人sfrp1变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人SFRP1蛋白变体，及其在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。使本发明的人SFRP1变体在癌细胞中过量表达，或通过体外补给人SFRP1蛋白变体，以控制癌细胞增殖并杀死癌细胞。
【专利说明】人SFRP1变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地说，本发明涉及肿瘤抑制蛋白变体。
【背景技术】
[0002]SFRP,分泌型 Frz 相关蛋白(secreted frizz led-related proteins),含有一个富含半胱氨酸的结构域(cysteine rich domain, CRD),但缺少七次跨膜域,它可能与卷曲蛋白(frizzled,Frz)竞争结合Wnt蛋白，从而抑制Wnt蛋白的过量表达。Wnt是一类分泌型糖蛋白，对人体正常细胞增殖起调整促进作用。近期实验发现，抑制这种蛋白质作用的基因SFRP发生异常时，Wnt蛋白质的机能会随之出现异常，使得癌细胞不断增殖，导致发生大肠癌。当把正常的SFRP基因注入癌细胞后，就会控制癌细胞增殖和杀死癌细胞。研究表明，90%的大肠癌患者与SFRP基因异常有关。
[0003]在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的活性位点进行特异性的突变和取代，从而寻找活性 更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性， 申请人:通过大量的实验，针对SFRPl氨基酸序列中特定的位点进行了点突变，从而获得了比SFRPl蛋白本身具有更高抑制活性的变体。
[0004]发明详述
[0005]本发明涉及亲本蛋白的分离的变体，其在至少一个对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置 34Y、39F、42D、50R、58C、63A、89E、100L、122L、137R、151W、174A、1981、220N、242D、271M、286K或293E的位置包含修饰。具体而言，本发明的变体具有改善的抑制活性。
[0006]优选地，应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体为以下任一修饰:34Y/A、39F/D、42D/R、50R/S、58C/G、63A/H、89E/A、100L/D、122L/R、137R/S、151W/G、174A/R、198I/A、220N/S、242D/G、271M/D、286K/R 或 293E/L。
[0007]本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法，包括(a)培养宿主细胞；和(b)回收所述蛋白变体。
[0008]在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
[0009]所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
[0010]本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification, J.-C.Janson 和 Lars Ryden 编，VCH Publishers, NewYork, 1989)。
[0011]本发明的多肽用于制备相应的药物，去用于治疗癌症。
【具体实施方式】
[0012]1.SFRPl基因的获得
[0013]PCR扩增SFRPl的ORF区共314个氨基酸，模板为含有人类基因组的样本。两端引入酶切位点BamHI和EcoRI，酶切后与用同样的酶消化的pET载体连接，转化大肠杆菌后挑单克隆，测序。测得其氨基酸序列如序列I所示。
[0014]所用的引物序列如下，SFRPl的引物为(不去除终止密码不含his-myc):[0015]Sfrp13.1B(-):F:5’ -CGGGATCCATGGGCATCGGG-3’:
[0016]R: 5，-CGGAATTCCGTCACTTAAACACGGACT-3，。
[0017]2.SFRPl变体的构建
[0018]突变点的引入
[0019](I)根据相应的突变位点设计相应的诱变引物，采用PCR定点突变法在SFRPl基因上把野生型对应的氨基酸位点进行突变；
[0020](2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶进行酶切，与经过相同酶切的质粒P⑶ΝΑ3.1片段连接后，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞；
[0021]3.2.鉴定重组质粒:用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到突变后的核苷酸序列。
[0022]4.PCDNA3.1-SFRPl 变体质粒构建
[0023]将第二步构建获得的SFRPl变体基因的两端引入酶切位点BamHI和EcoRI，酶切后与用同样的酶消化的PCDNA3.1连接，鉴定后，将质粒转染细胞株:7721肝癌细胞，检验SFRPl变体能的抑制肝癌细胞生长的效果。具体结果如下:
[0024]表1SFRPl变体过表达抑制细胞生长情况
[0025]
【权利要求】
1.一种人SFRPl蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.一种人SFRPl蛋白变体，其特征在于:其在至少一个对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置 34Y、39F、42D、50R、58C、63A、89E、100L、122L、137R、151W、174A、1981、220N、242D、271M、286K或293E的位置包含取代。
3.一种人SFRPl蛋白变体，其特征在于，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸的基础上，分别在 34Y/A、39F/D、42D/R、50R/S、58C/G、63A/H、89E/A、100L/D、122L/R、137R/S、151W/G、174A/R、198I/A、220N/S、242D/G、271M/D、286K* 293E/L 进行相应的取代。
4.如权利要求2所述的蛋白变体在制备抑制肿瘤药物中的用途。
5.一种抗肿瘤药物制剂，它含有权利要求2所述的蛋白质以及药学上合适的载体。
【文档编号】A61K38/17GK103951743SQ201410172978
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】陈秀定 申请人:陈秀定