重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法，属于生物工程技术。其是将重组人干扰素-α-2b-BCG菌种接种到含卡那霉素30微升/毫升的Middlebrook7H9液体培养基中，获得一级种子液；再在上述培养基中转接获得浓度标准OD600的A值＞2的二级种子液；使用生物反应发生器进行大规模深层发酵培养，发酵罐原位连接切向流中空过滤柱，对发酵液离散洗涤菌体，再加入等体积的含有20％蔗糖、1~2％明胶、2％氯化钾、1~4％谷氨酸钠的混合液进行保护液置换；并经慢速预冷降温，真空冷冻干燥成干粉剂。这样获得的重组人干扰素-α-2b-BCG菌苗活性率高，降低了生产过程中污染的可能性。
【专利说明】重组人干扰素 -a -2b-BCG的干粉剂制备方法
[0001]
【技术领域】 本发明涉及生物工程技术，具体是一种重组人干扰素- a -2b-BCG的干粉剂制备方法。
[0002]
【背景技术】 重组人干扰素- a -2b-BCG (hIFN-α -2b-BCG)是目前用于膀胱肿瘤免疫灌注治疗的生 物制剂。
[0003] 以往卡介苗的冻干制备都是采用苏通马铃薯静置培养，菌膜挤压去水，钢瓶研磨 后冻干的方法，首先进行种子活化：启开工作种子批菌种，在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃 薯培养基或液体苏通培养基上静置培养2~3周，培养传代活化。然后，进行生产培养：可在 苏通马铃薯培养基上再传一代或直接挑取生长良好的菌膜，接种于苏通综合培养基或经批 准的其他培养基的表面，在培养瓶中，37?39°C恒温、静置培养疒14天。生产用培养基为苏 通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通综合培养基。倒入三角瓶内加蒸馏水，加热 使全部溶解；纱布或G3砂芯漏斗过滤后用纯氢氧化铵NH 4OH矫正PH至7. 2?7. 4 ;用三角瓶 进行分装，经15磅121 °C，3(Γ40分钟灭菌备用（马铃薯培养基需要将土豆切块，去离子蒸馏 水中煮沸2(Γ30分钟，静置冷却后脱脂棉纱布过滤，其余按照以上操作进行）培养结束后逐 瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃。收集菌膜压干后，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢 珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨，加入适 量无致敏原保护液稀释成一定浓度的原液。最后冷冻干燥：以明胶、蔗糖或谷氨酸钠作为冻 干保护剂/赋形剂，进行真空冷冻干燥。对产品进行质量检测。
[0004] 上述冻干粉剂制备虽然操作成本低廉，但是操作复杂，生长缓慢，活菌率低，容易 产生污染，过程可控性差。
[0005] 由于重组干扰素 -a-2b_BCG在膀胱肿瘤免疫灌注治疗中，用量大，活性要求高， 因此，需要更高效、可控，自动化程度高，活菌率高的大批量生产方法。
[0006]
【发明内容】
本发明就是为了解决现有技术中，重组干扰素-a-2b_BCG冻干粉剂生产过程操作 复杂，生长缓慢，活菌率低，容易产生污染，过程可控性差等问题，而提供一种重组人干扰 素 -a -2b_BCG的干粉剂制备方法。
[0007] 本发明是按照以下技术方案实现的。
[0008] -种重组人干扰素 -a -2b_BCG的干粉剂制备方法，其实按以下步骤制备的： a.种子活化和培养基制备 采选重组干扰素 -a -2b_BCG菌种并接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜配制的 Middlebrook 7H9液体培养基中获得一级活化种子液；将一级活化种子液重新接种至上述 培养基中，获得浓度达标准〇D_的A值>2的二级种子液； 其中的Middlebrook 7H9液体培养基是按以下重量份的原料制成的，Middlebrook 7H9 5份、甘油5份、Tween80 5份，加入900份蒸馈水121°C高压蒸汽灭菌15分钟制成A 液；另将葡萄糖2份、牛血清白蛋白5份、NaCl 0. 8份加入100份蒸馏水，0. 22 μ m滤膜过滤 除菌后制成B液，将A液、B液混合制得； b. 生物反应器深层培养 发酵罐中最终装料容积比6~7:10的发酵培养基高压灭菌后，将二级种子液接种到发 酵罐中，深层发酵培养7~10天，发酵期间取样检测生长情况并涂玻片抗酸染色检测无污 染，检测OD6c?值达2. O以上，收集发酵液； 其中每升发酵培养基按以下重量份数比的原料制备的：7H9 5份、甘油5份、TweenSO 5 份、葡萄糖2份，蒸馏水溶解；培养基配置后调节PH至7. (Γ7. 5,高压蒸汽原位灭菌； c. 离散洗涤和保护液置换 发酵罐原位连接切向流中空过滤柱I. 5PD600,用3倍体积以上的0. 9%氯化钠溶液进 行发酵液置换洗涤，再用6倍以上的1 %谷氨酸钠无菌液进行置换洗涤，继续菌液富集培养 4飞倍，最后加入相同体积的混合液，得到BCG终含量约为4*108CFU/mL的冻干保护剂； 其中的混合液含有20%蔗糖、1~2%明胶、2%氯化钾、广4%谷氨酸钠； d. 真空冷冻干燥 每个西林瓶中分装上述冻干保护剂1毫升，在真空冷冻干燥机中，慢速预冷降温，负压 充氮压塞制成冻干粉末。
[0009] 这样设计的本发明具有的优点是： ① 扩增生长高效，菌体离散度好，制备效率高，单次生产量大，菌苗活性率高，适合大规 模工业化生产； ② 生产过程易检测； ③ 制备过程条件参数可控，容易优化和放大，更好地做到不同批次产物各种指标的一 致性； ④ 发酵培养和洗涤富集是在全封闭自动化系统中进行，极大减少了污染的机会； ⑤ 直接富集散在菌体进行冻干制备，避免了研磨等容易造成的污染和细菌物理损耗。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是本发明中发酵产物的离散洗涤和保护液置换步骤的生产流程示意图。
[0011] 图中：1.阀门 2.洗涤置换液容器 3.第一蠕动泵 4.发酵罐 5.第二蠕动泵 6.过滤柱 7.废液阀门 8.第三蠕动泵 9.废液容器 10.产品阀门 11.收获容器。
[0012]
【具体实施方式】 下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
[0013] 一 ·主要材料及设备 I. Middlebrook (米德尔布鲁克）7H9培养基系在售商品 附表I Middlebrook 7H9培养基成分
【权利要求】
1. 一种重组人干扰素-a -2b-BCG的干粉剂制备方法，其是按以下步骤制备的： a. 种子活化和培养基制备 采选重组干扰素-a -2b_BCG菌种并接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜配制的 Middlebrook 7H9液体培养基中获得一级活化种子液；将一级活化种子液重新接种至上述 培养基中，获得浓度达标准〇D_的A值>2的二级种子液； 其中的Middlebrook 7H9液体培养基是按以下重量份的原料制成的，Middlebrook 7H9 5份、甘油5份、Tween80 5份，加入900份蒸馈水121°C高压蒸汽灭菌15分钟制成A 液；另将葡萄糖2份、牛血清白蛋白5份、NaCl 0. 8份加入100份蒸馏水，0. 22 ii m滤膜过滤 除菌后制成B液，将A液、B液混合制得； b. 生物反应器深层培养 发酵罐中最终装料容积比6~7:10的发酵培养基高压灭菌后，将二级种子液接种到发 酵罐中，深层发酵培养7~10天，发酵期间取样检测生长情况并涂玻片抗酸染色检测无污 染，检测OD6tltl值达2. 0以上，收集发酵液； 其中每升发酵培养基按以下重量份数比的原料制备的：Middlebrook 7H9 5份、甘油5 份、TWeen80 5份、葡萄糖2份，蒸馏水溶解；培养基配置后调节PH至7. (T7. 5,高压蒸汽原 位灭菌； c. 离散洗涤和保护液置换 发酵罐原位连接切向流中空过滤柱I. 5PD600,用3倍体积以上的0. 9%氯化钠溶液进 行发酵液置换洗涤，再用6倍以上的1 %谷氨酸钠无菌液进行置换洗涤，继续菌液富集培养 4飞倍，最后加入相同体积的混合液，得到BCG终含量约为4*108CFU/mL的冻干保护剂； 其中的混合液含有20%蔗糖、1~2%明胶、2%氯化钾、广4%谷氨酸钠； d. 真空冷冻干燥 每个西林瓶中分装上述冻干保护剂1毫升，在真空冷冻干燥机中，慢速预冷降温，负压 充氮压塞制成冻干粉末。
2. 根据权利要求1所述重组人干扰素_ a -2b_BCG的干粉剂制备方法，其特征在于：菌种采选后接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜配制的Middlebrook 7H9液体培养基 250mL中，恒温35?38°C、转速10(T200rpm、饱和湿度下，于2000mL烧瓶中震摇培养疒10天 获得一级活化种子液。
3. 根据权利要求1所述重组人干扰素_ a -2b_BCG的干粉剂制备方法，其特征在于：生 物反应器深层培养时，培养温度设定为35~38°C，接入过滤空气，通气速度0. 5 SLPM，转速 15(T250rpm稳定2h后，确定溶氧度DO-I值为100%，PH稳定至7. (T7. 5 ;二级种子新鲜培养 液无菌加入发酵罐时，设定的发酵参数：接入过滤空气通气的起始速度〇. 5 SLPM，起始转速 150rpm，根据溶氧度80?90%关联调节通气保持0? 5?2. 0 SLPM和转速150?400 rpm，温度维 持35?39°C，培养基采用Middlebrook 7H9溶液，消泡剂采用植物豆油。
4. 根据权利要求1所述重组人干扰素_ a -2b_BCG的干粉剂制备方法，其特征在于：所 述慢速预冷降温是从室温开始下降，在2. 5~3. 5h到达设定预冷-35~-45°C温度后维持1~2 小时，第一阶段升华干燥温度-KT-20°C，维持12~16小时，升华干燥真空度为0. 3毫巴，第 二阶段解析干燥保持温度25~30°C，时间设定为4~6小时。
【文档编号】A61P35/00GK104324365SQ201410574032
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】孙二琳, 丁娜, 王丽宁, 韩瑞发 申请人:孙二琳, 韩瑞发, 天津市泌尿外科研究所