心脑欣胶囊在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了心脑欣胶囊在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明证实了心脑欣胶囊能明显降低大鼠的行为学评分、脑梗死率、NO含量以及NOS活力，改善血液流变动力学指标，并且可浓度依赖性地舒张NE预收缩的血管。
【专利说明】心脑欣胶囊在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及心脑欣胶囊在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中 的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，缺血性脑血管病严重影响人类生存质量。脑缺血又称脑梗死，是一类由于脑 血流供应障碍引起缺血、缺氧，导致局限性脑组织缺血性坏死或脑软化的疾病，而脑缺血再 灌注损伤是引发多种脑血管疾病的重要病理生理机制。脑缺血再灌注损伤是指缺血脑组织 在恢复血液灌注后，脑组织损伤进一步加重，其发生机制尚未彻底阐明。近年来，随着临床 医学上休克治疗的进展及动脉搭桥术和溶栓疗法等的推广应用，使缺血再灌注损伤的研究 成为当前关注的项目之一，其中药物性保护作用也越来越受到重视。
[0003] 心脑欣胶囊为三普药业股份有限公司产品，国药准字Z20025866,主治益气养阴、 活血化瘀。但作用在治疗脑缺血再灌注损伤中还未见报道。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明的目的在于提供心脑欣胶囊的新应用。
[0005] 本发明公开了心脑欣胶囊在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。
[0006] 上述的心脑欣胶囊，优选由以下重量份数组分组成：红景天3?6份，枸杞5?15 份，沙棘3?9份。
[0007] 有益效果：本发明证实了心脑欣胶囊能明显降低大鼠的行为学评分、脑梗死率、N0 含量以及NOS活力，改善血液流变动力学指标，并且可浓度依赖性地舒张NE预收缩的血管。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1为心脑欣胶囊对MCA0模型大鼠脑梗死的影响；
[0009] 图2为心脑欣胶囊对MCA0模型大鼠神经元形态的影响（HE染色，X100);
[0010] 图3为心脑欣胶囊对MCA0模型大鼠神经元形态的影响（HE染色，X200);
[0011] 图4心脑欣胶囊对NE预收缩血管的舒张率的影响n=6)注：与假手术组比 较，#P〈0. 05, ##P〈0. 01 ;与模型组比较，*P〈0. 05, **P〈0. 01。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 :
[0013] 心脑欣胶囊由重量份数为3份的红景天、5份的枸杞和3份的沙棘混合而成。
[0014] 实施例2 :
[0015] 心脑欣胶囊由重量份数为4份的红景天、10份的枸杞和6份的沙棘混合而成。
[0016] 实施例3:
[0017] 心脑欣胶囊由重量份数为5份的红景天、12份的枸杞和8份的沙棘混合而成。
[0018] 实施例4:
[0019] 心脑欣胶囊由重量份数为6份的红景天、15份的枸杞和9份的沙棘混合而成。
[0020] 实施例5:
[0021] 心脑欣胶囊治疗脑缺血再灌注损伤的动物实验
[0022] 1实验材料
[0023] 1. 1药物与试剂
[0024] 心脑欣胶囊，内容物为棕褐色粉末，0. 5g/粒，批号：120803,三普药业股份有限公 司；实验时，去除胶囊外壳，研磨内容物，用双蒸水配置成所需浓度。喜得镇，规格：lmg，批 号：2L850T，天津华津制药有限公司；实验时，研磨为粉末，用双蒸水配置成所需浓度。
[0025] -氧化氮（N0)试剂盒、一氧化氮合酶（N0S)试剂盒、考马斯亮试剂盒均购自南京 建成科技有限公司；TTC购自南京优思博有限公司。其他试剂均为分析纯。
[0026] 1. 2仪器
[0027] 电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；酶标仪（Thermo,美国）；96孔培养板 (Costar，美国）；电动匀浆机；北京赛科希德SA-6000血流变仪；北京赛科希德SC-2000血 小板聚集仪；台式离心机Kubota5800(久保田公司，日本）；数控超级恒温箱；肌张力传感 器，型号JH-2 ;恒温平滑肌槽，型号HW-400SE;BL-410生物机能实验系统，以上均为成都泰 盟科技有限公司产品。
[0028]1. 3实验动物
[0029] 成年雄性SD大鼠，体重200?250g，由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产 许可证号：SCXK(苏）2012-0004。动物分笼饲养，保持12h昼夜节律，室温22±1°C，自由饮 水摄食。
[0030] 2实验方法
[0031] 2. 1给药、分组及造模
[0032] 大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、阳性药组、心脑欣胶囊低剂量组、中剂量组 及高剂量组。灌胃给药，每天1次，连续给药7d;给药剂量：喜得镇组为0. 8mg/kg/d，心脑欣 低、中、高剂量组为100、200、4001^/1^/(1，末次给药11 1后手术。模型组及假手术组灌胃相同 容积水。分别于再灌注lh、24h后检测相应指标。
[0033]大鼠中动脉栓塞模型（middlecerebralarteryocclusion，MCA0)的制备：手术 采用改进Longa线栓法复制大鼠右侧大脑中动脉脑缺血再灌注模型。大鼠10%水合氯醛腹 腔注射（lg/kg)麻醉后，将其仰卧固定。分离右颈总动脉（CCA)、颈内动脉（ICA)及颈外动 脉（ECA)并挂线备用，结扎ECA与CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分 叉处作一切口，从切口处插入一端加热成光滑球形鱼线（直径为〇. 25mm，距球端2cm处作 标记）。线插入ICA后，于入口处稍稍结扎鱼线与入口处ICA段，然后松开夹闭ICA的动脉 夹，继续插入鱼线至稍有阻力后略回撤，至线插入深度为（18. 5±0. 5)mm左右，实现大脑中 动脉阻塞导致脑缺血。再次结扎入口处，鱼线外留约lcm，缝合皮肤。2h后轻轻提拉所留线 头至有阻力，实现大脑中动脉再灌，则造模完成。假手术组只结扎ECA与ICA。在全部造模 过程中保持动物肛温在37 °C左右。
[0034] 2. 2大鼠神经功能缺陷评分
[0035] 整个评分采用单盲法，即评分者不知道实验动物分组情况。采用longa的5分评 分标准。0分为无症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向对侧转圈；3分为向对侧倾 倒；4分为不能自行行走，意识丧失。剔除0分、4分和术后死亡动物，达到1、2、3分的动物 均为造模成功。恢复供血lh及24h后分别测定大鼠神经功能缺陷评分。
[0036] 2. 3脑组织匀浆的制备
[0037] 大鼠股动脉取血后，立即将其脱颈椎处死，于冰浴上取出大脑组织，在预冷的生理 盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重。按重量体积比加生理盐水制成10 %的组织匀浆， 2500r/min，离心15min，取上清液备用。
[0038] 2. 4脑组织各项指标的测定
[0039] 脑组织中N0含量、N0S活力的测定按试剂盒说明进行操作，蛋白质含量采用考马 斯亮蓝法测定。
[0040] 2. 5脑梗死率的测定
[0041] 大鼠断头处死后取脑，脑去除嗅球、小脑和低位脑干，取左侧大脑半球，沿冠状面 切成5片，置于2%TTC磷酸盐缓冲液中，进行TTC染色，染色过程中严格避光，37°C水浴箱 中孵育30min，然后移置含4%多聚甲醛的PBS溶液中固定，白色部分为梗死组织，红色部分 为正常组织。计算公式：脑梗死率（％ )=梗死组织重量/全脑重量X100%。
[0042] 2. 6神经元形态的观察
[0043] 大鼠断头处死后迅速取出大脑，去小脑及延脑。标本固定于10%中性福尔马林缓 冲液内1周，取材之后再次固定12h，组织以乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡切片机 切片，进行苏木素一伊红（Haematoxylin-eosinStaining,HE)染色。
[0044] 具体步骤如下：
[0045] ①错切片机连续冠状切片，切片厚度5iim;
[0046] ②片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I)5min-二甲苯 (II) 5min一无水乙醇2min-95%的乙醇lmin-80%乙醇lmin-75%乙醇lmin-蒸馆水 洗 2min;
[0047] ③木素染色浸泡15min，自来水冲洗两遍；
[0048] ④酸乙醇分化30s;来水浸泡lOmin;
[0049] ⑤0? 5%伊红染液浸泡2min，自来水冲洗；
[0050] ⑥规脱水，透明，封片：95%乙醇（I)lmin-95%乙醇（11)1111；[11 一无水乙醇（I) lmin一无水乙醉（Il)lmin-二甲苯（I)lmin-二甲苯（II)lmin-中性树脂封闭。
[0051] 2. 7大鼠血液流变学指标测定
[0052] 全血粘度及血浆粘度的测定：大鼠行为学实验结束后，股动脉取血，枸橼酸钠溶液 (3.8% )抗凝。从加有抗凝剂的6mL全血中取出2mL加入血流变仪，分别测定低切（10s)， 高（200s)2个切变率下全血粘度。再取4mL全血以2500r/min离心lOmin，取上层血浆2mL 测定血浆粘度。
[0053] 血小板聚集功能测定：采用北京赛科希德SC-2000血小板聚集仪，室温下将已抗 凝的全血以l〇〇〇r/min离心8min，制备富血小板血浆（PRP)，放置2mLEp管中闭盖保存， 置恒温孔中备用，余下抗凝血3000r/min离心30min所得上清为贫血小板血楽（PPP)。取 200iiLPPP放入圆形杯中用以调零，取200iiLPRP加入盛有铁心搅拌子的圆形杯中，PPP 调零后拔出PPP圆形杯，放入PRP圆形杯，在加入终浓度为3. 5iimol/LADP20iiL同时按下 测定键，获得l、3min血小板聚集率（PAG)及最大血小板聚集率（MPAG)数值。
[0054] 2. 8大鼠离体胸动脉环的制备及药物处理
[0055] 大鼠股动脉取血后，开胸，迅速取出胸主动脉，浸泡于氧饱和K-H平衡液中，洗净 残血，剥除外膜脂肪及结缔组织，处理好的血管剪成4?5mm的血管环，将血管环一端连接 张力换能器，另一端固定于浴槽中，用BL-410生物机能实验系统记录主动脉环张力。将安 装好的血管环置于37°C恒温浴槽中温浴60min，持续通入95% 02和5%C02的混合气体，主 动脉环加静息负荷1. 5?2g，每隔20min更换K-H液1次，反复冲洗，标本60min后加入高 K+的K-H液，孵育15min，使血管达到收缩平衡。加入K-H液温浴30min，每lOmin换一次 液，使张力恢复到基线水平。加入3yLl(T6m〇l/L的去甲肾上腺素，15min后待张力稳定，换 液，重新加入K-H液，之后加入2yL的10_9mol/L的Ach，lOmin后待张力稳定，将K-H液排 出。按照以上方法依次加入l(T8m〇l/L、l(T7mol/L、l(r6mol/L、l(r5mol/L的Ach，依次测定主 动脉环张力变化。
[0056] 2. 9统计学处理
[0057] 所有数据以均数土标准差G±s)表示，采用单因素方差分析法（one-wayAN0VA) 对实验数据统计分析，P〈〇. 05为有统计学意义。
[0058] 3实验结果
[0059] 3. 1心脑欣胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤lh和24h神经功能缺损评分的影响
[0060] 再灌注lh时，缺血再灌注神经功能缺损症状最明显，24h后有所恢复。再灌注lh 后，模型组、心脑欣胶囊组、喜得镇组及假手术组大鼠的神经功能缺损评分三组间无显著性 差异。再灌注24h心脑欣胶囊组和喜得镇组神经功能缺损评分明显低于模型组。见表1。 [0061] 表1心脑欣胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤lh和24h神经功能缺损评分的影响 (x ±5, n二6)
[0062]
【权利要求】
1. 心脑欣胶囊在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。
2. 权利要求1所述的心脑欣胶囊，其特征在于，由以下重量份数组分组成：红景天3? 6份，枸杞5?15份，沙棘3?9份。
【文档编号】A61K36/815GK104257877SQ201410276400
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】史公权, 邹存生, 马俊仓, 吴留强, 夏彬, 牛蓉, 贺生玲, 李成秀 申请人:三普药业有限公司