免疫球蛋白变体及其用途

免疫球蛋白变体及其用途
【专利摘要】本发明提供了具有延长的体内半衰期，在Fc区中具有一处或多处氨基酸修饰的变异免疫球蛋白，及使用它们的方法。
【专利说明】免疫球蛋白变体及其用途
[000。 本申请是基于申请日为2009年10月13日， 优先权日:为2008年10月14日，申请 号为200980150204. 0,发明名称为；"免疫球蛋白变体及其用途"的专利申请的分案申请。 [000引相关申请
[0003] 本申请是依据37CFR 1. 53化）（1)提交的非临时申请，依据35USC 119(e)要求 2008年10月14日提交的临时申请号61/105, 086、2009年2月12日提交的临时申请号 61/152, 13U2009年4月22日提交的临时申请号61/171，768、和2009年6月25日提交的 临时申请号61/220, 514的优先权，通过述及将它们的内容收入本文。 发明领域
[0004] -般地，本发明涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及具有改变的生物学特 性的IgG免疫球蛋白变体及使用它们的方法。
[0005] 发明背景
[0006] 多年来，免疫球蛋白作为治疗剂的使用显著增多。人们对构成免疫系统的一个重 要部分的免疫球蛋白（Ig)分子极感兴趣，因为它们（1)与一个多种多样的配体家族反应， (2)拥有不同效应器功能及（3)具有极大的生物学重要性。今天，基于抗体的药物的用途包 括治疗癌症、自身免疫性疾病W及多种系统性和传染性疾病。还有，免疫球蛋白作为体内诊 断工具，例如在诊断成像规程中是有用的。
[0007] IgG是人类和其它哺乳类中最普遍的免疫球蛋白类别，而且在多种类型的免疫 疗法和诊断规程中使用。人IgGl是为了治疗最常用的抗体。当前，临床试验中的许多抗 体针对肿瘤相关抗原。特别地，抗VEGF中和性抗体显示出遏制裸鼠中多种人肿瘤细胞 系的生长化im et al.^^re 362 ;841-844(1993) ;Warren et al.J. Clin. Invest. 95: 1789-1797 (1995) ; Bo巧Str扫m et al. Cancer Res. 56 ;4032-4039 (1996) ;Melnyk et al. Cancer Res. 56 =921-924 (1996))，及还抑制缺血性视网膜病症模型中的眼内血管发生 (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114 ;66-71 (1996))。确实，一种人源化抗 VEGF 抗体，贝 伐单抗（AVASTIN⑥，Genentech, South San Rrancisco, CA)是第一种被美国 FDA 批准 的，设计用于抑制血管发生的疗法。
[0008] 尽管有潜力，免疫球蛋白免疫疗法的问题之一是免疫球蛋白在循环中的持久性。 免疫球蛋白清除速率直接影响免疫球蛋白的量和给药频率（化equency of dosage)。升高 的剂量和给药频率可在患者中引起不良作用，而且还提高医疗费用。
[0009] 经由晒齿类中涉及被动免疫经胎盘或卵黄囊或经初乳自母亲转移至胎儿/新 生儿（IgG经胞转的母体胎儿转移）的研究，阐明了循环中IgG异化的机制炬rambell， Lancet, ii ： 1087-1093,1966 ；Rodewald,J. Cell Biol. ,71 ：666-670,1976 ；Morris et al., In ：Antigen Absorption by the Gut,pp. 3-22,1978,University Park Press,Baltimore ; Jones et al.，J. Clin. Invest.，51 ;2916-2927,1972)。新生儿化受体（化化）在哺乳类 中IgG的胞转和稳态中发挥重要作用。化化在结构上与主要组织相容性复合物（MHC)I类 分子同源，而且由跨膜a链和目2-微球蛋白（目2m)组成。先前敲除小鼠中的研究例示 了 IgG在化化或目2m缺陷小鼠中的血清半衰期大大缩短（Roopenian et al.，J Immunol 170 (7)，3528-3533,2003 ;Israel et al.，Immunology 89 (4)，573-578,1996)，证明了 化化在调节循环IgG水平中的保护性作用。小鼠IgG的化区中的多项位点特异性诱变 实验导致了涉及IgG和化化之间相互作用的某些关键氨基酸残基的鉴定化im et al.， Elur. J. Immunol.，24 ;2429-2434,1994 ;Medesan et al.，Elur. J. Immunol. , 26 ：2533,1996 ； Medesan et al.，J. Immunol. ,158:2211-2217,1997)。另外，多份出版物记载了通过引入 或修饰IgG的化化结合区来获得半衰期改变的生理学活性分子的方法（WO 97/43316 ; 美国专利 No. 5, 869, 046 ;美国专利 No. 5, 747, 035 ;W096/32478 ;W02006053301 ;美国专利 No. 7, 083, 784 ;美国专利 No. 7, 371，826)。
[0010] 在分子水平，化化在C肥-C册域区中结合IgG的化部分。化-化化相互作用是 高度抑依赖性的；IgG在抑6 W高亲和力结合化化，但是随着抑上升至7. 4,结合亲和力 大大下降。此抑依赖性相互作用负责保护IgG免于降解。具体地，被胞饮的IgG在酸性 内体中被化化捕捉，再循环回到细胞表面，然后释放回到处于生理血清抑7.4的循环中 (Ober et al.Proc 化1:1 Acad Sci USA101(30), 11076-11081,2004 ;0ber et al.J Immunol 172(4)，2021-2029,2004 ;Pr油hat et al.Proc 化tl Acad Sci USA 104 (14),5889-5894， 2007)。未被化化结合的IgG被祀定至溶酶体并被降解。因为化化在调节IgG稳态中是 重要的，所W经由蛋白质工程来调控化与化化之间的相互作用是用于改进治疗性抗体的 药动学的一种方法（Shields et al.J Biol Chem 276 巧），6591-6604, 2001 ;Dair Acqua et al. P'Jat Biotechnol 15 (7)，637-640,1997 ;Dall' Acqua et al.，J Immunol 169 巧）， 5171-5180,2002 ;Hinton et al.J Biol Chem 279巧），6213-6216,2004 ;Hinton et al.J Immunol 176(1)，；M6-356,2006 ;Datta_Mannan et al. Drug Met油 Dispos 35 (1)，86-94， 2007 ;Datta-Mannan et al.J Biol Chem 282(3)，1709-1717,2007)。多项小鼠、恒河猴和 縣猴中的研究证明了提高IgG的抑6结合亲和力可延长半衰期值air Acqua et al.化t Biotechnol 15(7)，637-640，1997;Dall' Acqua et al.，J Immunol 169巧），5171-5180， 2002 ;Hinton et al. J Biol Qiem 279 巧），6213-6216,2004 ;Hinton et al. J Immunol 176 (1)，346-356, 2006)。此外，其它研究还证明了在抑7. 4的化化结合亲和力是IgG药动 学的另一项决定子。具体地，在抑7. 4对小鼠化化的结合亲和力升高的某些变体在小鼠中 展现升高的清除（即缩短的半衰期）值air Acqua et al.，J Immunol 169巧），5171-5180， 2002)。不过，尚未阐明化化亲和力与半衰期之间的详细相关性，因为先前的研究都涉及少 数变体，在化化亲和力的有限范围内。不清楚经由改造化：化化相互作用可实现的最大程 度的半衰期延长。
[0011] 尽管坚持（顺从）药物治疗是重要的，估计得到处方药物的患者一半没有W推荐 方式服用药物。例如，一项最新的研究显示多达H分之一服用在过去10年中开发的乳腺癌 药物的女性没有完成她们的五年推荐疗程。顺从性差的一些原因包括健忘、顺从的物理困 难（例如旅行至或搬离治疗场所）、不便、不良副作用、方案复杂和药物费用。药物治疗坚持 得差可导致所实现的健康福祉不及药物可提供给患者的全部。例如，不完成推荐的癌症疗 程可导致疾病复发和存活机会降低。
[0012] 改善药物顺从性的策略包括使它更加方便患者完成推荐的疗程。使免疫疗法处理 下的患者可实现该一点的方式之一是通过延长免疫球蛋白在循环中的持续时间。免疫球蛋 白清除速率直接影响免疫球蛋白的量和给药频率。因此，开发赋予延长的体内半衰期的免 疫球蛋白可降低量和/或给药频率，如此将不便W及任何别的医疗费用降至最低。
[0013] 因而，为了治疗，具有赋予延长的体内半衰期的经修饰免疫球蛋白会是高度有益 的。本发明解决该些和其它需要，正如阅读下述公开后会显而易见的。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明提供了新型IgG变体及其用途。在本发明中提供了多种IgG变体。例如， 本发明公开了新型IgG变体，其包含如下的人IgG化区，相对于野生型人IgG化区包含 依照K油at中的抓索引编号的氨基酸残基251、252、307、308、378、428、430、434、和436中 两处或更多处的两个或更多个氨基酸替代，其中所述变体IgG与具有野生型人IgG化区 的IgG的半衰期相比，具有延长的半衰期，且其中至少两处所述氨基酸替代是氨基酸残基 251、252、307、308、378、428、430、434、或436处的，而且氨基酸残基251处的氨基酸替代是 用天冬氨酸或谷氨酸进行的替代，氨基酸残基252处的氨基酸替代是用酪氨酸进行的替 代，氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨醜胺进行的替代，氨基酸残基308处的氨基酸 替代是用脯氨酸进行的替代，氨基酸残基378处的氨基酸替代是用额氨酸进行的替代，氨 基酸残基428处的氨基酸替代是用亮氨酸进行的替代，氨基酸残基430处的氨基酸替代是 用丙氨酸或赖氨酸进行的替代，氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸，丝氨酸或酪 氨酸进行的替代，而氨基酸残基436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。
[0016] 在某些实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸251处的氨基酸替代，其中所述 氨基酸251处的氨基酸替代是用天冬氨酸或谷氨酸进行的替代。在某些实施方案中，所述 人IgG化区包含氨基酸307处的氨基酸替代，其中所述氨基酸307处的氨基酸替代是用谷 氨醜胺进行的替代。在某些实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸308处的氨基酸替代， 其中所述氨基酸308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代。在某些实施方案中，所述人 IgG化区包含氨基酸378处的氨基酸替代，其中所述氨基酸378处的氨基酸替代是用额氨 酸进行的替代。在某些实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸436处的氨基酸替代，其 中所述氨基酸436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。在某些实施方案中，所述变 体IgG具有比具有野生型人IgG化区的IgG更高的对化化的结合亲和力。
[0017] 在一个实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸307处用谷氨醜胺进行的氨基酸 替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述人IgG化区包 含氨基酸307处用谷氨醜胺进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丝氨酸进行的氨基酸替 代。在一个实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸308处用脯氨酸进行的氨基酸替代和 氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述人IgG化区包含氨基 酸252处用酪氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个 实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸378处用额氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434 处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸428处用亮 氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中， 所述人IgG化区包含氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸436处用异亮氨 酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸308处用脯氨酸进 行的氨基酸替代和氨基酸434处用酪氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述人 IgG化区包含氨基酸307处用谷氨醜胺进行的氨基酸替代和氨基酸436处用异亮氨酸进行 的氨基酸替代。
[0018] 本发明还公开了新型IgG变体，其包含如下的人IgG化区，相对于野生型人IgG 化区包含依照K油at中的抓索引编号的氨基酸残基251、252、307、308、378、380、428、430、 434、和436中H处或更多处的H个或更多个氨基酸替代，其中所述变体IgG与具有野生型 人IgG化区的IgG的半衰期相比，具有延长的半衰期，且其中至少H处所述氨基酸替代是 氨基酸残基251、252、307、308、378、380、428、430、434、或436处的，而且氨基酸残基251处 的氨基酸替代是用天冬氨酸或谷氨酸进行的替代，氨基酸残基252处的氨基酸替代是用酪 氨酸进行的替代，氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨醜胺进行的替代，氨基酸残基 308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代，氨基酸残基378处的氨基酸替代是用额氨酸 进行的替代，氨基酸残基380处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代，氨基酸残基428处的 氨基酸替代是用亮氨酸进行的替代，氨基酸残基430处的氨基酸替代是用丙氨酸或赖氨酸 进行的替代，氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸进行的 替代，而氨基酸残基436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。
[0019] 在某些实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸251处的氨基酸替代，其中所述 氨基酸251处的氨基酸替代是用天冬氨酸或谷氨酸进行的替代。在某些实施方案中，所述 人IgG化区包含氨基酸307处的氨基酸替代，其中所述氨基酸307处的氨基酸替代是用谷 氨醜胺进行的替代。在某些实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸308处的氨基酸替代， 其中所述氨基酸308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代。在某些实施方案中，所述人 IgG化区包含氨基酸378处的氨基酸替代，其中所述氨基酸378处的氨基酸替代是用额氨 酸进行的替代。在某些实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸436处的氨基酸替代，其 中所述氨基酸436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。在某些实施方案中，所述变 体IgG与具有野生型人IgG化区的IgG相比，具有更高的对化化的结合亲和力。
[0020] 在一个实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸307处用谷氨醜胺进行的氨基酸 替代、氨基酸380处用丙氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丝氨酸进行的氨基酸替 代。在一个实施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸307处用谷氨醜胺进行的氨基酸替 代、氨基酸380处用丙氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。 在一个实施方案中，所述人IgGFc区包含氨基酸252处用酪氨酸进行的氨基酸替代、氨基酸 308处用脯氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用酪氨酸进行的氨基酸替代。在一个实 施方案中，所述人IgG化区包含氨基酸251处用天冬氨酸进行的氨基酸替代、氨基酸307 处用谷氨醜胺进行的氨基酸替代和氨基酸434处用组氨酸进行的氨基酸替代。
[0021] 在某些实施方案中，本发明提供了进一步包含位置297处用丙氨酸进行的氨基酸 替代的变体IgG或其片段。
[0022] 在某些实施方案中，本发明的变体IgG与具有野生型人IgG化区的IgG相比，具 有更高的对化化的结合亲和力。在某些实施方案中，所述变体IgG在抑6.0具有比在抑 7. 4更高的对化化的结合亲和力。在某些实施方案中，所述变体IgG是人的或人源化的 IgG。在某些实施方案中，所述变体IgG是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中， 所述变体IgG的IgG化区是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4化区。在某些实施方案中，所述变 体IgG的IgG化区是IgGl化区。
[0023] 在某些实施方案中，所述变体IgG是抗VEGF抗体。在某些实施方案中，所述变体 IgG是贝伐单抗化evacizum油）的变体。在某些实施方案中，所述具有野生型人IgG化区 的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中，所述野生型人IgG化区是贝伐单抗的化区。在 某些实施方案中，所述变体IgG包含重链可变域（SEQ ID N0;1)和轻链可变域（SEQ ID NO: 2)。在某些实施方案中，所述变体IgG包含重链可变域（SEQ ID N0;3)和轻链可变域（SEQ ID NO ;4)。在某些实施方案中，所述变体IgG包含重链可变域（SEQ ID NO ;7)和轻链可变 域（SEQ ID NO ;8)。
[0024] 本发明进一步公开了药物组合物，其包含任何本文所述变体IgG和药学可接受载 体。在本文中还提供了试剂盒，其包含容器中的任何本文所述变体IgG和使用说明。
[00巧]在某些实施方案中，所述变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG化区的IgG相比 延长了至少50%、100%、150%、200%、300%或更多。在某些实施方案中，所述变体136的 半衰期与具有野生型人IgG化区的IgG相比延长了至少2倍。在某些实施方案中，所述变 体IgG的半衰期与具有野生型人IgG化区的IgG相比延长了至少3倍。在某些实施方案 中，所述变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG化区的IgG相比延长了至少4倍。在某些 实施方案中，所述具有野生型人IgG化区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中，所述变 体IgG的半衰期是贝伐单抗的均值半衰期。在某些实施方案中，所述贝伐单抗的均值半衰 期是约10至12天（如在縣猴中测量的）或约3周（如在人中测量的）。
[0026] 在某些实施方案中，提供了包含人IgG化区的变体IgG,其中所述人IgG化区相对 于野生型人IgG化区包含依照K油at中的抓索引编号的氨基酸残基307和434处的氨基 酸替代，其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长的半衰 期，且其中所述氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨醜胺进行的替代，而所述氨基酸 残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代。在一个实施方案中，所述变体IgG是变 体IgGl，其包含重链可变域（SEQ ID N0;1)和轻链可变域（SEQ ID N0;2)，且包含如下的人 IgGl化区，相对于野生型人IgGl化区包含依照K油at中的抓索引编号的氨基酸残基307 和434处的氨基酸替代，其中所述变体IgGl具有与具有野生型人IgGl化区的IgGl的半衰 期相比延长的半衰期，且其中所述氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨醜胺进行的替 代，而所述氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代。
[0027] 在另一个实施方案中，提供了包含人IgG化区的变体IgG,其中所述人IgG化区 相对于野生型人IgG化区包含依照K油at中的抓索引编号的氨基酸残基307和434处的 氨基酸替代，其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长的 半衰期，且其中所述氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨醜胺进行的替代，而所述氨 基酸残基434处的氨基酸替代是用丝氨酸进行的替代。
[0028] 在另一个实施方案中，提供了包含人IgG化区的变体IgG,其中所述人IgG化区 相对于野生型人IgG化区包含依照K油at中的抓索引编号的氨基酸残基308和434处的 氨基酸替代，其中所述变体IgGl具有与具有野生型人IgG化区的IgG的半衰期相比延长 的半衰期，且其中所述氨基酸残基308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代，而所述氨 基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代。
[0029] 在另一个实施方案中，提供了包含人IgG化区的变体IgG,其中所述人IgG化区 相对于野生型人IgG化区包含依照K油at中的抓索引编号的氨基酸残基307、380和434 处的氨基酸替代，其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG化区的IgG的半衰期相比延 长的半衰期，且其中所述氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨醜胺进行的替代，所述 氨基酸残基380处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代，而所述氨基酸残基434处的氨基 酸替代是用丝氨酸进行的替代。
[0030] 在某些实施方案中，上文所述包含人IgG化区的变体IgG具有比具有野生型人 IgG化区的IgG更高的对化化的结合亲和力。在某些实施方案中，所述变体IgG在抑6.0 具有比在抑7. 4更高的对化化的结合亲和力。在某些实施方案中，所述变体IgG是人的 或人源化的IgG。在某些实施方案中，所述变体IgG是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实 施方案中，所述变体IgG的IgG化区是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4化区。在某些实施方案 中，所述变体IgG的IgG化区是IgGl化区。在某些实施方案中，所述变体IgG是抗VEGF 抗体。在某些实施方案中，所述变体IgG是贝伐单抗的变体。在某些实施方案中，所述具有 野生型人IgG化区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中，所述野生型人IgG化区是贝 伐单抗的化区。在某些实施方案中，所述变体IgG包含重链可变域（SEQ ID NO ;1)和轻链 可变域（SEQ ID NO ;2)。在某些实施方案中，在本文中提供了药物组合物，其包含任何包含 人IgG化区的变体IgG和药学可接受载体。在本文中还提供了试剂盒，其包含容器中的任 何包含人IgG化区的变体IgG和使用说明。
[0031] 在某些实施方案中，提供了包含人IgGl化区的变体IgG,其中所述变体IgG包含 重链可变域（SEQ ID N0;1)和轻链可变域（SEQ ID N0;2)，且其中所述人IgGl化区相对 于野生型人IgGl化区包含依照K油at中的抓索引编号的氨基酸残基434处的氨基酸替 代，其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgGl化区的IgG的半衰期相比延长的半衰期， 且所述变体IgG具有与具有野生型人IgGl化区的IgG对化化的结合亲和力相比更高的 对FcRn的结合亲和力，且其中所述氨基酸残基434处的氨基酸替代是用组氨酸的替代。在 某些实施方案中，所述变体IgG是变体IgGl。
[0032] 在某些实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG化区的IgG 的半衰期相比延长了至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100%。在一个实施方案 中，本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG化区的IgG的半衰期相比延长了至少 50%。在另一个实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG化区的IgG 的半衰期相比延长了至少75%。在又一个实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期与具有 野生型人IgG化区的IgG的半衰期相比延长了至少100%。
[0033] 在某些实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期是至少约15、20、25、30、35、或40 天。在一个实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期是至少约15天。在另一个实施方案中， 本发明的变体IgG的半衰期是至少约20天。在另一个实施方案中，本发明的变体IgG的半 衰期是至少约25天。在另一个实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期是至少约30天。在 另一个实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期是至少约35天。在另一个实施方案中，本 发明的变体IgG的半衰期是至少约40天。在某些实施方案中，所述变体IgG是变体IgGl。
[0034] 在某些实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期是在人中测量的半衰期。在某些 实施方案中，本发明的变体IgG的半衰期是在縣猴（cynomolgus monkey)中测量的半衰期。 在某些实施方案中，所述野生型IgG或所述具有野生型人IgG化区的IgG是贝伐单抗。在 某些实施方案中，贝伐单抗的半衰期是约10至12天（如在縣猴中测量的）或约20天（如 在人中测量的）。
[0035] 在本发明中提供了多种使用IgG变体的方法。提供了治疗受试者中的肿瘤的方 法。例如，所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。在某些 实施方案中，所述变体IgG是抗VEGF抗体。在某些实施方案中，所述变体IgG是贝伐单抗 的变体。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对所述受试者施用有效量的化疗剂。
[0036] 在本发明中提供了抑制受试者中的VEGF活性的方法。例如，所述方法包括对所述 受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。在某些实施方案中，所述VEGF活性是 血管发生。
[0037] 在本发明中提供了调控受试者中的血管通透性的方法。例如，所述方法包括对所 述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体I gG。
[0038] 在本发明中提供了治疗受试者中的非新生物病症（non-neoplastic disorder)的 方法。例如，所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。在某 些实施方案中，所述非新生物病症是自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述非新生物病 症是阿尔茨海默氏病。在某些实施方案中，所述受试者诊断有老年性黄斑变性。
[0039] 在本发明中提供了治疗受试者中的表达肥R的肿瘤的方法。例如，所述方法包括 对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。在某些实施方案中，所述变体 IgG包含重链可变域（SEQ ID N0;7)和轻链可变域（SEQ ID N0;8)。
[0040] 在本发明中提供了抑制或预防受试者中的癌细胞生长的方法。例如，所述方法包 括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。
[0041] 在本发明中提供了对受试者施用有效量的变体IgG的方法。该些施用方法可W与 本文所述其它方法（例如治疗方法）组合使用。在某些实施方案中，所述方法包括对所述 受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG,且其中每4周或更长间隔对所述受试 者施用所述变体IgG。在某些实施方案中，每5周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某 些实施方案中，每6周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中，每7周或更 长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中，每8周或更长时间间隔施用所述变体 IgG。在某些实施方案中，每9周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中，每 10周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中，每11周或更长时间间隔施用 所述变体IgG。在某些实施方案中，每12周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实 施方案中，所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何变体IgG,其中W比具有野生型人 IgG化区的IgG的推荐或规定剂量频率（prescribed dosage化equency)要低的频率施用 所述变体IgG。在某些实施方案中，所述具有野生型人I泌化区的IgG是贝伐单抗。在某 些实施方案中，W比贝伐单抗的规定剂量频率要低的频率施用所述变体IgG,例如贝伐单抗 的变体。
[0042] 在某些实施方案中，变体IgG首先每2周施用，稍后每4周或更长时间间隔施用。 在某些实施方案中，变体IgG首先每3周施用，稍后每6周或更长时间间隔施用。在某些实 施方案中，变体IgG首先每4周施用，稍后每8周或更长时间间隔施用。在某些实施方案 中，变体IgG首先每5周施用，稍后每10周或更长时间间隔施用。在某些实施方案中，变体 IgG首先每6周施用，稍后每12周或更长时间间隔施用。在某些实施方案中，变体IgG (例 如贝伐单抗的变体）首先W贝伐单抗的规定剂量频率施用，之后W比贝伐单抗的规定剂量 低的频率施用。
[0043] 在本文所述方法的某些实施方案中，变体IgG是抗VEGF抗体。在一个实施方案中， 抗VEGF抗体包含重链可变域（SEQ ID N0;1)和轻链可变域（SEQ ID N0;2)。在另一个实 施方案中，抗VEGF抗体是贝伐单抗的变体。
[0044] 在某些实施方案中，本发明的变体IgG静脉内施用于受试者。在某些实施方案中， 本发明的变体IgG皮下施用于受试者。
[0045] 在本文所述方法的某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者诊断 有癌症。在某些实施方案中，所述癌症选自下组；非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、成胶质 细胞瘤、乳腺癌、和结肠直肠癌。
[0046] 在本文中还提供了治疗受试者中的良性、癌前或非转移性癌症的方法，其包括对 该受试者施用有效量的变体IgG。在某些实施方案中，变体IgG的施用预防良性、癌前、或 非转移性癌症变成攻击性（invasive)或转移性癌症。例如，良性、癌前或非转移性癌症可 W是0期、I期、或II期癌症，而在某些实施方案中，变体IgG的施用预防良性、癌前或非转 移性癌症进展到下一期，例如I期、II期、III期或IV期癌症。在某些实施方案中，施用所 述变体IgG的时间和量足W治疗受试者中的良性、癌前、或非转移性肿瘤或者预防良性、癌 前、或非转移性肿瘤变成攻击性或转移性癌症。在某些实施方案中，施用变体IgG降低良 性、癌前、或非转移性肿瘤的肿瘤尺寸、肿瘤负荷、或肿瘤数目。变体IgG还可W-定的量和 时间施用W降低良性、癌前、或非转移性肿瘤中的血管密度。
[0047] 如本文所述，本发明的方法可用于治疗例如0期（例如原位癌）、I期、或II期癌 症。新辅助疗法和辅助疗法可用于治疗任何类型的癌症，例如良性或恶性。在本发明的某些 实施方案中，所述癌症是实体瘤，包括但不限于结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肺癌（例 如非小细胞肺癌）、黑素瘤、卵巢癌、膜腺癌、胃肠癌、头颈癌、肝癌和软组织癌（例如B细胞 淋己瘤诸如饥正和多发性骨髓瘤和白血病诸如慢性淋己细胞性白血病）。在另一个实施方 案中，良性、癌前、或非转移性肿瘤是息肉、腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、膜岛素瘤、软骨 瘤、骨瘤、血管瘤、淋己管瘤、脑脊膜瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、鱗状细胞乳头状瘤、听神经瘤、 神经纤维瘤、胆管囊瘤（cystanoma)、平滑肌瘤、间皮瘤、崎胎瘤、粘液瘤、沙眼、肉芽肿、错构 瘤、移行细胞乳头状瘤、唾液腺的多形（pleiomo巧hie)腺瘤、硬纤维瘤（desmoid tumor)、 皮样囊乳头状瘤（cys化apilloma)、囊腺瘤、灶性结节性增生、或结节再生性增生。在另一 个实施方案中，该方法希望用于治疗腺瘤。腺瘤的非限制性例子包括肝细胞（liver cell) 腺瘤、肾腺瘤、后肾腺瘤、支气管腺瘤、肺泡（alveolar)腺瘤、肾上腺腺瘤、垂体腺瘤、甲状 旁腺腺瘤、膜腺腺瘤、唾液腺腺瘤、肝细胞化epatocellular)腺瘤、胃肠腺瘤、管状腺瘤 (tubular adenoma)、和胆管腺瘤。
[0048] 本发明的特征还有如下的方法，其包括对受试者施用有效量的变体IgG W预防该 受试者中良性、癌前、或非转移性癌症的发生或复发。在本发明的某些实施方案中，受试者 处于癌症、息肉、或癌症综合征的风险。在一个例子中，受试者具有癌症、息肉、或遗传性癌 症综合征的家族史。在本发明的某些方面，受试者处于形成良性、癌前、或非转移性肿瘤的 风险。在某些实施方案中，该方法预防从未具有肿瘤的受试者、从未具有临床可检测癌症的 受试者、或只具有良性肿瘤的受试者中所述良性、癌前或非转移性癌症的发生或复发。
[0049] 另一方面，提供了在受试者中预防癌症复发或降低癌症复发可能性的方法，其包 括对该受试者施用变体IgG,其时间和量足W在该受试者中预防癌症复发或降低癌症复发 可能性。本发明包括一种在具有肿瘤的受试者中预防癌症复发的方法，其包括除去该肿瘤 (例如使用确定性手术（definitive surge巧)）及然后对该受试者施用变体IgG的步骤。本 发明包括在受试者中预防肿瘤再生长的方法，其包括除去该肿瘤（例如使用确定性手术） 及然后对该受试者施用变体IgG的步骤。在一个相关方面，本发明包括一种在受试者中预 防癌症复发或在受试者中降低癌症复发可能性的方法，其任选包括对该受试者在手术前施 用有效量的变体IgG,施用确定性手术，及在手术后施用有效量的变体IgG,其中所述在手 术后施用变体IgG预防癌症复发或降低癌症复发可能性。在另一个相关方面，本发明包括 一种在受试者中预防癌症复发或在受试者中降低癌症复发可能性的方法，其包括在任何别 的抗癌治疗剂缺失下对该受试者施用有效量的变体IgG,其中所述施用在受试者预防癌症 复发或在受试者中降低癌症复发可能性。
[0050] 对于每一个上述方面，肿瘤可W是任何类型的肿瘤，包括但不限于实体瘤，特别是 肿瘤和腺瘤，本文所述的。受试者可具有休眠肿瘤或微转移，其可W是或不是临床可检测 的。在此方面的一个实施方案中，施用所述变体IgG,其时间和量足W降低休眠肿瘤或微转 移的新血管形成。在另一个实施方案中，施用所述变体IgG,其时间和量足W预防临床可检 测肿瘤或其转移的发生，或延长受试者的存活持续时间。
[0051] 在一个实施方案中，变体IgG是单一疗法。在另一个实施方案中，受试者先前经历 过对肿瘤的处理，例如使用抗癌疗法。在一个例子中，抗癌疗法是手术。在另一个实施方案 中，受试者可在施用变体IgG之前、期间（例如同时）、或之后进一步用别的抗癌疗法处理。 抗癌疗法的例子包括但不限于手术、放射疗法（放疗）、生物疗法、免疫疗法、化疗、或该些 疗法的组合。
[0052] 在受试者经历过确定性手术的实施方案中，变体IgG -般在受试者自手术恢复一 段时间之后施用。此时间段可包括伤口愈合或手术切口愈合所需要的时段、降低伤口开裂 的风险所需要的时间段、或受试者回到与手术前的健康水平相比本质上相似或更好的健康 水平所需要的时间段。确定性手术完成和第一次施用变体IgG之间的时段还可包括药物假 期所需要的时段，其中受试者在各治疗方案间需要或要求一段时间。一般地，确定性手术完 成和变体IgG疗法开始之间的时间段可包括小于1周、1周、2周、3周、4周（28天）、5周、6 周、7周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、 2年、3年、或更长。在一个实施方案中，确定性手术和施用变体IgG之间的时段大于2周且 小于1年。在一个实施方案中，确定性手术和施用变体IgG之间的时段大于4周（28天）。
[0053] 在某些实施方案中，每一个上述方面可进一步包括对受试者监测癌症复发。
[0054] 本发明还提供了手术切除受试者例如人患者中可手术癌症之前新辅助疗法的方 法，包括对患者施用有效量的变体IgG,其中该患者已经诊断有肿瘤或癌症。变体IgG可W 单独地或与至少一种化疗剂组合地施用。
[00巧]本发明还包括一种治疗有可手术癌症的受试者的方法，其包括在手术之前对该受 试者施用有效量的变体IgG,然后实施手术，由此切除癌症。在一个实施方案中，该方法进一 步包括在手术之后对该受试者施用有效量的变体IgG W预防癌症复发。
[0056] 在另一个方面，本发明关注一种新辅助疗法的方法，包括在确定性手术之前对有 可手术癌症的受试者施用有效量的变体IgG和至少一种化疗剂。
[0057] 在另一个方面，本发明包括一种在具有不可切除肿瘤的受试者中缩小肿瘤尺寸的 方法，包括对该受试者施用有效量的变体IgG，其中该施用缩小肿瘤尺寸，由此容许完全切 除肿瘤。在一个实施方案中，该方法进一步包括在完全切除肿瘤之后对该受试者施用有效 量的变体IgG。
[0058] 在另一个方面，本发明关注一种在受试者中治疗癌症的方法，包括下述步骤；a) 包含多个处理周期的第一阶段，其中每个周期包含W预定间隔对受试者施用有效量的变体 IgG和至少一种化疗剂；b)确定性手术，由此除去癌症；和C)包含多个维持周期的第二阶 段，其中每个周期包含W预定间隔在没有任何化疗剂的情况下对受试者施用有效量的变体 IgG。在一个实施方案中，第一阶段包含第一多个处理周期（first plurality of treatment cycle),其中施用变体IgG和第一化疗方案，接着是第二多个处理周期（second plurality of treatment cycle),其中施用变体IgG和第二化疗方案。
[0059] 本发明提供了方法，包括在确定性手术后对有转移性或非转移性癌症的受试者施 用有效量的变体IgG。在某些实施方案中，该方法进一步包括使用至少一种化疗剂。
[0060] 在一个方面，该方法包括下述步骤；a)包含多个处理周期的第一阶段，其中每个 周期包括W预定间隔对受试者施用有效量的变体IgG和至少一种化疗剂；和b)包含多个维 持周期的第二阶段，其中每个周期包括W预定间隔在没有任何化疗剂的情况下对受试者施 用有效量的变体IgG。在一个实施方案中，第一阶段包括第一多个处理周期，其中施用变体 IgG和第一化疗方案，接着是第二多个处理周期，其中施用变体IgG和第二化疗方案。
[0061] 在某些实施方案中，变体IgG是结合VEGF或降低VEGF表达或生物学活性的抗 VEGF抗体。抗VEGF抗体或其抗原结合片段可W是单克隆抗体、嵌合抗体、完全人的抗体、 或人源化抗体。在某些实施方案中，在本发明的方法中有用的例示性抗体包括贝伐单抗 (AVASTIN?)、G6-31、B2〇-4. l、B2〇-4. 1. 1、及其片段。
[0062] 在某些实施方案中，变体IgG是人源化抗肥R2单克隆抗体HERCEPTIN⑩。在 某些实施方案中，变体IgG是嵌合抗CD20抗体Ri化xan饭、抗[班抗体X0LA1民饭、抗 CD20抗体、抗CDlla抗体Raptiva吸、抗化r2抗体Omni化巧饭、抗oxLDL抗体、抗CD4抗 体MTRX1011A、抗HCV抗体、抗比-17A/F抗体、抗A-目抗体、抗DR6抗体、抗人巨细胞病毒 (HCMV)抗体、抗肥R受体家族抗体、抗组织因子抗体、MLN-02抗体、人源化抗CD 18F(油'）2 抗体、或人源化抗I班IgGl抗体rhuMab-E25。在某些实施方案中，变体IgG是双特异性抗 体，其中祀抗原是IL-4和IL-13。在某些实施方案中，变体IgG是祀向金黄色葡萄球菌表位 的抗体。
[0063] 虽然可W在施用变体IgG之前、期间、或之后W多种不同方式处理受试者，但是在 某些实施方案中，在没有手术或化疗的情况下处理受试者。在其它实施方案中，用变体IgG 进行的处理是单一疗法或对于变体IgG治疗期间的时间段是单一疗法，如临床医生所评估 的或本文所述的。
[0064] 在其它实施方案中，用变体IgG进行的处理与别的抗癌疗法组合，包括但不限于 手术、放射疗法、化疗、区别疗法（differentiating therapy)、生物疗法、免疫疗法、血管发 生抑制剂、和抗增殖化合物。用变体IgG进行的治疗还可包括上述类型的治疗方案的任何 组合。在某些实施方案中，细胞毒剂、抗血管发生剂和抗增殖剂可W与变体IgG组合使用。 在一个实施方案中，抗癌疗法是化疗。在某些实施方案中，所述化疗剂和变体IgG并行施 用。
[0065] 在某些实施方案中，本发明的方法在治疗和预防早期肿瘤，由此预防进展成更晚 期，导致与晚期癌症有关的发病率和死亡率降低中是有利的。本发明的方法在预防肿瘤复 发或肿瘤再生长，例如切除原发性肿瘤后持续存在的休眠肿瘤中，或者在降低或预防微转 移的发生或增殖中也是有利的。
[0066] 对于本发明的方法，所述癌症可W是实体瘤，例如诸如乳腺癌、结肠直肠癌、直肠 癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤（例如间变性（anaplastic)星形细胞瘤、间变性少突星形细胞 瘤（oligoastrocytoma)、间变性少突神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤）、肾癌、前列腺癌、 肝癌、膜腺癌、软组织肉瘤、类癌、头颈癌、黑素瘤、和卵巢癌。
[0067] 本发明的方法还可包括对受试者监测癌症或肿瘤复发。
[0068] 根据详述、附图、和权利要求，本发明的其它特征和优点会是显而易见的。
[0069] 本文所述任何实施方案或任何其组合适用于本文所述发明的任何和所有变体IgG 和方法。
[0070] 附图简述
[ocm] 图1小图A-B ;在抑6. 0抗VEGF野生型（WT)和抗VEGF变体对人化化的结合。 实施了两次分开的实验，其中在芯片上偶联不同水平的化化。对于每次实验运行，将稳态响 应单位作为变体浓度的函数绘图W评估解离常数。
[007引 图2 ;在抑6. 0抗VEGF野生型（WT)和抗VEGF变体对人化化的解离常数。Kd是 自图1所示两次不同实验运行评估的。
[007引 图3 ;在抑7. 4抗VEGF野生型（WT)和抗VEGF变体对人化化的结合。将稳态响 应单位作为抗VEGF变体浓度的函数作图。
[0074] 图4小图A-D ;抗VEGF野生型和抗VEGF变体对（A)人化化在抑6. 0,炬）人化化 在抑7. 4,似縣猴化化在抑6. 0及做縣猴化化在抑7. 4的结合。
[00巧]图5 ;在抑6. 0和25C各种抗VEGF变体对人化化的动力学参数和单价解离常数 og。结果代表H次独立实验。
[0076] 图6 ;在抑6. 0和25C多种抗VEGF变体对縣猴化化的动力学参数和单价解离常 数（Kd)。结果代表H次独立实验。
[0077] 图7小图A-B ;在不同抑(A)人化化和炬）縣猴化化对不同抗VEGF变体的解离 速率化。ff)。
[0078] 图8 ;抗VEGF变体相对于抗VEGF野生型的人化化亲和力改善的汇总。数据是自 图4和5汇总的。
[0079] 图 9 小图 A-B ; (1)抗 VEGF 野生型及抗 VEGF 变体（2) M34H、（3) T307Q/M34A、（4) T307Q/M34S、（5)T307Q/E380A/M34S 和化)V308P/M34A 的 VEGF 结合。（A)抗体的 VEGF 结合是通过在37°C在经VEGF-A109包被的传感器芯片上注射抗VEGF野生型和抗VEGF变 体，使用BIAcore⑩3000测定的。炬)50nM和lOOnM注射的传感图。使每个传感器基线偏 移4RU W得到更好的视图。
[0080] 图10 : AVASTIN?、抗VEGF野生型（贝伐单抗）和抗VEGF变体的体外HUVEC增 殖抑制。人厮带血管内皮细胞（HUVEC)在存在VEGF和多种浓度的抗VEGF抗体下培养。评 估培养4天后的存活力。
[0081] 图11 ;IV单剂5mg/kg后，抗VEGF野生型和五种抗VEGF变体在縣猴中的药动学概 况。抗体的血清浓度是通过化ISA测量的。数据表述为均值+标准偏差（n = 12只动物 /组，例外是V308P/N434A组有11只动物）。
[0082] 图12 ; IV单剂5mg/kg后，抗VEGF野生型和五种抗VEGF变体在縣猴中的药动学参 数。
[0083] 图13 ;该图显示了抗VEGF野生型和五种抗VEGF变体在縣猴中的终末半衰期与抑 6. 0化化亲和力之间的相关性。误差棒代表每组11或12只动物的标准偏差。
[0084] 图14小图A-B ;IV单剂0. 3或5mg/kg后，抗VEGF野生型和抗VEGF变体T307Q/ M34A在人源化VEGF转基因小鼠中的药动学概况。抗体的血清浓度是使用（A) VEGF捕捉 ELISA或炬）人化捕捉化ISA测量的。数据表述为均值+标准偏差。
[0085] 图15 ;IV单剂0. 3或5mg/kg后，抗VEGF野生型和抗VEGF变体T307Q/M34A在人 源化VEGF转基因小鼠中的药动学参数。
[0086] 图16小图A-B ;多剂0. 3或5mg/kg后，抗VEGF变体T307Q/M34A在人源化VEGF 转基因小鼠中的药动学概况。抗体在第0, 3,6和9天施用。抗体的血清浓度是使用（A) VEGF 捕捉化ISA或炬）人化捕捉化ISA测量的。数据表述为均值+标准偏差。
[0087] 图 17;在第 0,3,6 和 9 天 IV 四剂 0. 3 或 5mg/kg 后，T307Q/M34A 在人源化 VEGF 转基因小鼠中的药动学参数。
[0088] 图18小图A-C ;抗VEGF野生型和T307Q/M34A (QA)变体在治疗HM-7异种移植物 S. C.植入RAG2 K0;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的功效。5mg/kg和0. 5mg/kg野生型和 T307Q/M34A变体和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。（A)HM-7肿瘤的生长曲线。 数据表述为均值+标准误差。炬)0.5和0.05mg/kg处理组的HM-7肿瘤生长曲线。（C)处 理结束时的血清抗VEGF抗体浓度（抗豚草的第18天和抗VEGF处理组的第21天）。浓度 是使用VEGF捕捉化ISA测量的。数据表述为均值+标准偏差。
[0089] 图19小图A-E ;抗VEGF野生型和T307Q/M34A (QA)变体在治疗HM-7异种移植物 S. C.植入RAG2 K0;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的一项重复功效研究。5,0. 5和0. 05mg/ kg野生型和T307Q/M34A变体和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。（A) HM-7肿瘤 的生长曲线。数据表述为均值+标准误差。炬)0.5和0.05mg/kg处理组的HM-7肿瘤生长 曲线。数据表述为均值+标准误差。（C)处理结束时测定的HM-7肿瘤终末重量（抗豚草 的第16天，0. 05mg/kg组的第19天，和其余组的第22天）。数据表述为均值+标准误差。 值）处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用人化捕捉化ISA测量的。数据表述 为均值+标准偏差。巧）肿瘤中相对于血液中抗体浓度之比。肿瘤抗体浓度是通过测量肿 瘤溶胞物总量和肿瘤溶胞物中的抗VEGF抗体量而确定的。数据表述为均值+标准偏差。
[0090] 图20小图A-D ;抗VEGF野生型和T307Q/M34A (QA)变体在治疗HM-7异种移植物 S. C.植入RAG2K0;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的第H项功效研究。5,0. 5和0. 05mg/ kg野生型和T307Q/M34A和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。（A)处理结束时每 个组的均值肿瘤体积（第22天）。数据表述为均值+标准误差。炬)HM-7肿瘤的终末重 量。数据表述为均值+标准误差。（C)处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用 抗人化捕捉化ISA测量的。数据表述为均值+标准偏差。值）肿瘤中相对于血液中抗体 浓度之比。肿瘤抗体浓度是通过测量肿瘤溶胞物总量和肿瘤溶胞物中的抗VEGF抗体量而 确定的。数据表述为均值+标准偏差。
[0091] 图21小图A-D ;抗VEGF野生型和T307Q/M34A(QA)变体在治疗HT-55异种移植物 S. C.植入RAG2K0 ;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的功效。5,0. 5和0. 05mg/kg野生型和 T307Q/M34A和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。（A)HT-55肿瘤的生长曲线。数 据表述为均值+标准误差。炬）处理结束时测定的HT-55肿瘤终末重量（第35天）。数 据表述为均值+标准误差。（C)处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用人化捕 捉化ISA测量的。数据表述为均值+标准偏差。值）肿瘤中相对于血液中抗体浓度之比。 肿瘤抗体浓度是通过测量肿瘤溶胞物总量和肿瘤溶胞物中的抗VEGF抗体量而确定的。数 据表述为均值+标准偏差。
[0092] 图22小图A-E ;抗VEGF野生型和T307Q/M34A(QA)变体在治疗Colo-205异种移 植物S. C.植入RAG2K0 ;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的功效。5,0. 5和0. 05mg/kg野生 型和T307Q/M34A和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。（A) Colo-205肿瘤的生长曲 线。数据表述为均值+标准误差。炬)〇. 5和0. 05mg/kg处理组的Colo-205肿瘤生长曲 线。（C)处理结束时测定的Colo-205肿瘤终末重量（第38天）。数据表述为均值+标准 误差。值）处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用人化捕捉化ISA测量的。数 据表述为均值+标准偏差。巧）肿瘤中相对于血液中抗体浓度之比。肿瘤抗体浓度是通过 测量肿瘤溶胞物总量和肿瘤溶胞物中的抗VEGF抗体量而确定的。数据表述为均值+标准 偏差。
[0093] 图23小图A-D ;抗VEGF野生型和T307Q/M34A(QA)变体在治疗Colo-205异种移 植物中的一项重复功效研究。5,0. 5和0. 05mg/kg野生型和T307Q/M34A和5mg/kg抗豚草 对照每周两次腹膜内施用。（A)C〇1〇-205肿瘤的生长曲线。数据表述为均值+标准误差。 炬)0. 5和0. 05mg/kg处理组的Colo-205肿瘤生长曲线。（C)处理结束时测定的Colo-205 肿瘤终末重量（第32天）。数据表述为均值+标准误差。值）处理结束时的血清抗VEGF 抗体浓度。浓度是使用人化捕捉化ISA测量的。数据表述为均值+标准偏差。
[0094] 图24 ;在抑6. 0和25。使用BIAcore，抗肥R2(曲妥单抗）IgGl化变体对人 化化的单价解离常数og。结果代表两次独立实验。
[0095] 图25 ;化化在不同人肿瘤细胞系中的表达水平。每种细胞系的5xl06个细胞用于 实验。Raji细胞（人B细胞淋己瘤）用作阴性对照，而可溶性人化化蛋白（其缺失7kDa 跨膜和胞质区）作为阳性对照印迹。可溶性化化蛋白的稀释液用作标准来定量化化表达 水平。本文所示结果代表至少H次独立实验。
[009引图26 ;抗肥R2 (曲妥单抗）IgGl化变体对人化化的抑依赖性结合。变体是W 1251、1314、和E430处的突变构建的。结合是在6至7. 2范围的抑使用BIAcore在25C 测量的。确定变体相对于抗肥R2 IgGl野生型的亲和力之比，并作为地的函数绘图。
[0097]图 27 小图 A-C;在（A)pH 6.0,炬)pH 7.1，和似pH 7.4,抗肥R2(曲妥单抗）IgGl 野生型、变体 T307Q/M34A、变体 L251D/T307Q/M34H 和变体 L251D/T307Q/M428L/M34H/ Y436I对人化化的结合。结合是使用BIAcore在25C测量的。在图27C中在抑7. 4检测 不到变体L251D/T307Q/M34H对人化化的结合。
[009引图28 ;在不同抑，人化化对多种抗VEGF和抗肥R2变体的解离速率化。ff)。抗 VEGF 变体为 T307Q/M34A、T307Q/M：MS、T307Q/E380A/M34S 和 V308P/M34A。抗肥R2 变 体为L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I。为每种变体将在不同地的kcff值对地进行拟合， W产生最佳拟合线的斜率（方程：l0g化。ff)二斜率X P化厂截距）。
[0099] 发明详述
[0100] 本发明涉及Fc域（包括那些在抗体、Fc離合物、和免疫粘附素中找到的）的新变 体，其具有延长的体内半衰期。这些变体包含人IgG Fc区或其结合FcRn的片段，其相对于 野生型人IgG Fc区含有一处或多处氨基酸修饰，该修饰提高IgG Fc区或其片段对FcRn的 亲和力。
[0101] 本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通 常利用常规方法得W采用，诸如例如广泛应用的方法，记载于Sambrook et al.，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory 化ess, Cold Spring Harbor, N.Y. ;CUR赃NT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M.Ausubel'et al.eds?，口003)) ;the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press， Inc. ) :PCR 2 :A PRACTICAL APPROA細（M. J. MacPherson，B. D. Hames and G. R. T'aylor eds. (1995))， Harlow and Lane, eds. (1988)ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CEILL CULTU赃巧? I. Freshney，ed. (1987)) ;01igonucleotide Synthesis(M. J.Gait，ed.，1984) ;Methods in Molecular Biology，Humana Press ；Cell Biology ：A Laboratory Notebook (J. E. Cellis，ed.，1998) Academic Press ;Animal Cell Culture(民. I.Freshney), ed. , 1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts，1998)Plenum Press ;Cell and Tissue Culture laboratory Procedures(A. Doyle, J.B.Griffkhs，and D.G.Newell，eds. ,1993-8) J. Wiley and Sons ;Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir and C. C. Blackwell，eds.) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos，eds.，1987) ;PC民：The Polymerase Chain Reaction， (Mullis et al.，eds.，1994) ;Current Protocols in Immunology(J. E.Coligan et al.，eds.，1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons，1999) ；Immunobiology(C. A. Janeway and P.TraVers，1997) ;Antibodies (P. Finch， 1997) ;Antibodies:A Practical Approach (D. Catty.，ed.，IRL 化ess,1988-1989); Monoclonal Antibodies ：A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean，eds.，Oxford University Press，2000) ；Using Antibodies ：A Laboratory Manual(E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999) ;The Antibodies(M. Zanetti and J. D. Capra，eds.，Harwood Academic Publishers，1995) ；Cancer ：Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al.，eds.，J. B. Lippincott Company，1993)。
[0102] 除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术 人员通常理解相同的含义。W下文献为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语 白勺--蔚曼性丰旨导：8;[11咨16如11 et al. ,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 化d ed.，J.Wiley&Sons (New York, N.Y. 1994)及 March, Advanced Organic Qiemistry 民eactions，Mechanisms and Structure 4th ed.，John Wiley&Sons (New York，N. Y. 1992)。 通过述及而完整收录本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。
[0103] 定义
[0104] 为了解释本说明书的目的，应用W下定义，而且在任何适宜的时候，W单数使用的 术语也会包括复数，反之亦然。应当理解本文中所使用的术语只是为了描述具体实施方案， 并非意图限制。在下文所列任何定义与通过述及而收入本文的任何文件抵触的情况中，应 当W下文所列定义为准。
[0105] 贯穿本说明书和权利要求书，免疫球蛋白重链中的残基编号方式是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (199]_)(通过述及明确收入本 文）中的抓索引的编号方式。"如Kabat中的抓索引"指人IgGi抓抗体的残基编号方式。
[0106] 如本文中使用的，术语"体内半衰期"或"抗体体内半衰期"指特定类型IgG分子 或其含有FcRn结合位点的片段在给定动物的循环中的生物学半衰期，而且表述为分子的 循环浓度降低50%所需要的时间。在某些实施方案中，当给定IgG的浓度作为时间的函数 绘图时，所述曲线通常是两阶段的，有快速的a期（其代表血管内空间和血管外空间之间 所注射IgG分子的平衡）和更长的目期（其代表自血管内空间清除IgG分子）。在某些实 施方案中，术语"体内半衰期"对应于IgG分子在目期中的半衰期。在某些实施方案中，给 定IgG的浓度对时间曲线是H阶段的，相应分配成a期和目期，及终末清除（W Y期表 示）。因此，在某些实施方案中，体内半衰期对应于终末清除期或Y期的半衰期。在某些实 施方案中，给定IgG的浓度对时间曲线是单阶段的，有单个清除期。因此，在某些实施方案 中，体内半衰期对应于单一清除期的半衰期。
[0107] 如本文中使用的，"亲本多肤"或"野生型多肤"意指未修饰多肤、天然存在多肤、或 天然存在多肤的经改造经修饰形式（其与本文公开的变体IgG相比缺少一处或多处本文公 开的化区氨基酸修饰且在效应器功能方面不同）。亲本多肤可包含天然序列化区或具有 现有氨基酸序列修饰（诸如添加、删除和/或替代）的化区。亲本多肤还可包含下文所述 非天然氨基酸。亲本多肤可W指多肤自身、包含该亲本多肤的组合物、或编码它的氨基酸序 列。亲本多肤包括但不限于亲本免疫球蛋白、野生型免疫球蛋白、亲本抗体和野生型抗体。
[0108] 因而，如本文中使用的，"亲本免疫球蛋白"、"亲本IgG"、"野生型免疫球蛋白"或 "野生型IgG"意指未修饰免疫球蛋白、天然存在免疫球蛋白、或天然存在免疫球蛋白的经改 造经修饰形式（其与本文公开的变体IgG相比缺少一处或多处本文公开的化区氨基酸修 饰且在效应器功能方面不同）。亲本免疫球蛋白可包含天然序列Fc区或具有现有氨基酸序 列修饰（诸如添加、删除和/或替代）的化区。亲本免疫球蛋白还可包含下文所述非天然 氨基酸。亲本免疫球蛋白可W指免疫球蛋白自身、包含亲本免疫球蛋白的组合物、或编码它 的氨基酸序列。
[0109] 如本文中使用的，"亲本抗体"或"野生型抗体"意指未修饰抗体、天然存在抗体、 或天然存在抗体的经改造经修饰形式（其与本文公开的变体IgG相比缺少一处或多处本文 公开的化区氨基酸修饰且在效应器功能方面不同）。亲本抗体可包含天然序列化区或具 有现有氨基酸序列修饰（诸如添加、删除和/或替代）的化区。亲本抗体还可包含下文所 述非天然氨基酸。亲本抗体可W指抗体自身、包含亲本抗体的组合物、或编码它的氨基酸序 列。
[0110] 在某些实施方案中，"亲本IgG"、"亲本抗体"、"野生型IgG"、或"野生型抗体"包括 但不限于已知的商业性的、重组生产的本文所述抗体。在某些实施方案中，野生型IgG是具 有野生型人IgG化区的IgG。在某些实施方案中，野生型人IgG化区指缺少一处或多处本 文公开的化区氨基酸修饰的化区。在某些实施方案中，野生型人IgG化区指具有一处或 多处本文未公开的化区氨基酸修饰的化区。在某些实施方案中，野生型IgG是贝伐单抗。 在某些实施方案中，野生型抗体是不含化区的抗体片段。在某些实施方案中，此类野生型 抗体的变体IgG是化融合蛋白，其包含野生型抗体的Fab域片段或非抗体蛋白的一个或多 个域，及包含一处或多处本文公开的化区修饰的化域片段。在某些实施方案中，野生型人 IgG化区指具有化突变L251D或L251D/434H但没有其它本文中公开的化区氨基酸修饰 的IgG化区。
[0111] 如本文中使用的，"变体"、"变异蛋白质"或"蛋白质变体"意指由于至少一处氨基 酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可W指蛋白质自身、包含蛋白质的组合 物、或编码它的氨基酸序列。在某些实施方案中，蛋白质变体与亲本多肤相比具有至少一处 氨基酸修饰，例如约1处至约10处氨基酸修饰。在某些实施方案中，蛋白质变体在IgG化 区中具有至少2处氨基酸修饰。在某些实施方案中，蛋白质变体在IgG化区中具有至少3 处氨基酸修饰。本文中的蛋白质变体序列会与亲本蛋白质序列优选拥有至少约80%同一 性，和最优选至少约90 %同一性，更优选至少约95 %同一性。蛋白质变体还可包含下文定 义的非天然氨基酸。术语"蛋白质变体"包括本文所述免疫球蛋白变体和抗体变体。
[0112] 如本文中使用的，术语"免疫球蛋白变体"、"变异免疫球蛋白"、"变体IgG"或"IgG 变体"意指由于至少一处氨基酸修饰而与亲本或野生型免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白 序列。在某些实施方案中，变体IgG相对于野生型IgG在化区中具有至少2处氨基酸修饰。 在某些实施方案中，变体IgG相对于野生型IgG在化区中具有至少3处氨基酸修饰。在某 些实施方案中，变体IgG是变异抗体。在某些实施方案中，变体IgG是抗VEGF抗体。在一 个实施方案中，变体IgG是在抗体的化区中包含一处或多处氨基酸修饰的贝伐单抗变体。
[0113] 如本文中使用的，"抗体变体"或"变异抗体"意指由于至少一处氨基酸修饰而与亲 本抗体不同的抗体。在某些实施方案中，变异抗体相对于野生型抗体在Fc区中具有一处或 多处氨基酸修饰。
[0114] 如本文中使用的，"位置"意指蛋白质的序列中的定位。位置可W连续地，或依照已 确立的形式（例如K油at中的抓索引）来编号。
[0115] 术语"含化区的多肤"或"化多肤"指包含整个或部分化区的多肤。例如，化多 肤包括抗体、化融合物、分离的化、和化片段。
[0116] "含化区的抗体"指包含化区的抗体。化区的C-末端赖氨酸（依照抓编号系 统的残基447)可W消除，例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编码抗体的核酸。因 此，包含具有化区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或具 有与没有K447残基的抗体的混合物。
[0117] "氨基酸修饰"指预定氨基酸序列的氨基酸序列中的改变。例示性修饰包括氨基酸 替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，氨基酸修饰是替代。
[0118] 指定位置（例如化区的）处的"氨基酸修饰"指指定残基的替代或删除，或指定 残基附近至少一个氨基酸残基的插入。指定残基"附近"的插入意味着其一个至两个残基 内的插入。插入可W在指定残基的N端或C端。
[0119] "氨基酸替代"指用另一种不同的"替换"氨基酸残基替换在预定氨基酸序列中的 至少一个现有氨基酸残基。一个或多个替换残基可W是"天然存在氨基酸残基"（即由遗 传密码所编码的），并且选自下组；丙氨酸（Ala);精氨酸（Arg);天冬醜胺（Asn);天冬氨酸 (Asp);半脫氨酸（切S);谷氨醜胺佑In);谷氨酸佑lu);甘氨酸佑ly);组氨酸化is);异亮 氨酸（lie);亮氨酸（Leu);赖氨酸（Lys);甲硫氨酸（Met);苯丙氨酸（Phe);脯氨酸（Pro); 丝氨酸（Ser);苏氨酸订虹）；色氨酸（Trp);酪氨酸（Tyr);和额氨酸（Val)。在某些实施方 案中，替换残基不是半脫氨酸。本文中氨基酸替代的定义还涵盖用一种或多种非天然存在 氨基酸残基进行的替代。
[0120] "非天然存在氨基酸残基"指能够与多肤链中的相邻氨基酸残基共价结合的、在上 文所列的那些天然存在氨基酸残基W外的残基。非天然存在氨基酸残基的例子包括正亮 氨酸、鸟氨酸、正额氨酸、高丝氨酸及其它氨基酸残基类似物，诸如那些记载于下列文献的， Ellman et al.Meth.Enzym. 202:301-336(1991);美国专利No. 6, 586, 207 ;W0 98/48032; WO 03/073238 ;美国公开 No. 2004-0214988A1 ;W0 05135727A2 ;W0 05/74524A2 ;J. W. Chin et al.，（2002) Journal of the American Qiemical Society 124:9026-9027 ;J.化 Qiin, & F*.G. Schultz, (2002)，QiemBioQiem 11 ;1135-1137 ;J.W.Qiin，et al.，（2002)，PICAS United States of America 99:11020-11024,都通过述及而完整收录。
[0121] "氨基酸插入"指将至少一个氨基酸惨入预定氨基酸序列。虽然插入通常会由一个 或两个氨基酸残基的插入组成，但是本申请涵盖更大的"肤插入"，例如约3个至约5个或甚 至多达约10个氨基酸残基的插入。所插入的残基可W是上文所公开的天然存在的或非天 然存在的。
[0122] "氨基酸删除"指从预定氨基酸序列除去至少一个氨基酸残基。
[0123] 在某些实施方案中，术语"延长"、"延长的半衰期"或"延长的体内半衰期"指根据 标准本领域已知方法诸如本文所述那些的检测，与野生型IgG或具有野生型人IgG化区的 IgG相比，本发明的变体IgG的体内半衰期总体延长至少约25%，30%，40%，50%，60%， 70% ,75% ,80% ,85% ,90% ,95% ,100% ,150% ,200% ,300%或更多。在某些实施方案中， 术语延长指变体IgG的延长的体内半衰期，其中与野生型IgG或具有野生型人IgG化区的 IgG相比，延长至少约1. 25X，1. 5X，1. 75X，2X，3X，4X，5X或10X或更多。在某些实施方案中， 野生型IgG或具有野生型人IgG化区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中，贝伐单抗的 均值半衰期是约10至12天（如在縣猴中测量的）或约20天（如在人类中测量的）。
[0124] "较链区"通常定义为自人IgGl的Glu216至Pro230的区段炬urton，Molec. Immunol. 22 ;161-206(1985))。其它IgG同种型的较链区可W通过将第一个和最后一个形 成重链间S-S键的半脫氨酸残基置于相同位置而与IgGl序列对比。
[01巧]化区的"较低位置处较链区（lower hinge region)"通常定义为紧挨着较链区 C-末端的一段残基，即化区的残基233-239。在本发明之前，化Y R结合一般归功于IgG 化区的较低位置处较链区中氨基酸残基。
[0126] "Clq"指包含供免疫球蛋白化区结合的位点的多肤。Clq与两种丝氨酸蛋白酶即 Clr和Cls -起形成复合物C1，即补体依赖性细胞毒性（CDC)途径的第一组分。人Clq可 购自例如如idel，San Diego,化lif。
[0127] 术语"结合结构域"指多肤中能结合另一分子的区域。在化R的情况中，结合结构 域可W包含其多肤链（例如其a链）中负责化区结合的部分。一种有用的结合结构域是 FcRa链的胞外结构域。
[012引本文中术语"抗体"W最广义使用，明确覆盖单克隆抗体（包括全长单克隆抗体）、 多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）、及抗体片段，只要它们展现出期望的生 物学活性。
[0129] "分离的"抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然 环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和 其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至（1)根据例如 Lowry法的测定，抗体重量超过95%，而在有些实施方案中，重量超过99%，（2)足W通过使 用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或（3)根据 还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体 天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分 离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
[0130] "天然抗体"指通常由两条相同的轻（L)链和两条相同的重做链构成的约 150, 000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的 数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二 硫键。每条重链在一端具有一个可变域（Vh)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一 个可变域（VJ，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而 轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之 间形成界面。
[0131] 术语"恒定域"指免疫球蛋白分子中的如下部分，其相对于免疫球蛋白的其它部 分，即含有抗原结合位点的可变域，具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重链的Ch1、Ch2 和Ch3域及轻链的CHL域。
[0132] 抗体的"可变区"或"可变域"指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变 域可W称为"VH"。轻链的可变域可W称为"VL"。该些结构域一般是抗体的最易变部分且 包含抗原结合位点。
[0133] 术语"可变的"指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗 体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。 它集中于轻链和重链可变域中称作高变区（HVR)的H个区段。可变域中更加高度保守的部 分称作框架区（FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取目-折 叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成目-折叠片结构一部分的H个HVR连接。 每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR -起促成抗体的 抗原结合位点的形成（参见 K油at et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，^tional Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直 接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞 毒性中的参与。
[0134] 根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的"轻 链"可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕（K)和拉姆达（A)。
[0135] 如本文中使用的，术语IgG "同种型"或"亚类"意指由其恒定区的化学和抗原特 征定义的任何免疫球蛋白亚类。
[0136] 根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）可归入不同的类。免疫球蛋 白有五大类；134、1曲、1班、136和131，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如1361、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作a、 5、e、Y和y。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和H维构造是众所周知的，一般性描述于 例如 Abbas et al.，Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co. ,2000)。 抗体可W是抗体与一种或多种其它蛋白质或肤共价或非共价连接而形成的更大融合分子 的一部分。
[0137] 如本文中使用的，术语"IgG亚类修饰"意指将一种IgG同种型的一个氨基酸转变 成一种不同的、比对的IgG同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为在抓位置296 处IgGi包含酪氨酸而IgGs包含苯丙氨酸，所W IgGs中的巧96Y替代被认为是IgG亚类修 饰。
[013引如本文中使用的，"非天然存在修饰"意指非同种型的氨基酸修饰。例如，因为无一 1径6在位置332处包含谷氨酸，所^1肖61、1肖62、1肖63、或1肖64中位置332处用谷氨酸进行的 替代（332巧被认为是非天然存在修饰。
[0139] 术语"全长抗体"和"完整抗体"在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体。 该术语具体指重链包含化区的抗体。
[0140] "裸抗体（裸露的抗体）"为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的 抗体。
[0141] "抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。在某些实施方案中， 抗体片段包含化区或部分化区，其包含一处或多处本文中公开的化区修饰。抗体片段的 例子包括F油、F油'、F(油'）2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片 段形成的多特异性抗体。
[0142] 用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，各自具有 一个抗原结合位点，及一个剩余的"Fc"片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶 处理产生一个F (油'）2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
[0143] "Fv"是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类 由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv) 种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可W通过柔性肤接头共价相连接，使得轻链和 重链可W在与双链Fv种类类似的"二聚体"结构中相结合。正是在该种构造中，每个可变 域的H个HVR相互作用而在Vh-Vl二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR -起 赋予抗体W抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或是只包含对抗原特异性的H个 HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
[0144] F油片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域 (CH1KF油'片段与F油片段的不同之处在于重链CH1结构域的駿基末端增加了少数残基， 包括来自抗体较链区的一个或多个半脫氨酸。Fab' -SH是本文中对其中恒定域半脫氨酸 残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有 较链半脫氨酸的成对F油'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
[0145] "单链Fv"或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh和Vl结构域，其中该些结构域存 在于一条多肤链上。一般而言，scFv多肤在Vh与Vi结构域之间进一步包含多肤接头， 其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plilckthun，于 《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 编， Springer-Verlag, New 化rk, 1994,第 269-315 页。
[0146] 术语"双抗体"指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肤链 (Vh-VJ中包含相连的重链可变域（Vh)和轻链可变域（Vi)。通过使用过短的接头使得同一 条链上的两个结构域之间不能配对，迫使该些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而 产生两个抗原结合位点。双抗体可W是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例 如EP 404,097 ;W0 1993/01161 ;Hudson et al.，化t.Med.9 ;129-134(2003);及Hollinger et al.，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)。H抗体（Tri油ody)和四抗体 (tetr油ody)也记载于 Hudson et al.，化1:. Med. 9 ;129-1；M(2003)。
[0147] 术语"单克隆抗体"在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成 群体的各个抗体相同，除了可能W极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此， 修饰语"单克隆"表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克 隆抗体典型的包括包含结合祀物的多肤序列的抗体，其中祀物结合多肤序列是通过包括从 众多多肤序列中选择单一祀物结合多肤序列在内的过程得到的。例如，选择过程可W是从 众多克隆诸如杂交瘤克隆、瞻菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解， 所选择的祀物结合序列可进一步改变，例如为了提高对祀物的亲和力、将祀物结合序列人 源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而 且包含改变后的祀物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决 定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体 针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未 受到其它免疫球蛋白的污染。
[0148] 修饰语"单克隆"表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求 通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来 生成，包括例如杂交瘤法（例如 Kohler and Milstein,化1:脚6,256;495-97(1975) ;Hongo et al.'Hybridoma,14(3) ;253-260 (1995)，Harlow et al.，Antibodies ;A L油oratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 片反 1988)曲mmerling et al.， 于：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y. , 1981)) > 重组DNA法（参见例如美国专利No. 4, 816, 567)、瞻菌体展示技术（参见例如Clackson et al.，化1:脚6 352 ;624-628 (1991) ;Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 ;581-597 (1992); Sidhu et al.，J. Mol. Biol. 338(2) ;299-310 (2004) ;Lee et al.，J. Mol. Biol. 340 巧）； 1073-1093(2004) ;Fellouse，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 101(34) ;12467-12472(2004); Lee et al.，J. Immunol. Methods 284 (1-2) ;119-132 (2004))、及用于在具有部分或整 个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体 的技术（参见例如 W0 1998/24893 ;W0 1996/34096 ;W0 1996/33735 ;W0 1991/10741 ; Jakobovits et al.，Proc.P'Jatl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) ;Jakobovits et al.， 化1:脚6 362:255-258(1993) ;I3;ruggemann et al.，化ar in Immuno. 7:33(1993);美国专 利 No. 5, 545, 807 ;5, 545, 806 ;5, 569, 825 成 625, 126 ;5, 633, 425 ;和 5, 661，016 ;Marks et al.'Bio/Technology 10:779-783(1992) ;Lonberg et 31.，化1:山"6 368:856-859(1994); Morrison, Nature 368 ：812-813(1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnol. 14 ： 845-851 (1996) ;Neuberger，Nature Biotechnol. 14:826(1996) ;Lonbe;rg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 ;65-93 (1995))。
[0149] 单克隆抗体在本文中明确包括"嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍 生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部 分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，W及 此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性（参见例如美国专利No. 4, 816, 567 ; Morrison et al.，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括"灵长 类化"抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫縣猴而生成的抗体。
[0150] 非人（例如鼠）抗体的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序 列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的HVR残 基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、家兔、或 非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基 用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残 基。可W进行该些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、 通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的 高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至 少部分免疫球蛋白恒定区（Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如化nes et 31.,化1:脚6 321:522-525(1986) ;I?iechmann et 31.,化1:脚6 332:323-329(1988);和 Presta，Qi;r;r. Op. Struct. Biol. 2 ;593_596 (1992)。还可参见例如 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma&Immunol.1 ： 105-115 (1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038(1995) ;Hurle and Gross, Qirr.Op.Biotech. 5:428-433(1994);及美国专 利 No. 6, 982, 321 和 7, 087, 409。
[0151] "人抗体"指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用 本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的该种定义明确排除包含非 人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括瞻菌体 展示文库化oogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 ;381 (1991) ;Marks et al.，J. Mol. Biol. 222:581 (1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是W下文献中记载的方法；Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss,p. 77 (1985) ；Boemer et al.，J. Immunol. 147(1) ;86_95(1991)。还可参见 van Dijk and van de Winkel'Qirr. 化in. Pharmacol.，5 ;368-74 (2001)。可通过给已经修饰W应答抗原性刺激而生成人抗体但 其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠（xenomice)施用抗原来制 备人抗体（参见例如6, 075, 181和6, 150, 584,关于XEN0M0USE?技术）。还可参见例如Li et al.，Proc.化tl. Acad. Sci. USA, 103 ;3557-3562 (2006)，关于经人 B-细胞杂交瘤技术生 成的人抗体。
[0152] "物种依赖性抗体"指对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力强于对来自 第二哺乳动物物种的该抗原同系物的亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体"特异性结合" 人抗原（即结合亲和力化d)数值不超过大约1x1(T7m，优选不超过大约1x1(T8m，且最优选不 超过大约1x1(T9m)，但是对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力比对 人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍、或至少大约500倍、或至少大约1000倍。物种依赖 性抗体可w是上文所定义的各种类型抗体中的任一种，但是优选人源化抗体或人抗体。
[0153] 术语"高变区"、"HVR"或"HV"在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/ 或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR;H个在VH中化1、肥、册），H个 在化中（L1、12、L3)。在天然抗体中，册和L3展示该六个HVR的最大多样性，而且认为 特别是H3在赋予抗体W精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.，Immunity 13: 37-45(2000) Johnson and Wu,于；Methods in Molecular Biology 248; 1-25 (Lo, ed.， Human Press, Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏 轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-化sterman et al.化化re 363:446-448， (1993) ;Sheriff et al.化1:脚6 Struct. Biol. 3 ;733-736，（1996)。
[0154] 本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。K油at互补决定区（CDR)是W序列变异性 为基础的，而且是最常用的化油at et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Qiothia 改为指结构环的位置（Qiothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 : 901-917 (1987))。AbM HVR代表K油at HVR与化othia结构环之间的折衷，而且得到化化rd Molecular的AbM抗体建模软件的使用。"接触"HVR是W对可获得的复合物晶体结构的分 析为基础的。下文记录了该些HVR中每一个的残基。
[0155]
【权利要求】
1. 一种变体IgG，其包含如下的人IgG Fc区，相对于野生型人IgG Fc区包含依照Kabat 中的EU索引编号的氨基酸残基251、252、307、308、378、428、430、434、和436中两处或更多 处的两个或更多个氨基酸替代，其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG Fc区的IgG 的半衰期相比延长的半衰期，且其中至少两处所述氨基酸替代是氨基酸残基251、252、307、 308、378、428、430、434、或436处的，而且氨基酸残基251处的氨基酸替代是用天冬氨酸或 谷氨酸摘要）进行的替代，氨基酸残基252处的氨基酸替代是用酪氨酸进行的替代，氨基酸 残基307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代，氨基酸残基308处的氨基酸替代是用 脯氨酸进行的替代，氨基酸残基378处的氨基酸替代是用缬氨酸进行的替代，氨基酸残基 428处的氨基酸替代是用亮氨酸进行的替代，氨基酸残基430处的氨基酸替代是用丙氨酸 或赖氨酸进行的替代，氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸、丝氨酸或酪氨酸进行 的替代，而氨基酸残基436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。
2. 权利要求1的变体IgG，其包含氨基酸308处用脯氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸 434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。
3. -种变体IgG，其包含如下的人IgG Fc区，相对于野生型人IgG Fc区包含依照Kabat 中的EU索引编号的氨基酸残基251、252、307、308、378、380、428、430、434、和436中三处或 更多处的三个或更多个氨基酸替代，其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG Fc区的 IgG的半衰期相比延长的半衰期，且其中至少三处所述氨基酸替代是氨基酸残基251、252、 307、308、378、380、428、430、434、或436处的，而且氨基酸残基251处的氨基酸替代是用天 冬氨酸或谷氨酸进行的替代，氨基酸残基252处的氨基酸替代是用酪氨酸进行的替代，氨 基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代，氨基酸残基308处的氨基酸替代 是用脯氨酸进行的替代，氨基酸残基378处的氨基酸替代是用缬氨酸进行的替代，氨基酸 残基380处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代，氨基酸残基428处的氨基酸替代是用亮 氨酸进行的替代，氨基酸残基430处的氨基酸替代是用丙氨酸或赖氨酸进行的替代，氨基 酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸进行的替代，而氨基酸残 基436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。
4. 权利要求1或3的变体IgG，其具有比具有野生型人IgG Fc区的IgG更高的对FcRn 的结合亲和力。
5. 权利要求1或3的变体IgG，其在pH 6. 0具有比在pH 7. 4更高的对FcRn的结合亲 和力。
6. 权利要求1或3的变体IgG，其具有相等的或比具有野生型人IgG Fc区的IgG更高 的功效。
7. 权利要求6的变体IgG，其具有比具有野生型人IgG Fc区的IgG更高的功效。
8. 权利要求1或3的变体IgG，其是人的或人源化的IgG。
9. 权利要求8的变体IgG，其是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。
10. 权利要求1或3的变体IgG，其中所述IgG Fc区是IgGl Fc区。
11. 权利要求1或3的变体IgG，其中所述变体IgG是抗VEGF抗体。
12. 权利要求1或3的变体IgG，其包含重链可变域（SEQ ID NO :1)和轻链可变域（SEQ ID NO ：2) 〇
13. -种药物组合物，其包含权利要求1或3的变体IgG和药学可接受载体。
14. 一种试剂盒，其包含容器中的权利要求1或3的变体IgG和使用说明。
15. -种变体IgGl，其包含如下的人IgGl Fc区，相对于野生型人IgGl Fc区包含依照 Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基308和434处的氨基酸替代，其中所述变体IgGl具有 与具有野生型人IgGl Fc区的IgGl的半衰期相比延长的半衰期，且其中氨基酸残基308处 的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代，而氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸进行 的替代。
16. -种治疗受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利 要求1或3的变体IgG。
17. -种抑制受试者中的VEGF活性的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的 权利要求1或3的变体IgG。
18. 权利要求17的方法，其中所述VEGF活性是血管发生。
19. 一种调控受试者中的血管通透性的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量 的权利要求1或3的变体IgG。
20. -种抑制或预防受试者中的癌细胞生长的方法，所述方法包括对所述受试者施用 有效量的权利要求1或3的变体IgG。
21. 权利要求16、17、19或20的方法，其中每4周或每4周以上时间对所述受试者施用 所述变体IgG。
【文档编号】A61K39/395GK104447990SQ201410562388
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2009年10月13日 优先权日:2008年10月14日
【发明者】莉萨.A.达米科, 纳波里奥尼.弗莱拉, 亨利.B.劳曼, 玉茹.G.孟, 伊克.A.耶昂 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司