鸡新型新城疫疫苗病毒毒株rClone30-chIL15及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡新型新城疫病毒毒株及其应用。本发明提供的鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-chIL15和辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染哺乳动物细胞BHK-21并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL15为具有序列表的序列1所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5ˊ末端第2703-18546位核苷酸即为rClone30-chIL15病毒的基因组DNA。本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂chIL15，可以有效提高免疫效果，提高免疫保护率。本发明对于新城疫病的防治具有重大意义。
【专利说明】鸡新型新城疫疫苗病毒毒株rC I 〇ne30-Ch I LI 5及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鸡新型新城疫病毒毒株rClone30-chIL15及其应用。
【背景技术】
[0002] 新城疫病（Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV)引起的禽类高度接触性和急性败血性的烈性传染病，对世界养禽业危害极为严重。NDV 病毒作为单股负链的RNA病毒其宿主范围很广，其中以鸡的易感性最高且幼鸡的发病率和 死亡率明显高于大龄鸡，一年四季均可以发生，但主要以春季发病较多。仅过去三年新城疫 就发病1252起，涉及19个省、市、自治区，发病家禽近四十万羽，死亡二十万羽，捕杀十五余 万羽。
[0003] 目前我国则一直采用以疫苗接种为主、捕杀隔离消毒为辅的措施来控制新城疫的 发生。弱毒疫苗能够诱导体液免疫和粘膜免疫，在国内外得到普遍的应用。但此类疫苗常 常需要在首次接种后7天才有抗体产生直至免疫后两周抗体滴度才达到保护水平，从免疫 到具有保护力需2周以上的时间，如果新城疫一旦爆发在疫苗接种的这段免疫空白期，鸡 群将无法得到有效的免疫保护。可见，在控制新城疫发病与流行中，从首免到具有完全保护 自身的抗体水平所需时间越短越好；那么，速效疫苗的研制就显得尤为重要与迫切。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供鸡新城疫病毒毒株rClone30_chIL15及其应用。本发明提供 的鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将所需的重组质粒pBrClone30-chIL15 和辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染哺乳动物细胞后进行培养，获得所述鸡新城疫病 毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL15为具有序列表的序列3所示的DNA分子的质粒。 序列表的序列3自5'末端第2703-18546位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30- chIL15 病毒的基因组DNA。
[0005] 所述重组质粒pBrClone3〇-chIL15具体可为序列表的序列3所示的质粒。
[0006] 所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
[0007] rClone30-chIL15病毒的制备方法具体如下： (1) 把所述重组质粒pBrClone3〇-chIL15、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染 BHK-21 细胞（每 IXlO6个细胞转染 Iyg重组质粒 pBrClone30- chIL15、0. 5yg pBL-N 质 粒、0· 25 μ g pBL-P质粒和0· I μ g pBL-L质粒)，放置于5% C02、37°C静置培养72h ; (2) 将上述步骤（1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心获得细胞上清液，然后接种 于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C培养72h，收集鸡胚尿囊液(其中含有rClone30-chIL15 病毒）； (3) 将步骤（2)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，37°C培养 72h，收集鸡胚尿囊液； (4) 将步骤（3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，37°C培养 72h，收集鸡胚尿囊液； (5)将步骤（2)、步骤（3)和步骤（4)得到的鸡胚尿囊液进行混合，得到的混合液，即为 rClone3〇- chIL15 病毒液。
[0008] 本发明还保护一种鸡新城疫病毒毒株(命名为rCl〇ne30-chIL15病毒)，其基因组 DNA如序列表的序列3自5 z末端第2703-18546位核苷酸所示。
[0009] 本发明还保护以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株及其应用。
[0010] 本发明还保护一种鸡新城疫病疫苗，包括以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株。
[0011] 本发明提供一种新的鸡新城疫病毒毒株，命名为rCl〇ne30-chIL15,简称毒株 rClone30-chIL15。毒株rClone30-chIL15是将chIL15多肽的编码基因利用两个限制性内 切酶插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30 (简称毒株Clone30,弱毒株，为现有的新城疫病活 疫苗)的基因组的F基因和HN基因之间得到的重组病毒株。毒株rClone30-chIL15免疫鸡 群后，可以使鸡快速产生抗体，使免疫空白期从2周缩短到1周，弥补了现有新城疫活疫苗 产生抗体时间过长的缺点，而且能增强细胞免疫，让鸡获得全面的免疫。
[0012] 本发明涉及的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制备为任 何常规制剂，如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。
[0013] 本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组基础上在F和HN之间引入分子佐剂 chIL15,可以有效提高免疫效果，有效缩短免疫空白期，使鸡群提早产生保护性抗体，提高 免疫保护率。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为重组质粒pBrClone30-chIL15的元件示意图。
[0015] 图2为混合液的HA效价和HI效价结果。
[0016] 图3为PCR鉴定电泳图。
[0017] 图4为实施例2的结果。
[0018] 图5为实施例3的结果。
[0019] 图6-图8为实施例4的结果。
[0020] 图9为实施例5的结果。
【具体实施方式】
[0021] 以下涉及实施例有利于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的 实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均 为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值。
[0022] 提及 "pBrClone30 质粒"的文献'Enhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase", Zheng LV，Asian Pac J Cancer Ptev. 〇
[0023] 提及 "pBL-N 质粒"、"pBL-P 质粒"和 "pBL-L 质粒"的文献：Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drug candidate for cancer immunotherapy, Fuliang Baij Immunology letters·。
[0024] pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和 L基因，其中F基因和HN基因之间具有Sac II和MluI酶切识别位点。将pBrClone30质粒、 pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养（pBL-N质粒、pBL-P质粒 和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组），得到毒株Clone30。
[0025] 提及"NDV强毒BJ株"的文献："鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定及其遗传变异分 析"，校海霞，河北农业大学硕士学位论文。
[0026] BHK-21 细胞：ATCC 编号为 CRL-13001。
[0027] DF-I 细胞：ATCC 编号为 CRL-12203。
[0028] SPF级白色来航鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
[0029] ChIL15多肽的全称为鸡白细胞介素15,如序列表的序列2所示，其编码基因的开 放阅读框如序列表的序列1自5 y末端第15至578位核苷酸所示。
[0030] 完全DMEM培养基即为含有5%胎牛血清的DMEM培养基。
[0031] 鸡血红细胞凝集（HA)试验的具体方法如下：（1)在血凝板第一排的1-12孔各加入 50 μ L生理盐水；（2)在第1孔中加入50 μ L待测病毒液，混匀后吸50 μ L到第2孔，如此倍 比稀释直到第10孔，第10孔混匀后弃除50 μ L ; (3)在1-12孔中各加入50 μ L 1%鸡血红 细胞；（4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。
[0032] 鸡血红细胞凝集抑制（HI)试验的具体方法如下：（1)在血凝板的1-12孔各加 入25 μ L生理盐水；（2)第1孔加入待检血清25 μ L，混匀后吸25 μ L至第2孔，倍比稀释 直至第10孔，第10孔混匀后弃除25 μ L ; (3)在1-12孔中各加入25 μ L实施例1制备的 rClone30病毒液（4个血凝单位)，室温静置30min ; (4)在1-12孔中各加入25 μ L 1%鸡血 红细胞；（5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。
[0033] 实施例1、rClone30_chIL15病毒液的制备 一、重组质粒的构建 1、 合成序列表的序列1所不的双链DNA分子。
[0034] 合成序列表的序列1中，自5 Z末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶Sac II的 识别序列，第9-14位核苷酸为Kozac序列，第15至578位核苷酸为chIL15多肽的编码基 因，第579至584位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列； 2、 用限制性内切酶Sac II和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物； 3、 用限制性内切酶Sac II和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收载体骨架片段，大小约 16000bp ； 4、 将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒PBrClone30-chIL15。 重组质粒 PBrCl〇ne30-ChIL15的核苷酸序列如序列表的序列3所示(序列表的序列3 中，自5 z末端第位2703-18546核苷酸为rClone30-chIL15病毒的基因组)。重组质粒 pBrClone30_chIL15的兀件不意图见图1。
[0035] 二、重组病毒的制备 1、 将重组质粒pBrClone3〇-chIL15、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染 8服-21细胞（每1父10 6个细胞约转染1以8重组质粒？81'(：1〇1^30-(*几15、0.5以8?81^，质 粒、0· 25 μ g pBL-P 质粒和 0· 1 μ g pBL-L 质粒），置于 5% C02、37°C静置培养 72h ; 2、 将步骤1得到的转染细胞，反复冻融3次，离心获得细胞上清液，接种于9-11日龄 SPF鸡胚，37 °C培养72h，收集鸡胚尿囊液； 3、 将步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37°C培养72h，收集鸡 胚尿囊液； 4、 将步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37°C培养72h，收集鸡 胚尿囊液； 5、 将步骤2、步骤3和步骤4得到的鸡胚尿囊液进行混合，得到的混合液即为所制备的 病毒(该混合液的HA效价为2048, HI效价为2048,见图2); 6、 将步骤5得到的混合液，提取总RNA并反转录为cDNA，采用Fl和Rl组成的引物PC R(F15 ' -CCGCGGACGCCACCATGCTGGGGAT-3 ' ;R15 ' -ACGCGTTTAGTTAGCGTATTTTTTG-3 ')，结 果见图3。PCR扩增片段大小约为560bp，与预期相符。
[0036] 结果表明，成功制备了具有感染性的表达chIL15多肽的NDV病毒，将步骤5得到 的混合液命名为rCl〇ne30-chIL15病毒液。
[0037] 三、对照病毒的制备 用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30_chIL15进行步骤二的1至5,得到的混 合液命名为rClone30病毒液。
[0038] 实施例2、检测病毒液中chIL15的表达量 1、 将对数生长期的DF-I细胞接种于六孔板，以0. IMOI的剂量感染实施例1制备的 rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释)，37°C静置孵 育lh，完全DMEM培养基洗涤三遍，加入含1 μ g/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基并置于5% C02、37°C静置培养48h，然后反复冻融3次，离心收取上清液； 2、 用实施例1制备的rClone30病毒液代替rCl〇ne30-chIL15病毒液，其它同步骤1 ; 3、 采用chIL15试剂盒（Antibodies online ,ABIN414131),并按说明书进行操作，检 测步骤1得到的上清液和步骤2得到的上清液中的chIL15的浓度； 结果见图4。结果表明，rClone30_chIL15病毒能够稳定表达chIL15,而rClone30病 毒不表达chIL15。
[0039] 实施例3、rClone30-chIL15病毒与rClone30病毒在宿主细胞中的动力生长曲线 1、 将对数生长期的DF-I细胞接种于六孔板，以0. IMOI的剂量将实施例1制备的 rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀稀释）接种于细 胞单层，采用含1 μ g/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基，置于5% C02、37°C静置培养96h，每 隔24h取上清液并测定TCID5tl ; 2、 实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL15病毒液，其它同步骤1。
[0040] 结果见图5。rClone30_chIL15病毒与rClone30病毒繁殖滴度保持一致。结果表 明，空载体rClone30在插入外源的chIL15基因之后增殖能力并没有因此而改变。
[0041] 实施例4、rCl〇ne30-chIL15病毒缩短免疫空白期情况及佐剂疫苗对细胞免疫的 增强作用 按照农业部标准，青年鸡的抗体效价> 51og2时判为合格。
[0042] 取45日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组15只。分别处理如下(均为 单次免疫）： 第一组：每只实验鸡以点眼滴鼻的方式免疫200μ L实施例1所得重组病毒 rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病 毒液的浓度为IO5TCID5tlA). Iml); 第二组：每只鸡同样以点眼滴鼻的方式进行免疫，（rCl〇ne30病毒液用完全DMEM培养 基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为IO5TCID5ciA). Iml); 第三组：每只鸡以点眼滴鼻的方式免疫0. 9%的生理盐水200 μ L ; 分别于免疫后2d、4d、6d、8d羽静脉采血分离血清，进行HI抗体效价检测结果见图6,同 时分离相应天数的血液中的淋巴细胞，用FITC标记的鼠抗鸡的⑶4+抗体（Abeam，ab24896) 和⑶8+抗体（Abeam，ab24899)经流式细胞仪检测淋巴细胞中⑶4 +、⑶8+T占淋巴细胞的百 分比，结果见图7、图8。
[0043] 如图6所示，第一组即rClone30- chIL15免疫组在免疫后两天抗体开始上升至第 6天达到保护性水平，在免疫后6天时rClone30在3. 6 log2左右，无法形成有效保护，抵抗 强毒的攻击。结果如图7、8所示。在免疫后第二天重组l〇ne30-chIL15实验组的鸡⑶4 +、 ⑶8+T细胞含量都开始增加，且至第八天时一直高于对照组rClone30,可见重组rClone30-chIL15能在快速产生保护性抗体的同时刺激机体细胞免疫，使鸡的免疫力增强。
[0044] 实施例5、rClone30_chIL15病毒或rClone30病毒免疫鸡后的HI抗体效价 参照农业部标准，青年鸡的抗体效价>51og2时判为合格。特别是在30日龄前后抗体 水平低于此标准，如果在此期间有强毒侵入，就有可能暴发新城疫。如果鸡群能在此期间达 到此标准，将不受新城疫病毒的威胁。
[0045] 取30日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下(均为 单次免疫）： 第一组：每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μ?实施例1制备的rCl〇ne30-chIL15 病毒液（rCl〇ne30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为 IO5TCID50A). Iml); 第二组：每只通过滴鼻点眼的方式免疫200 μ L实施例1制备的rCl〇ne30病毒液 (rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为IO5TCID5tlA). Iml); 第三组：每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L 0. 9%生理盐水。
[0046] 分别于免疫后7d、14 d、21d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。
[0047] 结果见图9。免疫后7d，第一组血清的HI效价高于51og2,第二组的效价低于 31og2,即rCl 〇ne30-ChIL15病毒液将可以实现早期保护效果，使鸡免受新城疫病毒的威 胁，而rClone30病毒液将无法在免疫7d后实现有效保护鸡免受新城疫病毒的威胁。
[0048] 实施例6、攻毒试验 将30日龄SPF级白色来航鸡随机分为3组，每组30只。分别处理如下(均为单次免 疫）： 第一组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L实施例1制备的 rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病 毒液的浓度为IO 5TCID5tlA). Iml) 第二组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L实施例1制备的rCl〇ne30 病毒液（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为 IO5TCID50A). Iml); 第三组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200 μ L 0. 9%生理盐水。
[0049] 实验第8天，采用NDV强毒BJ株进行攻毒(每只鸡采用IO4 ELD5tl的剂量经肌肉注 射途径攻毒，攻毒体积为0. lml)，实验第18天，统计各组的发病与死亡情况。结果见表1。
[0050] 表1各组的发病与死亡情况统计(三次试验的平均值）
【权利要求】
1. 一种新型新城疫疫苗毒株，其具体制备方法如下：将重组质粒pBrClone30-chIL15、 pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒 活疫苗毒株。
2. 权利要求1所述的鸡新城疫病毒活疫苗株，其特征在于：所述重组质粒 pBrClone3〇-chIL15为序列表的序列3所示的质粒。
3. 正如权利1或2所述的鸡新城疫病毒活疫苗株，其特征在于：所述的哺乳动物细胞 为BHK-21细胞。
4. 鸡新城疫病毒活疫苗株，其基因组DNA如序列表的序列3自5'末端第2703-18546 位核苷酸所示。
5. 权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒活疫苗株在制备新城疫病疫苗中的应 用。
6. -种鸡新城疫病疫苗，包括权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒活疫苗株。
【文档编号】A61K39/17GK104404004SQ201410619497
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】何金娇, 李德山, 张天援, 王卉, 刘云野 申请人:东北农业大学