一种应用带pcl内核材料构建组织工程软骨的方法
【专利摘要】本发明涉及一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，步骤a，制作PLC内核；步骤b，制作带PCL内核PGA/PLA复合耳支架；步骤c，制作PGA/PLA复合耳支架；步骤d，软骨细胞培养；步骤e，耳廓支架构建软骨；步骤f，体外构建耳廓的裸鼠皮下回植，将软骨细胞-耳支架复合物体外培养1周后分别进行裸鼠皮下植入。本发明应用带PCL内核材料可以构建组织工程软骨，具有足够的强度对抗植入皮下所带来的张力从而维持原先复杂精确的形状。
【专利说明】—种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉生物组织领域，尤其涉及一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法。
【背景技术】
[0002]小耳症(microtia)是继唇腭裂之后发病率最高的体表先天畸形，传统治疗主要以自体肋软骨移植为主，对供区造成极大损伤。理论上讲，组织工程技术至少在以下三个方面明显优于传统治疗模式:(I)对病人损伤小，可取少量细胞扩增后构建大块软骨；(2)构建的软骨有功能，是真正意义上的结构与功能重建；(3)可精确塑形，更符合临床应用需求。
[0003]然而，现有技术中的体外构建的软骨因力学性能不足，植入动物体内后难以克服皮下张力而维持原有形态。虽然钛网支撑物辅助移植可解决裸鼠体内形态维持问题，但在大动物体内会引发异物反应干扰软骨再生。
[0004]鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，用以克服上述技术缺陷。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，具体过程为:步骤a，制作PLC内核；PCL内核是PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术制成的网格状多孔支架，将网格状的PCL裁剪成适合大小，置于耳廓模具中加压固定，加热加压，待加压过程中冷却至室温后，取出成耳廓型的PCL内核，修剪多余材料；
[0007]步骤b，制作带PCL内核PGA/PLA复合耳支架；
[0008]步骤bl，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，将PGA无纺棉均匀的铺在专用的长方形盒中，制作成长方形的小片，每片约150mg，共需2片；
[0009]步骤b2，将上述小片置于耳廓模具中并用无水乙醇浸饱，加压固定，待无水乙醇挥发后，耳廓形态初步稳定；
[0010]步骤b3，滴加0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具内继续加压塑形，每次滴加PLA溶液前先称重，待材料约为158-165mg时即不再滴加PLA溶液，最后得到两片耳廓形态PGA/PLA复合支架；
[0011 ] 步骤b4，将上述耳廓形态网格状PCL叠加于上述两片耳廓形态PGA支架间，置于耳廓模具中加压固定，加热加压冷却，使微融的PCL与上下两层PGA/PLA复合支架紧密粘合；
[0012]步骤b5，取出制备好的带内核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液后于模具中加压塑形，最终形成具有逼真耳廓形态的带内核支架；
[0013]步骤c，制作PGA/PLA复合耳支架；
[0014] 与上述步骤b相同，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，制作成长方形的小片，每片约300mg，滴加1% PLA，待材料约为330mg时即制备完成，修剪为耳廓形状备用；
[0015]步骤d，软骨细胞培养；
[0016]步骤dl，无菌条件下切取新西兰大白兔单侧耳廓软骨，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒温水浴振荡器消化30min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，沉淀细胞，除去胰蛋白酶；
[0017]步骤d2，加入0.15% II型胶原酶，以软骨细胞培养液配成相应浓度，0.22微米针式滤器过滤，立即使用，置于37°C恒温水浴振荡器内消化6~8h:
[0018]步骤d3，直至大部分软骨块被消化后，获得的消化液用100微米细胞滤网过滤，1500r/min，离心5min，沉淀的细胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基重悬， 所得细胞以台盼蓝染色计数，并检查软骨细胞活力，在倒置显微镜下血细胞计数器计数后调整细胞密度至IxlOVcm2的浓度接种在IOOmm培养皿上，在37°C，5% CO2,饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养扩增，待软骨细胞生长至70% -80%融合时进行传代；
[0019]步骤e，耳廓支架构建软骨；
[0020]将耳廓支架用75 %乙醇消毒后，PBS冲洗3次，软骨细胞培养液冲洗3次后将支架置于培养液中预培养；将第一代(PD兔耳软骨细胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10%FBS和1%三抗的DMEM培养液重悬至浓度100X 106/ml，等量均匀的接种在两组支架材料上；
[0021]步骤f，体外构建耳廓的裸鼠皮下回植，将软骨细胞-耳支架复合物体外培养I周后分别进行裸鼠皮下植入。
[0022]进一步，在上述步骤f中，植入时采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部横向切开皮肤约2cm，用眼科弯剪在皮下向头侧分离出腔隙；将细胞材料复合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉钩暴露分离开的腔隙，眼科镊轻轻夹持组织边缘，将组织送入到皮下间隙内，耳支架凹陷面贴靠皮肤，固定好位置，以5-0尼龙线缝合切口 ；以Imm注射器由皮肤刺入，抽吸空气，使皮肤和肉膜紧贴细胞材料复合物，8周后取材。
[0023]进一步，在上述步骤e中，将软骨细胞等量均匀的接种在两组支架材料上，在37°C,5% CO2，饱和湿度条件下培养4小时后，加入软骨细胞培养液，即10%胎牛血清，1%三抗的DMEM培养基，继续培养，隔天换液。
[0024]进一步，在上述步骤dl中，无菌条件下切取新西兰大白兔单侧耳廓软骨，仔细剥离表面的软骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的组织块，氯霉素冲洗液冲洗3遍。
[0025]进一步，在上述步骤b3中，滴加PLA溶液时，PLA含量占总PGA/PLA支架的5% -10%。
[0026]进一步，在上述步骤b4中，在55_70°C高温下加热，I小时后置于压力器下200N-500N加压至模具彻底冷却。
[0027]进一步,在上述步骤a中，网格间距层高0.1mm。
[0028]进一步，在上述步骤a中，在55_70°C下，加热约5_10分钟后，迅速加压，压力为200N-500N。
[0029]与现有技术相比较本发明的有益效果在于:本发明应用带PCL内核材料可以构建组织工程软骨，具有足够的强度对抗植入皮下所带来的张力从而维持原先复杂精确的形状。
[0030]本发明拟采用的网状PCL内核在构建耳廓等特殊形态软骨方面具有显著优势:
(1)该支架可通过三维打印制备，网孔大小，网格厚度等关键参数均可精确调控；(2)该支架在常规加热(约60°C)加压的条件下可通过模具精确塑形，冷却到室温或体温后形态维持不变，显然有利于耳廓形态精确控制及维持；(3)在包裹PGA纤维的前提下加热加压塑形，则PCL内核可与PGA纤维紧密粘连，且网孔部分也能被PGA填充，不会发生内核与外围材料脱离的现象。
[0031]此外，接种的细胞经PGA引导能长入PCL网孔内部，经体外培养，PGA降解后，所形成的软骨样组织不仅充分覆盖PCL表面，并且也充分长入其网孔内部，形成锚定结构，进一步防止了外围组织与内核材料脱离。
[0032]本发明构建出具有精确形态并且不随时间而变形的组织工程耳廓软骨，为组织工程入耳向临床应用转化探索新的思路与方法。 【具体实施方式】
[0033]以下，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0034]本发明应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法的具体过程为，
[0035]步骤a，制作PLC内核；PCL内核是PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术制成的网格状多孔支架，本实施例中，网格间距2mm，层高0.1mm。将网格状的PCL裁剪成适合大小，置于耳廓模具中加压固定。在55-70°C下,加热约5-10分钟后,迅速加压,压力为200N-500N ;待加压过程中冷却至室温后，取出成耳廓型的PCL内核，修剪多余材料。
[0036]步骤b，制作带PCL内核PGA/PLA复合耳支架；
[0037]步骤b I，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，将PGA无纺棉均匀的铺在专用的长方形盒中，制作成长方形的小片，每片约150mg，共需2片；
[0038]步骤b2，将上述小片置于耳廓模具中并用无水乙醇浸饱，加压固定，待无水乙醇挥发后，耳廓形态初步稳定；
[0039]步骤b3，滴加0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具内继续加压塑形，每次滴加PLA溶液前先称重，待材料约为158-165mg时即不再滴加PLA溶液，最后得到两片耳廓形态PGA/PLA复合支架；滴加PLA溶液时，PLA含量占总PGA/PLA支架的5% -10% ;一般来说，不使用PLA或者PLA过少容易使PGA纤维过于蓬松而不利于塑形；但PLA含量过多又容易造成材料过于致密，导致PGA纤维难以充分填充PGL网孔，此外还会影响PGA/PLA材料的孔隙率、亲水性等；一般PLA含量小于20%时不会对材料的生物相容性造成明显影响。
[0040]步骤b4，将上述耳廓形态网格状PCL叠加于上述两片耳廓形态PGA支架间，置于耳廓模具中加压固定，在55-70°C高温下加热，I小时后置于压力器下200N-500N加压至模具彻底冷却，使微融的PCL与上下两层PGA/PLA复合支架紧密粘合；
[0041]步骤b5，取出制备好的带内核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3% -3%的PLA 二氯甲烷溶液后于模具中加压塑形，最终形成具有逼真耳廓形态的带内核支架；同理还可以制作出其他形态的支架，如圆形、三角形、方形、气管状等。
[0042]步骤c，制作PGA/PLA复合耳支架；
[0043]与上述步骤b相同，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，制作成长方形的小片，每片约300mg，滴加1% PLA，待材料约为330mg时即制备完成，修剪为耳廓形状备用。
[0044]步骤d，软骨细胞培养；
[0045]步骤dl，无菌条件下切取新西兰大白兔单侧耳廓软骨，仔细剥离表面的软骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的组织块,氯霉素冲洗液冲洗3遍；加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒温水浴振荡器消化30min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，沉淀细胞，除去胰蛋白酶；
[0046]步骤d2，加入0.15% II型胶原酶，即NB4，以软骨细胞培养液配成相应浓度，0.22微米针式滤器过滤，立即使用，置于37°C恒温水浴振荡器内消化6~8h ；
[0047]步骤d3，直至大部分软骨块被消化后，获得的消化液用100微米细胞滤网过滤，1500r/min，离心5min，沉淀的细胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基重悬，所得细胞以台盼蓝染色计数，并检查软骨细胞活力，在倒置显微镜下血细胞计数器计数后调整细胞密度至IxlOVcm2的浓度接种在IOOmm培养皿上，在37°C，5% CO2,饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养扩增，待软骨细胞生长至70% -80%融合时进行传代。
[0048]步骤e，耳廓支架构建软骨；
[0049]将耳廓支架用75%乙醇消毒后，PBS冲洗3次，软骨细胞培养液冲洗3次后将支架置于培养液中预培养；将第一代(PD兔耳软骨细胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10%FBS和1%三抗的DMEM培养液重悬至浓度100X 106/ml，等量均匀的接种在两组支架材料上。在37°C，5% C02，饱和湿度条件下培养4小时后，加入软骨细胞培养液，即10%胎牛血清，I %三抗的DMEM培养基，继续培养，隔天换液。
[0050]步骤f，体外构建耳廓的裸鼠皮下回植；
[0051]将软骨细胞-耳支架复合物体外培养I周后分别进行裸鼠皮下植入；植入时采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部横向切开皮肤约2cm，用眼科弯剪在皮下向头侧分离出腔隙；将细胞材料复合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉钩暴露分离开的腔隙，眼科镊轻轻夹持组织边缘，将组织送入到皮下间隙内，耳支架凹陷面贴靠皮肤，固定好位置，以5-0尼龙线缝合切口 ；以Imm注射器由皮肤刺入，抽吸空气，使皮肤和肉膜紧贴细胞材料复合物，8周后取材。
[0052]本发明在体外构建过程中，外围PGA材料充分降解，并且被接种于其上的软骨细胞所分泌的自体软骨组织替代，因此可有效避免PGA支架引发的异物反应；体外构建所形成的是软骨样组织，而非单纯的细胞材料复合物，因此性能更稳定，也更利于操作；体外构建技术平台有利于今后利用干细胞构建软骨，因为干细胞必须经历体外培养来实现成熟的软骨定向分化。
[0053]结果分析:
[0054]软骨细胞与材料
[0055]原代软骨细胞一般12~24小时贴壁，48小时后完全铺展开，开始增殖。软骨细胞刚刚贴壁时仍为圆形，逐渐伸展后呈椭圆形、三角形和多角形，细胞核为圆形或椭圆形。传代后软骨细胞增长加速，分裂细胞多见，大多是多角形，折光性强，一般5至7天左右即可达到90%以上的融合状态，免疫荧光染色细胞核PI衬染为红色，表达有II型胶原的细胞浆染为绿色。[0056]体外培养I周内用倒置像差显微镜连续观察显示，实验组和对照组的软骨细胞稳定地粘附在PGA材料纤维上，并分裂增殖，逐渐分泌细胞外基质。生物相容性检测显示实验组和对照组DNA定量检测无差别，结果有统计学意义，表明PCL内核不影响软骨细胞在材料上的粘附。扫描电镜显示，两组材料的细胞均已已完全铺展开并形成丰富的细胞外基质，实验组切面可见PCL内核上也有细胞粘附并分泌基质。
[0057]本发明的PCL-PGA/PLA复合耳支架，基于该耳支架体外构建的耳廓形态软骨已获得成功，并且植入裸鼠体内后可长期维持形态。以往基于PGA/PLA耳支构建的耳廓在裸鼠体内无法维持形态；用钛网支撑物辅助移植有助于形态维持，但在大动物体内可能会引发异物反应。因此，本发明采用PCL支架作为内核，外围包裹PGA纤维，再经PLA包埋，形成PCL-PGA/PLA复合耳支架；目前，基于该支架应用动物软骨细胞体外构建耳廓形态软骨已获成功，并且植入裸鼠体内后可长期维持形态。
[0058]通过延长体外培养时间，提高体外构建软骨质量，解决利用细胞材料复合物在免疫动物体内再生软骨组织。
[0059]采用10%~20%含量的PLA包埋PGA，既增加支架材料的力学性能又延缓其降解速率，在体外实现构建产物形态长久维持；采用医用纯钛内支撑网在皮下植入时辅助维持耳廓形态；将上述体内构建的耳廓去除内支撑后再植入皮下，形态可继续维持。
[0060]PCL内核材料在裸鼠体内构建过程中有助于维持耳廓的精确形态，并且生物相容性好，可形成紧实的PCL软骨复合体。
[0061] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，该具体过程为: 步骤a，制作PLC内核；PCL内核是PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术制成的网格状多孔支架，将网格状的PCL裁剪成适合大小，置于耳廓模具中加压固定，加热加压，待加压过程中冷却至室温后，取出成耳廓型的PCL内核，修剪多余材料； 步骤b，制作带PCL内核PGA/PLA复合耳支架； 步骤b I，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，将PGA无纺棉均匀的铺在专用的长方形盒中，制作成长方形的小片，每片约150mg，共需2片； 步骤b2，将上述小片置于耳廓模具中并用无水乙醇浸饱，加压固定，待无水乙醇挥发后，耳廓形态初步稳定； 步骤b3，滴加0.3 % -3 %的PLA 二氯甲烷溶液，并于模具内继续加压塑形，每次滴加PLA溶液前先称重，待材料约为158-165mg时即不再滴加PLA溶液，最后得到两片耳廓形态PGA/PLA复合支架； 步骤b4，将上述耳廓形态网格状PCL叠加于上述两片耳廓形态PGA支架间，置于耳廓模具中加压固定，加热加压冷却，使微融的PCL与上下两层PGA/PLA复合支架紧密粘合； 步骤b5，取出制备好的带内核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3 % -3 %的PLA 二氯甲烷溶液后于模 具中加压塑形，最终形成具有逼真耳廓形态的带内核支架； 步骤C，制作PGA/PLA复合耳支架； 与上述步骤b相同，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，制作成长方形的小片，每片约300mg，滴加1% PLA，待材料约为330mg时即制备完成，修剪为耳廓形状备用； 步骤d，软骨细胞培养； 步骤dl，无菌条件下切取新西兰大白兔单侧耳廓软骨，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置于37°C恒温水浴振荡器消化30min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，沉淀细胞，除去胰蛋白酶； 步骤d2，加入0.15% II型胶原酶，以软骨细胞培养液配成相应浓度，0.22微米针式滤器过滤，立即使用，置于37°C恒温水浴振荡器内消化6~8h ; 步骤d3，直至大部分软骨块被消化后，获得的消化液用100微米细胞滤网过滤，1500r/min，离心5min，沉淀的细胞用含10%胎牛血清和I %三抗的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基重悬，所得细胞以台盼蓝染色计数，并检查软骨细胞活力，在倒置显微镜下血细胞计数器计数后调整细胞密度至IxlOVcm2的浓度接种在IOOmm培养皿上，在37°C，5% CO2，饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养扩增，待软骨细胞生长至70% -80%融合时进行传代；步骤e，耳廓支架构建软骨；将耳廓支架用75 %乙醇消毒后，PBS冲洗3次，软骨细胞培养液冲洗3次后将支架置于培养液中预培养；将第一代(PD兔耳软骨细胞用0.25%胰蛋白酶消化收集，用含10% FBS和1%三抗的DMEM培养液重悬至浓度100 X 106/ml，等量均匀的接种在两组支架材料上；步骤f，体外构建耳廓的裸鼠皮下回植，将软骨细胞-耳支架复合物体外培养I周后分别进行裸鼠皮下植入。
2.根据权利要求1所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤f中，植入时采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部横向切开皮肤约2cm，用眼科弯剪在皮下向头侧分离出腔隙；将细胞材料复合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉钩暴露分离开的腔隙，眼科镊轻轻夹持组织边缘，将组织送入到皮下间隙内，耳支架凹陷面贴靠皮肤，固定好位置，以5-0尼龙线缝合切口 ；以Imm注射器由皮肤刺入，抽吸空气，使皮肤和肉膜紧贴细胞材料复合物，8周后取材。
3.根据权利要求1或2所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤e中，将软骨细胞等量均匀的接种在两组支架材料上，在37°C，5% CO2，饱和湿度条件下培养4小时后，加入软骨细胞培养液，即10 %胎牛血清，I %三抗的DMEM培养基，继续培养，隔天换液。
4.根据权利要求3所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤dl中，无菌条件下切取新西兰大白兔单侧耳廓软骨，仔细剥离表面的软骨膜，剪成ImmX ImmX Imm大小的组织块,氯霉素冲洗液冲洗3遍。
5.根据权利要求3所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤b3中，滴加PLA溶液时，PLA含量占总PGA/PLA支架的5% -10%。
6.根据权利要求5所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤b4中，在55-70°C高温下加热，I小时后置于压力器下200N-500N加压至模具彻底冷却。
7.根据权利要求5所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤a中，网格间距层高0.1mm。
8.根据权利要求7所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤a中，在55-70°C下，加热约5-10分钟后，迅速加压，压力为200N-500N。
【文档编号】A61L27/48GK103948969SQ201410163412
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】周广东, 刘豫, 曹谊林, 殷宗琦 申请人:上海国睿生命科技有限公司