一种peg修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用，属于医药生物工程【技术领域】。本发明采用PEG修饰ADI，得到的ADI-PEG在体外和小鼠血浆中的稳定性得到明显提高。药代动力学/药效学研究表明：与修饰前的游离ADI相比，ADI-PEG在小鼠体内半衰期提高11倍以上；单次注射5UADI-PEG可降低并维持血浆中精氨酸浓度在极限水平5天以上，而未修饰的ADI仅能维持1天；对H22肝癌模型小鼠进行治疗，在15天的疗程后，ADI-PEG（15U）治疗组对癌细胞的抑制率达到95.02%，与使用5-氟尿嘧啶治疗的阳性对照组（抑制率98.34%）接近。本发明的PEG修饰酶ADI-PEG具有较高的体内半衰期和较低的免疫原性，是一种优良的治疗或抑制肿瘤的药物。
【专利说明】一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，包括对重组蛋白精氨酸脱亚胺酶(ADI)的PEG化修饰方法及其修饰产物的体内外活性研究，还包括PEG化修饰方法的优化，修饰酶的体内外稳定性和肿瘤治疗方面的研究应用，属于医药生物工程【技术领域】。 【背景技术】
[0002]精氨酸脱亚胺酶(argininedeiminase, EC 3.5.3.6,简称 ADI)是一种极具潜力的用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤的抗癌新药，包括目前尚缺乏有效药物的肝细胞瘤(hepatocellular carcinomas,简称HCCs)以及黑素瘤(melanomas)。正常细胞所需精氨酸可经体内的尿素循环由精氨琥拍酸合成酶(argininosuccinate synthetase, ASS)与精氨琥拍酸裂合酶(argininosuccinate lyase,ASL)共同作用催化瓜氨酸而生成。而精氨酸是生物体内合成绝大部分多肽及蛋白质的重要氨基酸。对于一些肿瘤细胞，因其缺少ASS而自身无法正常合成精氨酸，因此必须从外部环境中摄取精氨酸从而进行生长繁殖，这一类细胞被称之为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞，例如肝癌细胞和黑素瘤细胞。
[0003]肝细胞瘤是世界第五大人类常见癌症，全世界每年约有60万人死于肝细胞癌。在中国，肝癌死亡率位居肿瘤死因第2位。其高死亡率的原因在于HCC易转移、易复发、诊断不及时和治疗手段不彻底等。肝癌患者在确诊后没有经过治疗其生存期平均为1-4个月。通过手术治疗HCC效果不佳，且术后易复发，因此临床上迫切需要一种治疗肝癌的新方法。
[0004]ADI应用于癌症治疗最近二十年来为人们所广泛关注并接受。2002年，Ensor等发现在大肠杆菌中重组表达的支原体ADI对精氨酸营养缺陷型的23种人的黑素瘤以及16种人的肝细胞瘤在体外和体内都具有活性，通过对ADI进行聚乙二醇(PEG)化提高了 ADI在体内的半衰期。2004年，他们将AD1-PEG-20用于肝癌的临床实验，结果成功使患者血浆中的精氨酸的可检测浓度降为零。目前，美国凤凰公司开发的支原体来源的AD1-PEG-20制剂用于肝细胞癌和黑素瘤(药品名称分别为Ifepacid和Melanocid)的II期和III期临床试验正在全球多个中心进行。
[0005]本研究室通过筛选得到一株具有较高ADI活性的变形假单胞菌(Bplecoglossicida ) CGMCC N0.2039，对该ADI编码基因进行克隆和重组表达，并对重组ADI进行蛋白质工程改造以改善其酶活和酶学性质(包括价I和最适pH等)，获得了多个更适合于生理中性条件的ADI突变株。为进一步解决ADI蛋白在体内半衰期短的问题，本发明对ADI突变株进行PEG修饰，以获得在体内具有更高稳定性和持久半衰期的AD1-PEG酶。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供具有良好的抗肿瘤活性，延长半衰期的PEG修饰的精氨酸脱亚胺酶。主要针对精氨酸脱亚胺酶在体内半衰期短的问题，提供一种新的精氨酸脱亚胺酶修饰酶AD1-PEG。
[0007]本发明的技术方案:本发明所涉及的精氨酸脱亚胺酶为来源于变形假单胞菌0°.plecoglossicida ) CGMCC N0.2039，在中国专利 200710107822.X “一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用”中已公开。精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中进行重组表达。
[0008]一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，采用PEG修饰剂修饰大肠杆菌中重组表达的精氨酸脱亚胺酶ADI突变株，得到PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶AD1-PEG ;其中ADI突变株M314的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；ADI突变株M13的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；ADI突变株M13-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示；ADI突变株M13-2的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示；ADI突变株M13-3的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示；ADI的基因全长1，254bp，编码417个氨基酸，单个ADI亚基的分子量为46.5 kDa,重组精氨酸脱亚胺酶由2个或4个相同的ADI亚基组成。
[0009]所述AD1-PEG为ADI亚基与5_15个PEG分子的共价结合物；分别命名为AD1-SS-PEG20, AD1-SC-PEG20, AD1-SPA-PEG20 ;具有 30%_70% 的平均修饰率。
[0010]所述PEG修饰剂为mPEG-SS2Q kDa，SS为琥珀酰亚胺琥珀酸酯；mPEG-SC2(l kDa，SC为琥珀酰亚胺碳酸酯；mPEG-SPA2(l _，SPA为琥珀酰亚胺丙酸酯。
[0011]所述PEG修饰剂的平均分子量为20000 Da。
[0012]所述PEG修饰的精氨酸脱亚胺酶的制备方法，步骤为:
(1)重组ADI粗酶液的制备:取重组表达精氨酸脱亚胺酶的大肠杆菌发酵液离心后收集菌体，用10-500mmol/L、pH 6_8的磷酸钠缓冲液洗涤2次，按湿菌体重量:缓冲液重量比为1: 2-20加入缓冲液重悬，在冰浴条件下进行超声破碎15min，将破碎液离心，所得上清液即为重组ADI粗酶液；超声波破碎过程为400W，超声ls，停止3s ； (2)重组ADI的纯化:
a、HiTrap?DEAE FF阴离子交换层析:使用HiTrap? DEAE FF阴离子交换层析柱，平衡液为 I O-1 OOmmo I/L、pH 6.0-8.0 PBS 缓冲液，洗脱液为 10-100 mmol/L,pH 6.0_8.0 磷酸钠缓冲液，其中含NaCl 0.1-1.0 mol/L ；
洗脱采用线性梯度洗脱方法，NaCl初始浓度为0，终浓度0.1-1.0 mol/L ;确定目的蛋白峰，收集蛋白样品；
b、Superdex?200凝胶过滤层析:采用Superdex? 200凝胶预装柱进行纯化，使用I O-1 OOmmo I/L、pH 6.0-8.0 PBS 缓冲液，其中含 NaCl 0.05-0.5 mol/L ；
取步骤a所得蛋白样品上样500μL，洗脱1.0-3.0个柱体积，确定目的蛋白峰并收集，得到重组ADI纯酶液；
(3)PEG修饰反应:用10-50mmol/L PBS缓冲液调整步骤(2)所得重组ADI纯酶液浓度为0.1-1.0mg/mL、pH 6.0-10.0 ;按照摩尔比I: 30-120分别加入三种PEG修饰剂，即mPEG-SS20 mPEG-SC20 kDa，mPEG-SPA20 kDa，于室温下搅拌反应 1-4 h ;将反应液加入 IOOkDa的超滤管中，4000 r/min冷冻离心，每隔10 min加入10-100mmol/L PBS,pH 6.0_8.0进行滤洗，重复3-5次以除去游离PEG分子，即得产品PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶AD1-PEG。
[0013]所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的应用，所得到的AD1-SS-PEG2ci,AD1-SC-PEG20, AD1-SPA-PEg20,与未修饰的ADI相比，修饰酶体外酶活稳定性良好，在小鼠血衆中稳定性显著提高。
[0014]所述AD1-SPA-PEG2q在15 U的注射剂量下对H22肝癌表现出95%以上的抑制率。
[0015]本发明的有益效果:本发明对来源于变形假单胞菌0°.plecoglossicida、饱、在大肠杆菌中重组表达的ADI的多个优良突变株进行PEG修饰，可得到修饰度较均一的修饰产物AD1-PEG，反应产率接近100%。采用mPEG-SPA2Q kDa修饰获得的AD1-SPA-PEG2q具有较好的体外稳定性；在小鼠体内的ro/PK实验表明，ad1-spa-peg 20的血浆消除半衰期较adi提高了 11倍(单次静脉注射，5 U)。
[0016]本发明为获得优良的PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶提供了有效的制备方法，并对修饰酶AD1-PEG在小鼠体内的HVPK和抗肝癌活性进行了研究，结果表明本发明的AD1-PEG是一种优良的治疗或抑制肿瘤的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1 是PEG修饰重组ADI 反应产物 SDS-PAGE 图。M:蛋白 marker，I:AD1-SPA-PEG20,2 =AD1-SS-PEG20, 3:AD1-SC-PEG200
[0018]图2是单次静脉注射ADI和AD1-SPA-PEG2q (5 U)的药代动力学图。
[0019]图3是各实验组小鼠H22肝肿瘤大小图。
【具体实施方式】
[0020]实施例1 ADI重组蛋白的纯化
(1)重组ADI粗酶液的 制备:取重组表达精氨酸脱亚胺酶的大肠杆菌发酵液离心后收集菌体，用10-500mmol/L、pH 6_8的磷酸钠缓冲液洗涤2次，按湿菌体重量:缓冲液重量比为1: 2-20加入缓冲液重悬，在冰浴条件下进行超声破碎15min，将破碎液离心，所得上清液即为重组ADI粗酶液；超声波破碎过程为400W，超声ls，停止3s ；
(2)重组ADI的纯化:
溶液A:20 mmol/L、pH 7.0磷酸钠缓冲液；
溶液 B:20 mmol/L、pH 7.0 磷酸钠缓冲液，含 I mol/L NaCl ；
溶液 C:20 mmol/L、pH 7.0 磷酸钠缓冲液，含 0.15 mol/L NaCl。
[0021]a, HiTrap? DEAE FF阴离子交换层析:用溶液A平衡5个柱体积，上样完毕后用溶液A冲洗10个柱体积至基线。洗脱采用线性梯度洗脱方法，NaCl初始浓度为0，终浓度500 mmol/L。收集洗脱峰，并检测各峰的ADI酶活，确定目的蛋白峰。纯化过程流速均为
2.5 ml ,/mi η η
[0022]收集目的蛋白峰样品，使用10 kDa超滤管在4°C下离心浓缩10倍。
[0023]b>Superdex? 200凝胶过滤层析:使用溶液C平衡2个柱体积,取步骤a所得蛋白样品上样500 PL，使用溶液C洗脱1.5个柱体积，流速均为0.5 mL/min。收集各洗脱峰，跟踪测定各峰酶活，确定目的蛋白峰并收集。
[0024](3) ADI酶活测定方法:
在980μL精氨酸底物溶液中加入20 μ L ADI酶液，在37°C水浴锅中反应30 min，随后迅速进行10 min沸水浴以终止酶促反应。
[0025]取20 μ L反应液加入1980 μ L去离子水中，再添加3mL混酸溶液及500 μ L 二乙酰一肟-硫胺脲溶液，沸水浴显色反应10 min,结束后立即冷却。采用分光光度法测定反应液的OD53tl值，以空白对照样品标零。按照瓜氨酸标准曲线计算OD53tl对应的瓜氨酸含量，并计算酶活。[0026]酶活力单位定义:37 °C条件下，每分钟转化Iymol精氨酸盐酸盐生成瓜氨酸所需的酶量定义为I U。
[0027]
【权利要求】
1.一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于:采用PEG修饰剂修饰大肠杆菌中重组表达的精氨酸脱亚胺酶ADI突变株，得到PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶AD1-PEG ；其中ADI突变株M314的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；ADI突变株M13的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；ADI突变株M13-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示；ADI突变株M13-2的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示；ADI突变株M13-3的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示；ADI的基因全长1，254bp，编码417个氨基酸，单个ADI亚基的分子量为46.5 kDa，重组精氨酸脱亚胺酶由2个或4个相同的ADI亚基组成。
2.根据权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于:所述AD1-PEG为ADI亚基与5-15个PEG分子的共价结合物；分别命名为AD1-SS_PEG2(I，AD1-SC-PEG20,AD1-SPA-PEg20 ;具有30%-70%的平均修饰率。
3.根据权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于:所述PEG修饰剂为mPEG-SS2(l SS为琥珀酰亚胺琥珀酸酯；mPEG-SC2(l kDa，SC为琥珀酰亚胺碳酸酯；mPEG-SPA20 _，SPA为琥珀酰亚胺丙酸酯；所述PEG修饰剂的平均分子量为20000 Da。
4.权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的制备方法，其特征在于步骤为: (1)重组ADI粗酶液的制备:取重组表达精氨酸脱亚胺酶的大肠杆菌发酵液离心后收集菌体，用10-500mmol/L、pH 6_8的磷酸钠缓冲液洗涤2次，按湿菌体重量:缓冲液重量比为1: 2-20加入缓冲液重悬， 在冰浴条件下进行超声破碎15min，将破碎液离心，所得上清液即为重组ADI粗酶液； (2)重组ADI的纯化: a、HiTrap?DEAE FF阴离子交换层析:使用HiTrap? DEAE FF阴离子交换层析柱，平衡液为 I O-1 OOmmo I/L、pH 6.0-8.0 PBS 缓冲液，洗脱液为 10-100 mmol/L,pH 6.0_8.0 磷酸钠缓冲液，其中含NaCl 0.1-1.0 mol/L ； 洗脱采用线性梯度洗脱方法，NaCl初始浓度为0，终浓度0.1-1.0 mol/L ;确定目的蛋白峰，收集蛋白样品； b、Superdex?200凝胶过滤层析:采用Superdex? 200凝胶预装柱进行纯化，使用I O-1 OOmmo I/L、pH 6.0-8.0 PBS 缓冲液，其中含 NaCl 0.05-0.5 mol/L ； 取步骤a所得蛋白样品上样500μL，洗脱1.0-3.0个柱体积，确定目的蛋白峰并收集，得到重组ADI纯酶液； (3)PEG修饰反应:用10-50mmol/L PBS缓冲液调整步骤(2)所得重组ADI纯酶液浓度为0.1-1.0mg/mL、pH 6.0-10.0 ;按照摩尔比I: 30-120分别加入三种PEG修饰剂，即mPEG-SS20 mPEG-SC20 kDa，mPEG-SPA20 kDa，于室温下搅拌反应 1-4 h ;将反应液加入 IOOkDa的超滤管中，4000 r/min冷冻离心，每隔10 min加入10-100mmol/L PBS,pH 6.0_8.0进行滤洗，重复3-5次以除去游离PEG分子，即得产品PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶AD1-PEG。
5.权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的应用，其特征在于:所得到的AD1-SS-PEG20, AD1-SC-PEG20, AD1-SPA-PEG2ci，与未修饰的ADI相比，修饰酶体外酶活稳定性良好，在小鼠血浆中稳定性显著提高。
6.根据权利要求5所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的应用，其特征在于:所述AD1-SPA-PEg20在15 U的注射剂量下对H22肝癌表现出95%以上的抑制率。
【文档编号】A61P35/00GK103923898SQ201410154403
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】倪晔, 张龙, 刘梦晗, 司海明 申请人:江南大学