一种富血小板血浆的制备方法

一种富血小板血浆的制备方法
【专利摘要】本发明属于血液制品【技术领域】，具体涉及一种富血小板血浆的制备方法。该方法包括血液采集、淋巴细胞分离液处理、第一次离心、第二次离心等步骤。本发明在现有的PRP制备技术基础上，首先通过采用淋巴细胞分离液对采集的血液进行处理，然后通过优化离心力和离心时间，所制备PRP的血小板浓缩效果得到了进一步的提升，而红细胞数量大幅度降低，具有较好的实际应用价值。
【专利说明】一种富血小板血浆的制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于血液制品【技术领域】，具体涉及一种富血小板血浆的制备方法。

【背景技术】
[0002] 富血小板血楽，也简称为PRP(Platelet_rich plasma),是指通过采集自身的静脉 血液，经过离心浓缩血小板、白细胞等制作流程所制作的富含高浓度生长因子的自体血浆。 关于PRP应用目前较为热门的是有关PRP美容方面的应用，以PRP为基础制作的注射液通 过真皮浅层注射方法注射到皮肤中，PRP中的多种自体生长因子可深入整个皮肤组织，调整 皮肤全层结构，修复老化、受损的皮肤组织，从而达到改善皮肤质地、收紧及提升面部皮肤、 减轻皱纹凹陷性疤痕、恢复皮肤年轻状态、延缓皮肤衰老的目的。
[0003] 现有技术中，制备PRP大致有两种方法：一种方法是采用常规的两步离心法，进行 浓缩血小板制备富集血小板的血浆。具体操作方法是：将全血以313Xg离心4分钟，巴氏 吸管吸取上部血浆及靠近界面约Imm的红细胞转移至另一离心管中，再以1252Xg离心6 分钟，巴氏吸管吸取上部大部分血浆，剩余所需要血浆及血细胞成分，静止30分钟后振摇 离心管，即得PRP。此种方法，因为吸取的有一定量的红细胞，因此，制备的PRP中含有一定 量的红细胞。
[0004] 另一种方法是采用PRP分离管，通过一步离心，取下层血浆，即可制备富集血小板 的血浆PRP。此种方法，因为采用的是一步离心法，由于离心的转速和时间的限制，容易导致 的问题有：①血小板不能被充分离心，收集的PRP中血小板的浓缩倍数有限，具体而言，目 前销售的PRP分离管浓缩血小板的浓度约为4倍左右；②血浆中仍然残留有一定量的红细 胞，因而制备的PRP中也含有一定量的红细胞。
[0005] 综上，现有技术中有关PRP制备的主要技术缺陷在于：一是血小板的浓缩倍数有 限；二是制备的PRP中含有一定数量的红细胞，影响应用效果，例如，如果以含有一定数量 红细胞为基础的PRP制备的注射液用于皮肤美容，在使用初期会造成注射部位皮肤的红 肿、暗紫、影响美观，因而急需进一步的改进。


【发明内容】

[0006] 本发明目的在于提供一种富血小板血浆的制备方法，相较于现有技术着重从提高 血小板的浓缩效果和降低红细胞的含量两个方面进行了改进。
[0007] 本发明所采取的技术方案如下。
[0008] -种富血小板血浆制备方法，包括以下步骤： (1) 以预装抗凝剂的采血管，无菌操作下采集血液； (2) 将步骤（1)所采集的血液，分装到含有淋巴细胞分离液的离心管中；优选配比为， 以体积配比计，淋巴细胞分离液：血液=1 : 2 ; (3) 对步骤（2)的全血进行第一次离心，18(T250X g离心8?10分钟；优选为：220X g 离心8分钟； (4) 吸取步骤（3)离心后上层绝大部分大约4/5的血浆于另一新的离心管中； (5) 对步骤（4)所吸取的上层血浆进行二次离心，80(T13(K)X g离心6?8分钟；优选 为：1000 X g离心6分钟； (6) 弃去步骤（5)离心后上层血浆，保留所需血浆用量，静置约20min后振摇离心管，使 管底沉淀重悬于剩余的血浆中，即为富血小板血浆。
[0009] 经对比验证，采用本发明所制备的PRP，相较于现有技术，血小板浓度提升了近一 倍，而红细胞数量下降了数个数量级，技术效果显著，因而具有较好的推广应用价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0010] 图1为采用现有技术制备PRP时，离心后血液分层结构示意图； 图2为采用本发明所提供方法制备PRP时，加入淋巴细胞分离液和离心后血液分层结 构示意图。

【具体实施方式】
[0011] 下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0012] 介绍具体实施例前，对本发明所用到的主要仪器设备和试剂介绍如下。
[0013] 血液：来源于 申请人:公司员工自愿者的捐献。
[0014] 主要设备：低速冷冻离心机，JW-1044R，安徽嘉文仪器装备有限公司。
[0015] 主要试剂：淋巴细胞分离液(医用级）：天津市灏洋生物制品科技有限公司，批号为 20140710 ； 尿素（AR级）：天津天力化学试剂有限公司，批号为20130528 ; 枸橼酸钠：天津天力化学试剂有限公司，批号为20130502 ; 40%甲醛：北京索莱宝科技有限公司，批号为：20140422。
[0016] 另外需要强调和说明的是，实验过程中全程无菌操作。
[0017] 对比例 为具体说明本发明的技术效果，发明人首先以现有技术为基础制备了适量的PRP，简要 介绍如下。步骤如下： (1) 以预装枸橼酸钠抗凝剂的采血管，无菌操作下采取志愿者肘部静脉血20mL，分装到 15mL离心管中； (2) 对全血进行第一次离心：低速冷冻离心机以313X g的离心力，离心4分钟； (3) 巴氏管吸取上部血浆及靠近界面约I mm的血细胞转移至另一 15 mL离心管中； (4) 对上层血浆进行二次离心：低速冷冻离心机以1250 X g的离心力，离心6分钟； 可见在底部薄层血细胞上沉积有白膜样物质，即为血小板沉积层，其上部为含有极少量未 沉降血小板的血浆层； (5) 弃去上部大部分血浆，保留管底0. 5mL的血浆，静置20 min后振摇离心管，使离心 管底部的红细胞、血小板等沉淀成分重悬于剩余的血浆中，即为富血小板血浆（PRP )。
[0018] 如图1所不，现有技术制备PRP时血液分层效果不意图，为最大限度的提取PRP，不 可避免的会吸取到上层部分红细胞。实验结果计数表明，对现有技术所制备的PRP进行经 过血小板和红细胞计数，结果表明：血小板的浓度为1363.80 ± 919. 74X 109/L，红细胞数 目为 300±100X 107/L。
[0019] 血小板计数方法如下： 1)配置血小板稀释液：尿素（AR级)10克,枸橼酸钠0. 5克,置于IOOml容量瓶中,加蒸 馏水充分溶解后，用蒸馏水定容至IOOml，再加40%甲醛溶液0. Iml，混匀，过滤，置于-4°C保 存。
[0020] 2)取0. 38mL血小板稀释液置于0. 5mL无菌EP管中，加入已充分混匀的待测液 20 μ L，立即充分混匀； 3) 取步骤2)中混匀的悬液注入血球计数板计数池内，静置5~10min，使血小板下沉； 4) 莱卡荧光倒置显微镜（Leica-DMIL LED)高倍镜下计数中央大方格内细胞数，乘以 0. 2 X IO9即为每升中血小板数目。
[0021] 红细胞计数方法如下： 1)配制红细胞稀释液：取枸橼酸钠 I. 〇g，40%甲醛液I. 0ml，氯化钠0. 6g，加蒸馏水至 IOOml,混匀、过滤两次后备用。
[0022] 2)量取红细胞稀释液2. Oml于EP管中；加入IOuL待测PRP,上下颠倒混勻； 3) 将步骤2)中的红细胞悬液冲入计数池，不得有空泡或外溢，充池后静置2~3min后计 数； 4) 莱卡荧光倒置显微镜（Leica-DMIL LED)高倍镜下计数中央大方格内细胞数，乘以 0.2X109即为每升中红细胞数目。
[0023] 实施例f 5 进一步地，发明人以本发明所提供的富血小板血浆的制备方法进行了 PRP的制备，过 程简要介绍如下。
[0024] 本发明所提供的富血小板血浆的制备方法包括以下步骤： (1) 以预装抗凝血剂枸橼酸钠的采血管，无菌操作下采取志愿者肘部静脉血20mL，分装 到15mL离心管中； (2) 将步骤（1)所采集的血液缓慢分装到含有淋巴细胞分离液的15mL离心管中；以体 积配比计，淋巴细胞分离液：血液=1 : 2 ; (3) 对全血进行第一次离心：低速冷冻离心机以18(T250X g的离心力，离心8?10分 钟； (4) 巴氏管吸取步骤（3)离心后上层4/5的血浆于另一新的15mL离心管中； (5) 对步骤（4)所吸取的上层血浆进行二次离心：低速冷冻离心机以80(T1300X g的 离心力，离心6~8分钟； (6) 弃去步骤（5)离心后上层血浆，仅保留管底0. 5mL的血浆，静置20min后振摇离心 管，使红细胞和血小板重悬于剩余的血楽中，即为富血小板血楽（PRP)。
[0025] 实验结果如下表所示。

【权利要求】
1. 一种富血小板血浆的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 以预装抗凝剂的采血管，无菌操作下采集血液； (2) 将步骤（1)所采集的血液，分装到含有淋巴细胞分离液的离心管中； (3) 对步骤（2)的全血进行第一次离心：18(T250X g离心8?10分钟； (4) 吸取步骤（3)离心后上层血浆于另一新的离心管中； (5) 对步骤（4)所吸取的上层血浆进行二次离心：80(Tl3(K)X g离心6?8分钟； (6) 弃去步骤（5)离心后上层血浆，保留所需血浆用量，静置后振摇离心管，使管底沉淀 重悬于剩余的血浆中，即为富血小板血浆。
2. 如权利要求1所述富血小板血浆的制备方法，其特征在于，以体积配比计，步骤（2) 中淋巴细胞分离液：血液=1 : 2。
3. 如权利要求1所述富血小板血浆的制备方法，其特征在于，步骤（3)中离心力为 220X g，离心时间为8min。
4. 如权利要求1所述富血小板血浆的制备方法，其特征在于，步骤（4)离心力为1000X g，离心时间为6min。
5. 如权利要求1所述富血小板血浆的制备方法，其特征在于，步骤（1)的抗凝剂为枸橼 酸钠。
【文档编号】A61K35/16GK104337835SQ201410638430
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】郝京生, 韩慧华, 张东丽, 李帅民 申请人:河南金泰生物技术股份有限公司