一种体外构建组织工程复合物的方法
【专利摘要】本发明提供了一种体外构建组织工程复合物的方法，通过以下技术方案实现：通过用天然来源的I型胶原作为基质的温度敏感性的胶原凝胶作为细胞外基质，在低温下将高浓度的种子细胞制成细胞悬液，以注射的方式种植于具有一定形状的支架材料中，然后在37℃下进行预培养形成不流动的凝胶态，将复合物转移至三维培养装置继续增殖培养至满足移植修复条件。本发明有效提高种植细胞的数量，避免细胞丢失，改善细胞在材料内部的分布，TCH可以和任何生物支架材料结合，并适用于各种组织工程复合物的构建。
【专利说明】一种体外构建组织工程复合物的方法【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种体外构建组织工程复合物的方法。
【背景技术】
[0002]组织工程技术是一种再生医学领域的一项新技术，它是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物的科学。组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损病分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。
[0003]组织工程的研究集中在种子细胞、各种细胞因子、生物材料(细胞外基质)以及细胞一材料复合物体外构建等方面。其中，将种子细胞与具有一定三维空间结构的生物材料结合形成具有一定生物学活性的复合物是组织工程研究的一个重要方面，也是一个难点。目前的复合物体外构建的细胞外基质材料多采用:
[0004](1)单独应用生物可降解吸收材料作为支架；
[0005](2)单独应用生物体来源的胶原作为细胞外基质；
[0006](3)胶原与降解材料相结合；
[0007](4)单独应用温敏胶原作为细胞外基质；
[0008](5)目前的温凝胶原多为人工化学合成，主要用于包埋细胞培养。
[0009]这些构建方式存在的问题在于:
[0010](1)由于种植的细胞悬液处于流动态，导致体外构建的初始阶段种植细胞流失严重；
[0011](2)由于细胞数量不足，需要较长时间的三维培养以获得细胞繁殖；
[0012](3)难以获得细胞在支架材料中良好的分布；
[0013](4)单独应用温敏水凝胶的适用范围过窄，可能只适用于不需要支架材料以注射方式直接植入体内修复形式；
[0014](5)生物来源的壳聚糖温敏水凝胶作为支架材料，适应范围较小，构建方式中采用将细胞注入水凝胶中的方式完成，限制了细胞在基质中的活动，而且不能达到良好的细胞分布。
【发明内容】
[0015]本发明的目的在于提供一种体外构建组织工程复合物的方法，旨在解决现有技术的不足。[0016]本发明是这样实现的，一种体外构建组织工程复合物的方法，包括以下步骤:
[0017](I)在O~10°C温度条件下制备温敏胶原溶液；
[0018](2)将细胞浓度为I~2X 1fVmL种子细胞与0.2~0.4ml温敏胶原溶液混悬，制备细胞-温敏胶原悬液；
[0019](3)将0.2~0.4ml步骤(2)所述原悬液以注射的方式种植于支架材料中，得到复合物；
[0020](4)将步骤(3)所述复合物在37°C条件下预培养，使温敏胶原凝胶化；
[0021](5)将步骤(4)中预培养后的复合物移至三维培养装置中待移植使用，或进行继续细胞扩增至满足移植条件。
[0022]优选地，在步骤(1)中，所述温敏胶原为动物来源的I型胶原制备。
[0023]优选地，在步骤(1)中，所述温度为10°C。
[0024]相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:
[0025](I)本发明采用I型胶原作为基质的温敏胶原提高了生物相容性。
[0026](2)本发明中温敏胶原在37°C培养后凝胶化的特质，最大限度地避免细胞流失，保留了原始种植细胞 的数量，由于细胞数量充足，缩短了体外构建的时间。
[0027](3)本发明采用温敏胶原与细胞预先制备细胞悬液后种植于支架材料中的方式，使细胞在材料内部具有良好的分布，并跨越了细胞增殖长入材料空隙内部的难题。
[0028](4)本发明中通过将细胞悬液与可生物降解的支架材料相结合，可根据材料的降解时间，物理形状，力学强度等多方面的参数满足各种组织工程复合物体外构建的需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1是本发明实施例中复合物体积变化示意图；
[0030]图2是本发明实施例中复合物动态培养7天后的电镜扫描图；
[0031]图3是本发明实施例中TCH与普通I型胶原总DNA含量分析比较结果图。
【具体实施方式】
[0032]本发明提供了一种体外构建组织工程复合物的方法，通过以下技术方案实现:通过用天然来源的I型胶原作为基质的温度敏感性的胶原凝胶(Thermosensitive CollagenHydrogel,TCH)作为细胞外基质，在低温下将高浓度的种子细胞制成细胞悬液，以注射的方式种植于具有一定形状的支架材料中，然后在37°C下进行预培养形成不流动的凝胶态，将复合物转移至三维培养装置继续增殖培养至满足移植修复条件，具体过程如下:
[0033](I)在O~10°C温度条件下制备温敏胶原溶液；
[0034](2)将细胞浓度为I~2 X 1VmL种子细胞与0.2~0.4ml温敏胶原溶液混悬，制备细胞-温敏胶原悬液；
[0035](3)将0.2~0.4ml步骤(2)所述原悬液以注射的方式种植于支架材料中，得到复合物；
[0036](4)将步骤(3)所述复合物在37°C条件下预培养，使温敏胶原凝胶化；
[0037](5)将步骤(4)中预培养后的复合物移至三维培养装置中待移植使用，或进行继续细胞扩增至满足移植条件。[0038]在上述技术操作中，温敏胶原溶液的制备依照温敏胶原培养试剂盒使用说明书进行，其中，温敏胶原培养试剂盒(购于Nitta-gelatin C0.Ltd.，Osaka, Japan),含有(I)Cellmatrix Type 1-A,由猪来源的I型胶原制备而成；(2) 10倍浓缩的不含NaHCO3的DMEM培养液；(3)在构成缓冲液含有 260mmol/L NaHCO3, 50mmol/L NaOH,和 200mmol/L HEPES0 按照⑴:⑵:(3) = 8:1:1的比例制备温敏胶原混悬液。
[0039]在本发明中，将温敏胶原应用于组织工程复合物的体外构建，以获得良好的初始构建复合物，有效提高种植细胞的数量，避免细胞丢失，改善细胞在材料内部的分布。TCH可以和任何生物支架材料结合，并适用于各种组织工程复合物的构建。
[0040]在本发明中，使用温敏胶原作为细胞稀释液(混悬液)，通过温度敏感性胶原替代普通的胶原作为细胞外基质，通过温度感应使胶原细胞外基质凝胶化，限制细胞的流动性，最大限度地保留了原始种植的细胞数量，明显缩短了种子细胞在复合物中的增殖过程，避免了原始阶段细胞的流失；此外，温敏胶原-细胞混悬液可以注射至预先制备的各种形状的材料模具中，与各种不同的可生物降解的生物支架材料相结合，满足不同组织构建的要求；由于低温下细胞悬液具有一定流动性，细胞在材料内部具有良好的分布，通过注射的方式可以将细胞悬液种植到支架材料的内部，可以在构建初期即得到良好的细胞分布，可以跨越种子细胞爬行长入三维材料内部的这个难点；由于温敏胶原由浓缩的细胞培养液配制而成，而且具有高度的亲水性，可满足细胞物质交换的需求，细胞可以在原位继续增殖，满足不同组织体外构建的需求。
[0041]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图以及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0042]实施例
[0043]以构建组织工程周围神经为目标，以编织的可降解的聚乳酸(PLLA)作为支架材料，以骨髓间质干细胞(MSCs)作为种子细胞。利用TCH在4°C下将MSCs(lX106/mL，0.2mL)混悬后种植于PLLA内部，经过30分钟预培养(无培养基)后，继续动态培养7天，培养过程中观察TCH的体积变化，如图1所示，图1中，图1A为预培养后PLLA内部和周围包绕凝胶化的TCH，图1B、1C、1D分别为培养3、5、7天后，TCH逐渐收缩使复合物体积逐渐减小。动态培养7天后，用电镜扫描，如图2所示，其中，图2A为复合物表面复层细胞结构(实箭头)及其内部为PLLA纤维(空箭头)；图2B为复合物表面细胞呈平行排列，图2C为细胞表面可见较多的绒毛结构(实箭头)，证明细胞活性良好；图2D为复合物横断面扫描电镜照片，其中，胶原纤维(TCH)(实箭头)充满于PLLA纤维(空箭头)内部；图2E为复合物纵断面扫描电镜照片，其中，PLLA纤维(空箭头)中可见大量的细胞(实箭头)生长，分布良好。
[0044]利用TCH与普通I型胶原对照研究,通过总DNA含量分析，分析结果如图3所示，培养后30分钟，TCH组复合物中细胞保有率为85%，对照组(普通I型胶原)为30%，明显提高了种植细胞的数量(P〈0.01)，有效避免了在初始培养阶段种植细胞的丢失。
[0045]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种体外构建组织工程复合物的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)在O~10°C温度条件下制备温敏胶原溶液； (2)将细胞浓度为I~2X1fVmL种子细胞与0.2~0.4ml温敏胶原溶液混悬，制备细胞-温敏胶原悬液；(3)将0.2~0.4ml步骤(2)所述原悬液以注射的方式种植于支架材料中，得到复合物； (4)将步骤(3)所述复合物在37°C条件下预培养，使温敏胶原凝胶化； (5)将步骤(4)中预培养后的复合物移至三维培养装置中待移植使用，或进行继续细胞扩增至满足移植条件。
2.如权利要求1所述的体外构建组织工程复合物的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述温敏胶原为动物来源的I型胶原制备。
3.如权利要求2所述的体外构建组织工程复合物的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述温度为10°c。
【文档编号】A61L27/44GK104027845SQ201410252548
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】黄岚峰, 赵劲松, 陈炳鹏, 王晓楠, 杜珍武, 马健超, 戴琎, 李秋菊 申请人:吉林大学第二医院