同时，RGD还与球蛋白等生理活性物质结合，也有很好的促细胞黏附能力。但是，若在界面材料表面直接固定多肽，难以达到抑菌效果，从而在手术植入时存在极大风险。
[0005]组织工程界面所需要的另一个重要性能是防污，也即防止细菌感染，防污性能主要是抑制细菌在界面形成生物膜，以求达到理想的细菌“零粘附”。目前较常用的材料有具有抗菌性能的无机类材料修饰(如Ag、Ti02、Zn02、Mg0、Cu0等金属氧化物),具有抗菌性能的有机涂层(如氯己定、氯二甲酚)以及抗细菌粘附的高分子膜(如甲基丙酸烯、聚乙二醇)。但是，这些材料要想达到抑菌效果，需要其为“裸露”状态。因此，当将上述RGD肽连接于抗菌材料表面时，无法实现抗菌效果；而单纯在界面上修饰上述抗菌材料时，又无法达到促进细胞粘附、提高其生物相容性的效果。因此，迫切需要开发一种既能实现良好的生物相容性，又兼具防污性能的组织工程界面修饰材料。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提出一种生物相容性与防污性能兼具的组织工程界面修饰材料，该组织工程界面修饰材料具有较强的促进细胞粘附和生长能力，对细菌的响应性以及响应后抗细菌生物膜形成的能力。
[0007]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]第一方面，本发明提供了一种组织工程界面修饰材料，该组织工程界面修饰材料依次包含PEG、细菌或细菌感染响应性肽和细胞粘附肽。
[0009]上述组织工程界面修饰材料中，作为优选，所述PEG的重复序列为4~10个，优选为6~8个,更优选为6个。
[0010]在具体的实施方案中，所述PEG的重复序列为4个、5个、6个、7个、8个、9个、10
个。
[0011]优选地,所述细菌或细菌感染响应性肽为凝血酶响应性肽、基质金属蛋白酶响应性肽、脂肪酶响应肽或者磷酸酶响应肽中的任意一种或几种的组合；
[0012]所述细菌或细菌感染响应性肽为对细菌或细菌感染产生响应比如产生响应性酶切的肽，比如所述凝血酶响应性肽对凝血酶产生响应进而发生酶切，所述基质金属蛋白酶响应性肽对基质金属蛋白酶产生响应进而发生酶切，因此，所述凝血酶响应性肽包含凝血酶的酶切位点，而基质金属蛋白酶响应性肽包含基质金属蛋白酶的酶切位点。
[0013]进一步优选地，所述细菌或细菌感染响应性肽为如SEQ ID N0.1~14任一项所示序列或几种序列的组合:
[0014]SEQ ID N0.1:G (D) FPRGA ；
[0015]SEQ ID N0.2 =GAGRP(D) FG ；
[0016]SEQ ID N0.3 =GAGPR(D) FG ；
[0017]SEQ ID N0.4:G (D) FPRGG ；
[0018]SEQ ID N0.5:G (D) FPRGF ；
[0019]SEQ ID N0.6:G (D) FPRGP ；
[0020]SEQ ID N0.7:G (D) FPGRG ；
[0021]SEQ ID N0.8:GPLGV ；
[0022]SEQ ID N0.9:GPLGQ ；
[0023]SEQ ID N0.10:GPLGNLG ；
[0024]SEQ ID N0.11:GPLGLAG ；
[0025]SEQ ID N0.12:GPLGL ；
[0026]SEQ ID N0.13:GPIGNVG ；
[0027]SEQ ID N0.14 =GPAGQ0
[0028]上述序列中，SEQ ID N0.1~7为凝血酶响应肽，SEQ ID N0.8~14为基质金属蛋白酶响应肽；上述SEQ ID N0.1~7中，(D)代表着其后的氨基酸为D-氨基酸，例如SEQID N0.1:G (D) FPRGA中，第二个氨基酸F为D-氨基酸；因D-氨基酸在序列表中无法显示而特别作此说明，关于SEQ ID N0.1~7的序列以上述解释为准。
[0029]优选地，所述细胞粘附肽为RGD序列或GRGDS序列、RGDS序列或CRGD环肽中的任意一种或几种的组合；
[0030]进一步优选地，所述细胞粘附肽包括RGD肽；[0031]更进一步优选地，所述细胞粘附肽为RGD肽。
[0032]第二方面，本发明提供了一种组织工程界面的修饰方法，该修饰方法为:将第一方面所述的组织工程界面修饰材料偶联到组织工程界面上。
[0033]优选地，通过氨丙基三乙氧基硅烷(APS)将所述组织工程界面修饰材料偶联到组织工程界面上。
[0034]在优选的实施方案中，上述修饰方法包括如下步骤:
[0035](1)通过乙氧基-羟基缩合反应，将氨丙基三乙氧基硅烷偶联到表面带羟基的组织工程界面；
[0036](2)通过羧基-氨基缩合反应,将重复序列为4~10个、优选为6~8个、更优选为6个的双羧基PEG偶联到步骤(1)所得组织工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷；
[0037](3)通过羧基-氨基缩合反应，将包含所述细菌或细菌感染响应性肽和细胞粘附肽的多肽偶联到步骤(2)所得组织工程界面上的双羧基PEG的另一个羧基上。
[0038]优选地，步骤(1)中，在偶联氨丙基三乙氧基硅烷前，先将组织工程界面进行活化；
[0039]优选地，步骤(1)所述缩合反应的溶剂为乙醇或甲醇，所述缩合反应时间为8~15小时、优选为12小时。
[0040]优选地，步骤(2 )中，将所述双羧基PEG与相同数目重复序列的羧基甲基PEG两者与组织工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷进行羧基-氨基缩合反应；
[0041]优选地，所述双羧基PEG与羧基甲基PEG两者的投料量与组织工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为(0.8~1):1，优选为0.8:1 ;
[0042]进一步优选地，所述双羧基PEG与羧基甲基PEG的投料摩尔比为(0.3~I):1、优选为(0.4~0.5): 1、更优选为(0.4~0.45):1 ；
[0043]在具体实施方案中，所述双羧基PEG与羧基甲基PEG的比例为0.3:1、0.4: 1、
0.45:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1。
[0044]进一步优选地，在步骤(2)所述羧基-氨基缩合反应前，先将双羧基PEG与羧基甲基PEG进行活化。
[0045]优选地，步骤(3)中，所述多肽的投料量为I~5mg/cm2组织工程界面；
[0046]在具体的实施方案中，步骤(3)中所述多肽的投料量为lmg/cm2、2mg/cm2、3mg/cm2、4mg/cm2、5mg/cm2组织工程界面。
[0047]优选地，当所述多肽的长度为6~15个氨基酸时，所述多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为(5~30):100、优选为(10~20):100、更优选为15:100 ；
[0048]优选地，当所述多肽的长度为8~10个氨基酸时，所述多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为(15~25): 100、优选为20:100。
[0049]在具体实施方案中，当所述多肽的长度为15、12、9、8、7或6个氨基酸时，对应地，所述多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为5:100,10:100,15:100,20:100,25:100或30:100。
[0050]本发明的一个具体的实施方案，包括如下步骤:
[0051](I)采用等离子清洗仪将表面带羟基的组织工程界面进行活化，将活化的组织工程界面浸溃在氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中室温反应12小时；[0052](2)用EDC/NHS活化具有6个重复序列的双羧基PEG和羧基甲基PEG，然后将二者与界面上APS的氨基进行缩合反应；
[0053]所述双羧基PEG与羧基甲基PEG的投料摩尔比为0.4:1 ;
[0054]所述双羧基PEG与羧基甲基PEG两者的投料量与组织工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为0.8:1 ；
[0055](3)将包含细菌或细菌感染响应性肽和细胞粘附肽的多肽以2mg/cm2组织工程界面的投料量，通过羧基-氨基缩合反应偶联在PEG的游离端，形成界面修饰；
[0056]所述多肽的长度为8~10个氨基酸，所述多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为(15 ~25):100ο
[0057]第三方面，本发明提供了第一方面所述的组织工程界面修饰材料所修饰的组织工程界面；或者，通过第二方面所述的组织工程界面的修饰方法所修饰的组织工程界面。
[0058]第四方面，本发明提供了如第三方面所述的组织工程界面在制备用于促进愈合的体内植入物中的应用。
[0059]本发明所提供的组织工程界面修饰材料，其细胞粘附肽的端头使其具有较强的促进细胞粘附和生长能力，从而可以促进正常组织细胞在组织工程界面的粘附生长；当细菌感染时，其细菌或细菌感染响应性肽对细菌感染做出响应，从而抑制细菌生物膜形成，减少细菌粘附。本发明的 组织工程界面修饰材料的工作原理如附图1所示，该组织工程界面修饰材料具有智能的双响应性，比现有的界面修饰材料更具多功能和智能化，具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]图1是本发明的组织工程界面修饰材料的工作原理示意图。
[0061]图2显示了实施例1、2中的界面修饰路线和对相应酶的响应。
[0062]图3是实施例1中所述界面细胞粘附伸展的扫面电镜照片。
[0063]图4是实施例1中所述界面抗细菌生物膜形成的荧光共聚焦照片；其中，阴性对照是指对修饰界面无响应的细菌生物膜形成，阳性对照是指对修饰界面产生响应的细菌生物膜形成。
[0064]图5是实施例1中所述界面修饰过的体内植入材料的体内组织粘合照片。
[0065]图6是实施例1中所述界面修饰过的体内植入材料在体内的组织切片。
[0066]图7是实施例2中所述界面细胞粘附伸展的扫面电镜照片。
[0067]图8是实施例2中所述界面抗细菌生物膜形成的荧光共聚焦照片；其中，阴性对照是指对修饰界面无响应的细菌生物膜形成，阳性对照是指对修饰界面产生响应的细菌生物膜形成。
【具体实施方式】
[0068]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0069]实施例1、实施例2的组织工程界面修饰路线以及对相应酶的响应如图2所示。
[0070]实施例1本发明的组织工程界面修饰及其细胞粘附、抗菌性能检测[0071]使用包含凝血酶响应肽的组织工程界面修饰材料进行修饰，其具体步骤为:
[0072](I)多肽(G ⑶ FPRGA+RGD)的合成
[0073]采用Fmoc固相合成法合成多肽:合成选用0.35mM修饰密度的Wang树脂，其中第一个氨基酸(天冬氨酸)C端被固定于树脂上，N端被Fmoc保护。用20% (v/v)的六氢吡啶的DMF溶液脱去Fmoc保护，然后用茚三酮测试法测试去保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液活化，并加入到脱去保护的树脂中反应2小时。重复上述步骤完成所有序列氨基酸的反应后，用含有2.5%水和2.5%三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护。将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥。最后选用反相液相制备色谱，将多肽纯化。纯化过程的条件是:流动相是含有0.1%三氟乙酸的乙腈和含有0.1%三氟乙酸的双蒸水；参数是梯度洗脱从5%乙腈/95%水到60%乙腈/40%水，流速为10ml/min，处理时间为30min ;检测器为紫外检测器，检测波段为220nm。 [0074](2)双响应界面的修饰方法
[0075]采用等离子清洗仪将界面进行清洗活化，将界面浸入氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中室温过夜反应，将界面转入EDC/NHS活化后的6个重复单元的双羧基PEG和羧基甲基PEG的水溶液中(双羧基PEG与羧基甲基PEG的摩尔比为0.4:1 )，从而将双羧基PEG与羧甲基PEG修饰于界面上；随后将步骤(1)合成的响应性多肽(长度为9个氨基酸)以2mg/cm2界面的投料量偶联在PEG端头，形成界面修饰；所述响应性多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为15:100。
[0076]由上述步骤所得修饰界面的细胞粘附及抗菌性能检测如下，以下检测中，均以未经界面修饰的空白界面为阴性对照:
[0077](I)细胞粘附生长实验
[0078]细胞粘附实验是将3T3成纤维细胞以4.5 X IO5细胞/cm2的密度，置于含有上述界面修饰盖玻片的6孔板中，并加入2mL无血清DMEM培养基，细胞在37°C，5%C02培养lh，随后用PBS洗涤没有粘附的细胞，并对界面粘附的细胞用显微镜观察计数。
[0079]观察结果显示:本发明的修饰界面粘附的细胞数量与投入数量相当；而空白对照界面的细胞粘附数量远远小于修饰界面，单位面积数量低约一个数量级。该结果表明:本发明的修饰界面可以很好的粘附细胞。
[0080]细胞生长实验是将3T3成纤维细胞以6 X IO4细胞/cm2的密度，置于含有上述界面修饰盖玻片的6孔板中，并加入2mL含血清DMEM培养基，细胞在37°C，5%C02培养6天，随后用PBS洗涤界面，并对界面生长的细胞用显微镜观察计数。
[0081]结果显示:本发明的修饰界面可以很好的促进细胞的贴壁生长，生长曲线与Corning培养皿中的生长曲线基本一致，而空白对照组细胞基本停滞生长，大部分已经死亡。
[0082]细胞在上述界面上粘附伸展的扫面电镜照片如图3所示。由图3可见，3T3成纤维细胞可在本发明修饰界面上粘附伸展，而在未经本发明修饰的空白界面上则不能。
[0083](2)抗细菌生物膜形成实验
[0084]将细菌涂布在肉汤培养基琼脂培养皿中，37°C培养24小时，将单菌落转移至含有2.5%葡萄糖的TSB液体培养基中，37°C震荡(200rpm)培养过夜，然后将105CFU/mL细菌置于2.5mL含有2.5%葡萄糖的TSB液体培养基中，并将上述细菌溶液加入含有上述界面修饰盖玻片的6孔板中，37°C静置培养20小时，用PBS清洗游离的细菌。随后将生物膜以及粘附的细菌用活/死细胞染色剂染色15min，用荧光共聚焦显微镜观察界面的生物膜以及细菌。其结果如图4所示，图4中显示了不同细菌种属对本发明修饰界面的响应情况，阴性对照是指对修饰界面无响应的细菌的生物膜形成情况，阳性对照是指对修饰界面产生响应的细菌的生物膜形成情况。
[0085]图4结果表明:本发明的组织工程界面修饰大大抑制了响应性细菌在界面的生物膜形成，减少了细菌粘附。
[0086]另外，经上述界面修饰的体内植入材料的体内组织粘合照片见图5，其在体内的组织切片见图6。
[0087]由图5、图6可见，与空白界面相对比，本发明的修饰界面可以很好的促进植入物与组织的粘附，加快伤口界面纤维化，降低机体炎性反应，促进伤口愈合。
[0088]实施例2本发明的组织工程界面修饰及其细胞粘附、抗菌性能检测
[0089]使用包含基质蛋白酶响应肽的组织工程界面修饰材料进行修饰，其具体步骤为:
[0090](I)多肽(GPLGM+RGD )的合成
[0091]采用Fmoc固相合成法合成多肽:合成选用0.35mM修饰密度的Wang树脂,其中第一个氨基酸(天冬氨酸)C端被固定于树脂上，N端被Fmoc保护。用20% (v/v)的六氢吡啶的DMF溶液脱去Fmoc保护，然后用茚三酮测试法测试去保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基吗啉和0.4M的苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的DMF溶液活化，并加入到脱去保护的`树脂中反应2小时。重复上述步骤完成所有序列氨基酸的反应后，用含有2.5%水和2.5%三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护。将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥。最后选用反相液相制备色谱，将多肽纯化。纯化过程的条件是:流动相是含有0.1%三氟乙酸的乙腈和含有0.1%三氟乙酸的双蒸水；参数是梯度洗脱从5%乙腈/95%水到60%乙腈/40%水，流速为10ml/min，处理时间为30min ;检测器为紫外检测器，检测波段为220nm。
[0092](2)双响应界面的修饰方法
[0093]采用等离子清洗仪将界面进行清洗活化，将界面浸入氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中室温过夜反应，将界面转入EDC/NHS活化后的6个重复单元的双羧基PEG和羧基甲基PEG的水溶液中(双羧基PEG与羧基甲基PEG的摩尔比为0.4:1 )，从而将双羧基PEG与羧甲基PEG修饰于界面上，随后将步骤(1)所得响应性多肽(长度为8个氨基酸)以2mg/cm2界面的投料量，通过羧基-氨基缩合反应偶联在PEG的游离端形成界面修饰；所述响应性多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为21:100。
[0094]由上述步骤所得修饰界面的细胞粘附及抗菌性能检测如下，以下检测中，均以未经界面修饰的空白界面为阴性对照:
[0095](I)细胞粘附生长实验
[0096]细胞粘附实验是将3T3成纤维细胞以4.5 X IO5细胞/cm2的密度，置于含有上述界面修饰盖玻片的6孔板中，并加入2mL无血清DMEM培养基，细胞在37°C，5%C02培养lh，随后用PBS洗涤没有粘附的细胞，并对界面粘附的细胞用显微镜观察计数。
[0097]观察结果显示:本发明的修饰界面可以很好的粘附细胞，粘附的细胞数量与投入数量相当，而空白对照界面的细胞粘附数量远远小于修饰界面，单位面积数量低约一个数量级。该结果表明:本发明的修饰界面可以很好的粘附细胞。
[0098]细胞生长实验是将3T3成纤维细胞以6 X IO4细胞/cm2的密度，置于含有上述界面修饰盖玻片的6孔板中，并加入2mL含血清DMEM培养基，细胞在37°C，5%C02培养6天，随后用PBS洗涤界面，并对界面生长的细胞用显微镜观察计数。
[0099]结果显示:本发明的修饰界面可以很好的促进细胞的贴壁生长，生长曲线与Corning培养皿中的生长曲线基本一致，而空白对照组细胞基本停滞生长，大部分已经死亡。
[0100]细胞在上述界面上粘附伸展的扫面电镜照片如图7所示；由图7可见，3T3成纤维细胞可在本发明修饰的界面上粘附伸展。
[0101](2)抗细菌生物膜形成实验
[0102]将细菌涂布在肉汤培养基琼脂培养皿中，37°C培养24小时，将单菌落转移至含有2.5%葡萄糖的TSB液体培养基中，37°C震荡(200rpm)培养过夜，然后将105CFU/mL细菌置于
2.5mL含有2.5%葡萄糖的TSB液体培养基中，并将上述细菌溶液加入含有上述界面修饰盖玻片的6孔板中，37°C静置培养20小时，用PBS清洗游离的细菌。随后将生物膜以及粘附的细菌用活/死细胞染色剂染色15min，用荧光共聚焦显微镜观察界面的生物膜以及细菌。其结果如图8所示，图8中显示了不同细菌种属对本发明修饰界面的响应情况，阴性对照是指对修饰界面无响应的细菌的生`物膜形成情况，阳性对照是指对修饰界面产生响应的细菌的生物膜形成情况。
[0103]图8结果表明:本发明的组织工程界面修饰大大抑制了响应性细菌在界面的生物膜形成，减少了细菌粘附。
[0104] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种组织工程界面修饰材料，其特征在于，依次包含PEG、细菌或细菌感染响应性肽和细胞粘附肽。
2.根据权利要求1所述的组织工程界面修饰材料，其特征在于，所述PEG的重复序列为4~10个,优选为6~8个,更优选为6个。 优选地，所述细菌或细菌感染响应性肽为凝血酶响应性肽、基质金属蛋白酶响应性肽、脂肪酶响应肽或者磷酸酶响应肽中的任意一种或几种的组合； 进一步优选地，所述细菌或细菌感染响应性肽为如SEQ ID N0.1~14任一项所示序列或几种序列的组合； 优选地，所述细胞粘附肽为RGD序列或GRGDS序列、RGDS序列或CRGD环肽中的任意一种或几种的组合； 进一步优选地，所述细胞粘附肽包括RGD肽； 更进一步优选地，所述细胞粘附肽为RGD肽。
3.—种组织工程界面的修饰方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的组织工程界面修饰材料偶联到组织工程界面上； 优选地，通过氨丙基三乙氧基硅烷将所述组织工程界面修饰材料偶联到组织工程界面上。
4.根据权利要求3所述的修饰方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)通过乙氧基-羟基缩合反应`，将氨丙基三乙氧基硅烷偶联到表面带羟基的组织工程界面； (2)通过羧基-氨基缩合反应，将重复序列为4~10个、优选为6~8个、更优选为6个的双羧基PEG偶联到步骤(1)所得组织工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷； (3)通过羧基-氨基缩合反应，将包含所述细菌或细菌感染响应性肽和细胞粘附肽的多肽偶联到步骤(2)所得组织工程界面上的双羧基PEG的另一个羧基上。
5.根据权利要求3或4所述的修饰方法，其特征在于，步骤(1)中，在偶联氨丙基三乙氧基硅烷，先将组织工程界面进行活化； 优选地，所述缩合反应的溶剂为乙醇或甲醇； 优选地，所述反应时间为8~15小时、优选为12小时。
6.根据权利要求3-5任一项所述的修饰方法，其特征在于，步骤(2)中，将所述双羧基PEG与相同数目重复序列的羧基甲基PEG两者与组织工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷进行羧基-氨基缩合反应； 优选地，所述双羧基PEG与羧基甲基PEG两者的投料量与组织工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为(0.8~I):1，优选为0.8:1 ; 优选地，所述双羧基PEG与羧基甲基PEG的投料摩尔比为(0.3~I):1、优选为(0.4~0.5): 1、更优选为(0.4 ~0.45):1 ； 优选地，在所述羧基-氨基缩合反应前，先将双羧基PEG与羧基甲基PEG进行活化。
7.根据权利要求3-6任一项所述的修饰方法，其特征在于，步骤(3)中，所述多肽的投料量为I~5mg/cm2组织工程界面； 优选地，所述多肽的长度为6~15个氨基酸，所述多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为(5~30):100、优选为(10~20): 100、更优选为15:100 ；优选地，所述多肽的长度为8~10个氨基酸，所述多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为(15~25): 100、优选为20:100。
8.根据权利要求3-7任一项所述的修饰方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)采用等离子清洗仪将表面带羟基的组织工程界面进行活化，将活化的组织工程界面浸溃在氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中室温反应12小时； (2)用EDC/NHS活化具有6个重复序列的双羧基PEG和羧基甲基PEG，然后将二者与界面上APS的氨基进行缩合反应； 所述双羧基PEG与羧基甲基PEG的投料摩尔比为0.4:1 ; 所述双羧基PEG与羧基甲基PEG两者的投料量与组织工程界面上的氨丙基三乙氧基硅烷的摩尔比为0.8:1 ; (3)将包含细菌或细菌感染响应性肽和细胞粘附肽的多肽以2mg/cm2组织工程界面的投料量，通过羧基-氨基缩合反应偶联在PEG的游离端，形成界面修饰； 所述多肽的长度为8~10个氨基酸，所述多肽与界面上的双羧基PEG的摩尔比为(15 ~25):100ο
9.由权利要求1或2所述的组织工程界面修饰材料所修饰的组织工程界面；或者，通过权利要求3-8任一项所述的组织工程界面的修饰方法所修饰的组织工程界面。
10.如权 利要求9所述的组织工程界面在制备用于促进愈合的体内植入物中的应用。
【文档编号】A61L27/54GK103845759SQ201410095314
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月14日 优先权日:2014年3月14日
【发明者】王浩, 李莉莉, 齐国斌 申请人:国家纳米科学中心