西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用。西维来司他可以减少炎性介质，保护神经元，但其在癫痫导致的脑组织损伤是否有保护作用，目前国内外未见相关报道。本发明提供了西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用，所述西维来司他通过抑制高迁移率族蛋白1和中性粒细胞弹性蛋白酶的表达、阻止高迁移率族蛋白1的迁移、降低受损脑细胞炎症反应、降低血清S100β含量而作为抗炎、抗癫痫的药物。西维来司他能形成保护血脑屏障，降低癫痫炎症反应，减少损伤海马神经元的数量，产生对受损脑神经元的保护作用。
【专利说明】西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物应用，具体涉及西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用。
【背景技术】
[0002] 癫痫（Epil印sy)是一种以具有持久的致痫倾向和相应的神经生物、认知、社会 心理等方面后果为特征的脑部疾病。癫痫是神经系统的常见疾病，近年来在世界范围内 发病率有逐年递增趋势，它已影响了全世界约五千万人，引起癫痫的病因和发病机制非常 复杂，随着癫痫研究领域的进展，出现了包括药物、手术、迷走神经刺激、脑深部电刺激等 治疗癫痫的方法，治疗癫痫的疗效有了一定的提高。癫痫的治疗方法很多，早期、足量、个 体化药物治疗目前仍然是治疗癫痫的最主要手段，其中，传统的抗癫痫药物有苯妥英钠 (phenytoin, PHT)、卡马西平（carbamazepine, CBZ)、丙戊酸（valproate, VPA)、苯巴比 妥（Phenobarbital, PB)、扑痫酮（primidone, PMD)、乙玻胺（ethosuximide, ESX)、氯 硝西泮（clonazepam, CNZ);新型的抗癫痫药物有托批酯（topiramate, TPM)、拉莫三嗪 (lamotrigine, LTG)、加巴喷丁（gabapentin, GBP)、非氨酯（felbamate, FBM)、奥卡西平 (oxcarbazepine, 0XC)、氨己烯酸（vigabatrin, VGB)、替加宾（tigabine, TGB)、唑尼沙 胺（zonisamide, ZNS)、左乙拉西坦（levetiracetam, LEV)、普瑞巴林（pregabalin)，仍有 20°/『30%复杂部分性发作癫痫患者用各种抗癫痫药物治疗难以控制发作。这不仅给患者造 成智能及躯体损害，而且增加了医疗经济负担，并带来一系列心理、社会问题。目前，癫痫发 病的确切机制尚未完全阐明，研究癫痫发作的确切机制和探寻新的高效低毒抗癫痫药物， 有效控制癫痫发作是当今亟需解决的问题，也是当前研究热点。
[0003] Sivelestat(西维来司他)，即N-[2-[[[4_(2, 2-二甲基-1-氧代丙氧基）苯基] 磺酰]氨基]苯甲酰]-(S)-甘氨酸，是一种外源性的特异性中性粒细胞弹性蛋白酶（NE)抑 制剂，能够特异性的抑制NE的生物活性，抑制炎症反应，对急性肺损伤有很好的保护作用， 目前临床主要用于治疗全身性炎症反应综合征、coro等疾病。研究还发现西维来司他能够 减轻肝脏部分切除后的肝脏损伤，能够减少高迁移率族蛋白的释放和降低IL-6的水平；在 颅脑损伤、脑出血、脊髓损伤等动物模型实验中均证实西维来司他可以减少炎性介质，保护 神经元。但西维来司他在癫痫导致的脑组织损伤是否有保护作用，目前国内外未见相关报 道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供了西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用，将西维来司他作 为抗炎症、抗癫痫和脑神经元保护作用药物，能降低受损脑细胞炎症反应，减少损伤神经元 的数量，产生对受损脑神经元的保护作用。
[0005] 本发明所采用的技术方案是： 西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用。
[0006] 所述西维来司他通过抑制高迁移率族蛋白1和中性粒细胞弹性蛋白酶的表达、阻 止高迁移率族蛋白1的迁移、降低受损脑细胞炎症反应、降低血清SlOOP含量而作为抗炎、 抗癫痫的药物。
[0007] 本发明具有以下优点： 本发明涉及l〇mg/kg的西维来司他对癫痫大鼠脑神经元及血脑屏障的保护作用及机 制。所述的西维来司他对氯化锂匹罗卡品诱导的癫痫大鼠有抗癫痫作用，具有抗炎症反应 性能，其机制可能为显著抑制HMGBl、NE表达，降低血清SlOOP含量，保护血脑屏障等途径 降低癫痫大鼠体内炎症反应，减少损伤海马神经元的数量，产生对癫痫大鼠脑神经元的保 护作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1是大鼠脑组织HE染色结果（X200倍)，显示癫痫持续状态大鼠脑组织中性粒 细胞浸润情况，以及Sivelestat可显著减少癫痫持续状态大鼠脑组织炎症细胞浸润。
[0009] 图2是大鼠血清中SlOO於的ELISA检测结果，显示SE组大鼠血清中SlOO於的表 达含量与Sham组相比显著升高（i±SEM，n=42, ***P〈0. 001)。
[0010] 图3是大鼠血清中SlOO於的ELISA检测结果，显示Sivelestat对癫痫持续状态 大鼠血清中SlOO芦的表达含量的影响（i±SEM，n=72广*P〈0. 001广P〈0. 01)。
[0011] 图4是大鼠脑组织HMGBl免疫组化法检测结果，显示造模成功后24h时各组大鼠 海马组织CAl区及CA3区HMGBl的表达情况±SEM，n=18广*P〈0. 001)。
[0012] 图5是大鼠血清中HMGBl的ELISA检测结果，显示癫痫持续状态大鼠血清中HMGBl 的含量较正常大鼠显著升高（i±SEM，n=42, _P〈0. 001)。
[0013] 图6是大鼠血清中HMGBl的ELISA检测结果，显示Sivelestat可显著降低癫痫持 续状态大鼠血清中HMGBl的水平（i±SEM，n=72广*P〈0. 001广P〈0. 01)。
[0014] 图7是大鼠脑组织NE免疫组化法检测结果，显示造模成功后24h各组大鼠海马组 织CAl区及CA3 区NE的表达情况（i±SEM，n=18, ***P〈0. 001)。
[0015] 图8是是大鼠血清中NE的ELISA检测结果，显示癫痫持续状态大鼠血清中NE的 含量较正常大鼠显著升高±SEM，n=42, ***P〈0. 001)。
[0016] 图9是大鼠血清中NE的ELISA检测结果，显示Sivelestat可显著降低癫痫持续 状态大鼠血清中NE的水平（i±SEM，n=72, ***P〈0. 001，**P〈0. 01)。
[0017] 图10是WesternBlot检测HMGBl在大鼠海马组织中的表达结果，显示 Sivelestat可显著降低HMGBl在癫痫大鼠海马组织中的表达量（i±SEM，@P〈0. 001， **P〈0. 01，*P〈0. 1)。
[0018] 图11是WesternBlot检测NE在大鼠海马组织中的表达结果，显示Sivelestat 可显著降低NE在癫痫大鼠海马组织中的表达量（i±SEM，@P〈0.001，#P〈0.01)。
[0019] 图12是大鼠脑组织尼氏染色的结果，显示癫痫持续状态大鼠神经元大量坏死，胞 核固缩、裂解，神经元脱失，Sivelestat可显著减轻大鼠海马神经元受损程度。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0021] 本发明涉及西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用，所述西维来司他的用量为 10mg/kg，能抑制高迁移率族蛋白1和中性粒细胞弹性蛋白酶的表达，阻止高迁移率族蛋白 1的迁移，降低受损脑细胞炎症反应，降低血清SlOOP含量，产生保护血脑屏障，从而起到 抗炎、抗癫痫的作用，能间接起到减少损伤神经元的数量，起到保护脑神经元的作用。
[0022] 西维来司他具有抗炎症反应、抗癫痫、保护血脑屏障和脑神经元保护作用的实 验： 材料和方法： I. 1实验动物 Iio只健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠（出生后5-6周，体重150_200g)，由西 安交通大学实验动物中心提供，实验前让大鼠适应我们的实验室环境中至少一个星期，所 有大鼠均饲养在稳定环境条件下（21 ±2°C，30-70%相对湿度，12h黑暗/光照周期)，充足饮 用水和鼠粮。
[0023] 1. 2动物模型制备 采用Costa-Ferro等沿用的方法：按127mg/kg的剂量依次腹腔注射氯化锂；20h后 腹腔注射阿托品（0.1mg/kg)以降低匹罗卡品外周胆碱能反应；注射阿托品30min后，按 40mg/kg的剂量腹腔注射匹罗卡品；半小时后开始观察大鼠癫痫发作的程度（依据Racine 分级标准：〇.无任何反应；I.面部阵挛，眨眼、动须、节奏性咀嚼等；II.I级加节律性点 头；III.II级加前肢阵挛；IV . III级加后肢站立；V.IV级加摔倒）；V级发作的SD大鼠随 机纳入实验，V级以下或未发作的SD大鼠剔除本实验；癫痫持续状态90min后，腹腔注射地 西泮（10mg/kg)终止癫痫发作。而Sham组大鼠给予相同剂量的生理盐水。Sivelestat(上 海，中国)在癫痫持续状态终止后30分钟经尾静脉给予；Sivelestat溶解于0. 9%的生理盐 水，每只大鼠总注射量不超过lml。分别在给药后3h，6h，，12h，24h，48h，72h进行检 测。
[0024] I. 3酶联免疫吸附法（ELISA)测定血清中HMGBl和SlOOP水平 大鼠HMGBlELISA试剂盒和SlOOPELISA试剂盒购自于西安依科生物技术有限公 司，到达取材时间后每组随机取6只大鼠，10%的水合氯醛麻醉后开胸经右心房取血2ml，低 温高速离心机3000r/min，离心20min后取上清样品-80度存放备用。对样品和标准品在 450nm波长测量吸光度（0D值)，根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的回归方 程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。
[0025] 1. 4海马神经元病理变化测定 HE染色法测定海马神经元的病理性变化：再灌注3h，6h，12h，24h，48h，72h后，取 出大鼠脑组织，10%多聚甲醛固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋切片，进行苏 木素-伊红（HE)染色，光学显微镜下观察海马神经元形态学变化。
[0026] 1. 5免疫组化法检测HMGBl的表达 多克隆兔抗大鼠HMGBl抗体购自于西安依科生物技术有限公司，SABC试剂盒及DAB显 色试剂购自北京中杉金桥公司。到达取材时间后每组随机取6只大鼠，10%的水合氯醛麻醉 后行左心室插管，依次用预冷肝素生理盐水、4%的多聚甲醛灌注后取脑，所有脑组织立即放 入10%多聚甲醛溶液固定24h，常规石蜡包埋，同一时间2 厚连续切片做免疫组化染色。
[0027] 免疫组化采用SP法，切片常规梯度脱蜡至水，柠檬酸溶液中高温高压抗原修复1 分40秒，3%H202溶液封闭20分钟。山羊血清封闭Ih后，滴加一抗，4°C孵育过夜，PBS冲 洗，分别滴加生物素标记的山羊抗兔二抗，室温孵育30分钟后，滴加辣根过氧化物酶标记 的链霉卵白素，室温孵育20分钟，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，阴性对照 用PBS代替一抗，其余所加试剂及操作步骤均相同。
[0028] 1. 6尼氏染色观察大鼠海马神经元形态学特征 通过尼氏染色来观察海马神经元的形态变化。组织切片脱蜡至水；按Ig甲苯胺蓝溶于 1%硼砂水溶液（I. 907g溶于IOOml三蒸水）的比例配制1%的甲苯胺蓝溶液，调整PH值至 9. 3 ;切片经PBS洗3次后，添加1%的甲苯胺蓝溶液在50°C条件下孵育20min;蒸馏水洗3 次；70%的酒精作用Imin;95%的酒精分化（镜下控制，以尼氏小体显示清晰为度）；无水酒 精迅速脱水，二甲苯透明；合成树胶封片；镜下观察照相（400X)。
[0029] 1. 7免疫印迹法检测大鼠海马区HMGBl和NE水平 探讨HMGBl和NE在大鼠海马中的表达水平，我们首先把冷冻标本称重，放入干燥洁净 的匀浆器中，加入含有PMSF的RIPA裂解缓冲液，匀浆后4度离心，12000转/分钟，20分钟， 取出上清液。采用BCA定量测定试剂盒（Bestbio,中国）进行定量检测样品蛋白含量。之 后，我们使用标准的15%的SDS-PAGE凝胶进行SDS-PAGE电泳，转膜，以5%脱脂奶粉封闭， 孵育多克隆兔抗大鼠HMGBl抗体（HMGB1 1:300,武汉三鹰，中国)和多克隆兔抗大鼠NE抗体 (NE1:300,武汉三鹰，中国），室温孵育一小时，四度过夜，然后用HRP结合的兔抗大鼠抗体 在室温下孵育一个半小时(稀释1:1〇〇〇,〇5!'，美国）。我们应用0- &(^111作为内参抗体(稀 释度1:1000,武汉博士德，中国），最后，增强化学发光法定量（Pierce，美国），X-光片曝光， 显影，定影后室温晾干胶片扫描分析灰度值。
[0030] 1. 8统计结果分析 数据以均数土标准差（X土SD)表示。应用GraphPadInStat3. 05统计软件进行统计 学分析，多个样本均数比较采用单因素方差分析（AN0VA)，以a=0. 05为检验水准，P〈0. 05表 示差异有统计学意义。， 实验结果： I. 1癫痫持续状态模型建立成功率和大鼠死亡率 共110只SD大鼠，造模成功率为92. 7%，实验过程中大鼠死亡率为4. 5%。
[0031] 1. 2中性粒细胞浸润情况 图1可见为大鼠脑组织HE(苏木素-伊红）染色结果，癫痫持续状态后大鼠海马区中 性粒细胞相比正常大鼠脑组织明显增多，而在癫痫持续状态后给予Sivelestat可减少海 马区中性粒细胞浸润。
[0032] 1. 3血脑屏障通透性/大鼠血清SlOO於的表达 图2显示了癫痫持续状态大鼠血清中SlOO於的表达水平显著高于正常大鼠，6h时出 现第一个小高峰，24h时出现第二个更高的峰值。给予Sivelestat后，见图3,Sivelestat 组干预过的癫痫持续状态大鼠血清SlOO#水平明显降低，以6h，24h，48h更为显著。
[0033] I. 4大鼠血清HMGBl和NE的表达 HMGBl参与炎症反应，正常大鼠海马内主要表达于神经细胞胞核，癫痫持续状态大鼠海 马内HMGBl大量外移，胞浆也黄染，Sivelestat可有效阻止其向核外迁移，见于图4。图5 和图6可见，癫痫持续状态大鼠血清中HMGBl的水平明显高于正常大鼠，且给予Sivelestat 后可显著降低HMGBl的表达（P〈0. 001)。
[0034] NE是重要的炎症介质，可通过极强的蛋白水解作用参与脑损伤后的血脑屏障破 坏，促进炎症细胞浸润，在正常大鼠海马内主要表达于神经细胞胞浆，癫痫持续状态大鼠海 马内NE在神经细胞胞核和胞浆均表达，胞核和胞浆均黄染，Sivelestat可有效减少NE的 表达，见于图7。图8和图9可见，療痛持续状态大鼠血清中NE的水平明显商于正常大鼠， 且给予Sivelestat后可显著降低NE的表达（P〈0. 001)。
[0035] L5大鼠海马中HMGBl和NE的表达 图10可见HMGBl在癫痫持续状态大鼠海马中的表达明显高于正常大鼠，在24h最 为显著（P〈〇. 001)，且Sivelestat可显著降低HMGBl在癫痫持续状态大鼠海马区的表达。 图11可见NE在癫痫持续状态大鼠海马中的表达明显高于正常大鼠，在48h达到高峰 (P〈0. 001)，且Sivelestat可显著降低NE在癫痫持续状态大鼠海马区的表达。
[0036] 1.6大鼠海马神经元病理形态变化 图12可见，大鼠灌注固定后尼氏染色显示了大鼠海马神经元的变化情况。癫痫持续状 态大鼠与正常大鼠相比，完整海马神经元的数量明显减少，且神经元出现脱失，坏死，核固 缩、裂解，胞核空泡变等现象。Sivelestat干预后的癫痫持续状态大鼠海马坏死神经元数量 明显减少，神经元形态恢复正常，核仁清晰，排列紧密，Sivelestat对癫痫持续状态大鼠海 马神经元有显著的保护作用。
[0037] 本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书 而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
【权利要求】
1. 西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用。
2. 根据权利要求1所述的西维来司他作为治疗癫痫病药物的应用，其特征在于：所述西维来司他通过抑制高迁移率族蛋白1和中性粒细胞弹性蛋白酶的表达、阻止高 迁移率族蛋白1的迁移、降低受损脑细胞炎症反应、降低血清S100P含量而作为抗炎、抗癫 痫的药物。
【文档编号】A61K31/222GK104473915SQ201410684257
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】李亚军, 王林 申请人:李亚军, 王林