一种九味獐牙菜片的制备方法及其在制备抑制肝癌细胞Hepa1-6细胞增殖药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种九味獐牙菜片的制备方法及应用。本发明的九味獐牙菜片的制备方法，由獐牙菜53.6g、金腰草17.9g、榜嘎35.7g、木香35.7g、兔耳草35.7g、苦荬菜42.9g、角茴香35.7g、小檗皮28.6g、波棱瓜子14.2g作为原料药制成，采用超临界萃取、微波萃取和大孔树脂吸附制备而成，使得盐酸小檗碱含量有很大提高。本发明还提供了九味獐牙菜片在制备抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞增殖药物中的应用。
【专利说明】一种九味獐牙菜片的制备方法及其在制备抑制肝癌细胞Hepa1-6细胞增殖药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药【技术领域】，具体涉及一种九味獐牙菜片的制备方法及其在制备抑 制小鼠肝癌细胞Hepal-6细胞增殖药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 九味獐牙菜胶囊标准号WS-11182 (ZD-1182)-2002,记载于国家中成药标准汇编 内科肝胆分册。由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬 菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g作为原料药制成，具有清热，消炎，止 痛的功效。用于胆囊炎，急性黄疸型肝炎。
[0003] 现有技术中，尚未有九味獐牙菜胶囊在提取制备方面采用C02超临界萃取、微波技 术和大孔树脂吸附技术提取的报道，而中药直接打粉取的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导 致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种九味獐牙菜片的制备方法。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种九味獐牙菜片在制备抑制小鼠肝癌细胞 Hepal-6细胞增殖药物中的应用。
[0006] 本发明的目的是通过如下的方案实现的： 一种九味獐牙菜片的制备方法，由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香 35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g作为原 料药制成，所述的制备方法由下列步骤组成：取木香、角茴香，粉碎成细粉，加入到〇)2超 临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力 20-30MPa，温度30-50°C，C02流量l-3ml/g生药萃取时间130-170min，得超临界萃取 物，备用；萃取后的木香、角茴香残渣与其他七味药材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波 萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液，浓 缩，加到DiaionHP-10大孔吸附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回 收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇 制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0. 3g。
[0007] 上述的九味獐牙菜片的制备方法中，所述C02超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂 的体积百分比为5%。
[0008] 上述的九味獐牙菜片的制备方法中，所述C02超临界萃取中萃取压力为25MPa。
[0009] 上述的九味獐牙菜片的制备方法中，所述C02超临界萃取中萃取温度为60°C。
[0010] 上述的九味獐牙菜片的制备方法中，所述C02超临界萃取中C02流量2!111/^生 药?min〇
[0011] 上述的九味獐牙菜片的制备方法中，所述C02超临界萃取中萃取时间为150min。
[0012] 上述的九味獐牙菜片的制备方法中，所述微波萃取功率为700W。
[0013] 上述的九味獐牙菜片的制备方法中，所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
[0014] 上述的九味獐牙菜片在制备抑制小鼠肝癌细胞Ifepal-6细胞增殖药物中的应用。
[0015] 现有技术中，九味獐牙菜胶囊口服，一次4-5粒，一日2-3次。九味獐牙菜胶囊服 药量大。采用本发明方法制备成的九味獐牙菜片每片重〇. 3g，每次仅需2片，一日服用2-3 次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。
[0016] 试验一、不同方法制备的九味獐牙菜片中盐酸小檗碱含量的比较 1、仪器及试药本发明九味獐牙菜片：按实施例1方法制备，使用300g原料药，经提取 制成200片，每片重0. 3g。原九味獐牙菜胶囊，按照WS-11182 (ZD-1182)-2002标准方法 制备，作为对照。Agilentl200高效液相色谱仪；AE240电子分析天平；盐酸小檗碱对照品 (中国药品生物制品检定所)。
[0017] 2、方法 照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VID)测定。
[0018] 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0. 05mol/ L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至3) (22:78)为流动相；检测波长为347nm。理论板 数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
[0019] 对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含盐酸小 檗碱28呢的溶液，即得。
[0020] 本发明产品供试品溶液的制备取本发明的九味獐牙菜片，研细，取0.lg，精密称 定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理50分钟，放冷，再称定重量， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，取上清液，用微孔滤膜（〇. 45Mm)滤过，取续滤液，即得。
[0021] 对照品供试品溶液的制备取本对照的九味獐牙菜胶囊，研细，取0. 5g，精密称定， 置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理50分钟，放冷，再称定重量，用甲 醇补足减失的重量，摇匀，取上清液，用微孔滤膜（〇. 45Mm)滤过，取续滤液，即得。
[0022] 测定法分别精密吸取对照品溶液、本发明产品供试品溶液与对照品供试品溶液各 5W，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0023] 3、结果 结果表明，本发明九味獐牙菜片中盐酸小檗碱的含量为3. 6-7mg/片；而原九味獐牙菜 胶囊中盐酸小檗碱的含量为〇. 71mg/粒，每片盐酸小檗碱含量相当于原胶囊剂含量的5-10 倍，在服用量减少的情况下，盐酸小檗碱含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，采用本发明制备方法制备的九味獐牙菜片，有效成分含量远远高 于WS-11182 (ZD-1182) -2002标准记载的方法制备的九味獐牙菜胶囊。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解 本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0026] 实施例1 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g:取木香、角茴香，粉碎成细粉，加入到C02超临 界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa， 温度40°C，C(V流量2ml/g生药^化，萃取时间150min，得超临界萃取物，备用；萃取后的木 香、角茴香残渣与其他七味药材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波 萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸 附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波 提取物，将超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200 片，每片重0. 3g。
[0027] 经检测，成品中盐酸小檗碱的含量为7. 05mg/片。
[0028] 实施例2 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g:取木香、角茴香，粉碎成细粉，加入到C02超临 界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力30MPa， 温度50°C，C(V流量3ml/g生药^化，萃取时间130min，得超临界萃取物，备用；萃取后的木 香、角茴香残渣与其他七味药材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波 萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大孔吸 附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波 提取物，将超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成200 片，每片重0. 3g。
[0029] 经检测，成品中盐酸小檗碱的含量为3. 60mg/片。
[0030] 实施例3 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g:取木香、角茴香，粉碎成细粉，加入到C02超临 界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力20MPa， 温度30°C，C02流量lml/g生药?min，萃取时间170min，得超临界萃取物，备用；萃取后的 木香、角茴香残渣与其他七味药材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取装置中进行微 波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分钟，合并萃取液，浓缩，加到DiaionHP-10大 孔吸附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得 微波提取物，将超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成 200片，每片重0. 3g。
[0031] 经检测，成品中盐酸小檗碱的含量为4. 88mg/片。
[0032] 实施例4 :九味獐牙菜片抑制小鼠肝癌细胞Hepal-6细胞增殖的实验研究资料 1.实验材料 1. 1实验用细胞株 小鼠肝癌细胞H印al-6细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。
[0033] 1. 2实验药物 研究药物：本发明九味獐牙菜片：按实施例1方法制备。
[0034] 药液储液：称取100mg九味獐牙菜片，溶于5ml无水乙醇中，0. 2Mm滤器过滤， 500Wdoff管分装，-20°C存储，同时0. 2Mm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0035] 1. 3实验试剂 DMEM(GIBC0公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No. 11810-033Lot. No. 1088387);Trypsin(AMRESC0 公司）;EDTA(AMRESC0 公司）;PenicillinGSodiumSalt (AMRESC0公司l);StreptomycinSulfate(AMRESCO);无水乙醇（溜博亚杜兰经贸有限公 司）；MTT(Biosharp批号：0793):PBS(实验室自配）； 1. 4实验器材 莱卡倒置显微镜(德国Leica型号：DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型 号：SPECTRAMAX190);C02培养箱（FORMA型号：3111);超净台（苏净集团安泰公司制造型号： SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号：S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型 号：P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号：BT323S);全自动高压灭菌锅（日本SANYO 公司型号：MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A);冰 箱（西门子公司型号：KG18V21TI);液氮罐（CBS型号：2001);低速离心机(上海安亭科学仪 器厂型号：KA-1000) ;0. 2Mm滤器（MILLIP0RE型号：SLGP033RB);lcm培养皿（NEST公司）、 96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.实验方法 1)Ifepal-6细胞用DMEM+10%FBS于37 °C、5%C02进行常规培养（10cm培养皿)，当 细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋白 酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转 入离心管中，lOOOrpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X104个/ml。
[0037] 2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180M1，培养板放入细胞培养箱 中（37°C，5%C02)常规培养。
[0038] 3)根据细胞生长情况，一般长至50%_70%，加入九味獐牙菜片溶液，继续培养24h。
[0039] 4) 24h后加入 20WMTT溶液（5mg/ml，即 0? 5%MTT)，继续培养 4h。
[0040] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔如入200W二甲基亚砜，置摇床 上低速振荡l〇min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0041] 6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介 质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0042] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率（%)=(对照孔0D值-给药 孔0D值)、对照孔0D值X100%。实验重复3次。
[0043] 3.统计处理 采用MicrosoftExcel2007软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean土S.D.表不。
[0044] 4.实验结果 MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对H印al-6细胞 增殖抑制有差异（P〈〇. 05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性（P〈0. 01)，当剂量达到 15_20mg/ml时有极显著性差异（P〈0. 001)。
[0045] 表1九味獐牙菜片对H印al-6细胞增殖抑制影响研究（X土SD)
【权利要求】
1. 一种九味獐牙菜片的制备方法，由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香 35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g作为原料 药制成，其特征在于，所述的制备方法由下列步骤组成：取木香、角茴香，粉碎成细粉，加入 到C02超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取 压力 20-30MPa，温度 30-50°C，C02 流量1-31111/^生药，111111，萃取时间13〇-17〇111111，得超临界 萃取物，备用；萃取后的木香、角茴香残渣与其他七味药材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入 微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分钟，合并萃取液， 浓缩，加到Diaion HP-10大孔吸附树脂柱上，60%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压 回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，将超临界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙 醇制颗粒，干燥，压片，制成200片，每片重0. 3g。
2. 根据权利要求1所述的九味獐牙菜片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取 中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
3. 根据权利要求1所述的九味獐牙菜片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取 中萃取压力为25MPa。
4. 根据权利要求1所述的九味獐牙菜片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取 中萃取温度为60°C。
5. 根据权利要求1所述的九味獐牙菜片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取 中C02流量2ml/g生药? min。
6. 据权利要求1所述的九味獐牙菜片的制备方法，其特征在于，所述C02超临界萃取中 萃取时间为150min。
7. 根据权利要求1所述的九味獐牙菜片的制备方法，其特征在于，所述微波萃取功率 为 7001
8. 根据权利要求1所述的九味獐牙菜片的制备方法，其特征在于，所述微波萃取每次 萃取时间为8分钟。
9. 权利要求1所述的九味獐牙菜片在制备抑制小鼠肝癌细胞Hepal-6细胞增殖药物 中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104383282SQ201410638491
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】权栋栋, 朱立平, 陈云, 李加美, 王丽丽 申请人:山东中大药业有限公司