本发明涉及兽医学和兽药学、免疫学领域。具体地，本发明涉及三肽囊素规模化制备及作为疫苗佐剂在防控畜禽重大疾病上的应用。
背景技术：
：囊素三肽(也称为“三肽囊素”)是Audhya在1986年首次从法氏囊中分离到的一种称为Bursin的三肽，氨基酸顺序为Lys-His-Gly-NH2，功能是诱导禽类和哺乳类的B细胞前体分化为B细胞，选择性分化激素，对体液免疫起着重要的调节作用(T.Audhyeetal,Science,231,997,1986)。针对当前规模化、集约化养殖业中普遍面临的畜禽群体免疫功能低下和疫苗免疫水平不高，甚至有的疫苗有免疫抑制作用的重要问题，同时针对市场上缺乏严格质量控制的畜禽用免疫增强剂，研制出既具有较强免疫调节功能，具明显佐剂活性的安全、高效、质量稳定、价格低廉的免疫佐剂是预防兽医学研究的重要方向和发展趋势之一。近年来，禽流感已成为世界关注的严峻问题，如何提高禽流感疫苗的作用是开发高效低成本疫苗的关键，其中囊素肽作为免疫增强剂已受到充分的证实。传统上，利用提取的囊素肽虽然能够在加强疫苗效果中获得应用，但是质量控制存在非常严重的问题。利用人工合成的囊素三肽，虽然可以解决质量控制的问题，但是由于是畜牧业用的疫苗，以目前的工艺还存在成本太高，无法推广使用的困难。所以研制低成本、适合产业化的增强型禽流感疫苗佐剂是本领域迫切需要的。现有技术中虽然有公开了一些合成三肽囊素的方法，但是步骤烦琐，无法大幅度降低成本，或者合成的三肽囊素活性较低。综上所述，为了推广活性肽疫苗佐剂的应用，迫切需要开发新的制法简便、成本低廉、适合规模化制备三肽囊素的方法。技术实现要素：本发明的目的就是提供一种三肽囊素规模化制备及作为疫苗佐剂在防控畜禽重大疾病上的应用。在本发明的第一方面，提供了三肽囊素、其衍生物或其药学上可接受的盐，在制备药物中的用途，所述药物用于：(1)提高动物血清中IL-6的水平；和/或(2)提高动物血清中IL-2的水平；在另一优选例中，所述动物为猪。在另一优选例中，所述药物还用于：(3)提高猪蓝耳病疫苗的免疫效果；(4)提高猪瘟疫苗的免疫效果；和/或(5)提高动物血浆中γ球蛋白含量。在另一优选例中，所述药物还用于提高鸡血浆中γ球蛋白含量。本发明的第二方面，提供了一种三肽囊素衍生物的制备方法，包括步骤：(a)在合适的惰性溶剂中，在胰蛋白酶存在下，在pH为6.2-7.2和33-38℃下，使BOC-Lys-OH和HCl2-His-Gly-NH2反应，形成式III化合物；BOC-Lys-OH+HCl2-His-Gly-NH2→BOC-Lys-His-Gly-NH2式I式中，BOC为叔丁氧羰基；(b)用HCl/HOAC处理式III化合物，从而去除保护基，形成下式所示的三肽囊素衍生物：2HCl-Lys-His-Gly-NH2。在另一优选例中，所述步骤(a)中的pH为6.8。在另一优选例中，所述步骤(a)中的反应温度为37.5℃。在另一优选例中，所述所述的HCl2-His-Gly-NH2是用活化酯缩合法，通过BOC2-His-OSU和H-Gly-NH2的反应而制备的。本发明的第三方面，提供了一种药物组合物或疫苗组合物，它含有(i)三肽囊素、其衍生物或其药学上可接受的盐；和(ii)猪瘟疫苗和/或猪蓝耳病疫苗；以及，药学上或免疫学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的组合物中，三肽囊素的含量是每1000毫升或1000g动物疫苗中含有150-2000微克三肽囊素。在另一优选例中，当将所述组合物给予猪时，用量为5-20微克三肽囊素/千克体重，更佳地为5-15微克三肽囊素/千克体重。附图说明图1显示了BS对血浆γ球蛋白含量的影响。图2显示了外周血T淋巴细胞的增殖转化。图3显示了脾脏T淋巴细胞的增殖转化。具体实施方式本发明人经过深入而广泛的研究，首次研发出了低成本、适合规模化且又不会引起多肽消旋的三肽囊素的生产方法，即三肽囊素的叠氮-活化酯组合液相合成法和酶法制备法。基于本发明新的低成本制备方法，本发明还提供将此三肽囊素应用到禽流感疫苗作为佐剂，从而广谱提高禽类免疫能力的用途。试验证明，本发明提供的三肽囊素可以提高禽类红细胞非特异性免疫功能；拮抗环磷酰胺引起免疫抑制；减少胸腺、脾脏、法氏囊细胞凋亡；增加免疫器官发育。因此，从机理上证明了三肽囊素可以广泛作为畜禽免疫佐剂使用。术语如本文所用，除非另外说明，术语通常具有在本领域中常用的含义。如本文所用，术语“BS”指三肽囊素。如本文所用，术语“CP”指环磷酰胺。如本文所用，术语“Gly”指甘氨酸(G)。如本文所用，术语“His”指组氨酸(H)。如本文所用，术语“Lys”指赖氨酸(K)。如本文所用，术语“BOC”指叔丁氧羰基。如本文所用，术语“HOSU”指N-羟基琥珀酰亚胺。如本文所用，术语“OSU”指N-羟基琥珀酰亚胺酯。如本文所用，术语“DCCI”指二环己基碳二亚胺。如本文所用，术语“DCU”指二环己基脲。如本文所用，术语“HCl”指氯化氢。如本文所用，术语“NaOH”指氢氧化钠。如本文所用，术语“NaCl”指氯化钠。如本文所用，术语“THF”指四氢呋喃。如本文所用，术语“HOAC”指醋酸。如本文所用，术语“DMF”指二甲基甲酰胺。如本文所用，术语“HPLC”指高压液相色谱。如本文所用，术语“禽类”包括鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、火鸡等各种禽类。如本文所用，术语“三肽囊素”和“囊素三肽”可互换使用。另外，所述术语还包括三肽囊素的衍生物(例如药学上可接受的盐形式，如盐酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐等)。制备方法由于活性多肽组成的氨基酸具有光学活性，因此，在多肽合成时对选择的缩合剂和接肽方法必须能保证产物的光学活性。叠氮合成与酶促合成是最少引起消旋的方法，保证三肽的光学活性纯度，而且此方法可以大规模放大。具体地，本发明提供了式I或式Ia所示的三肽囊素衍生物的制备方法。BOCn-Lys-His-Gly-NH2式I2HCl-Lys-His-Gly-NH2式Ia式中，BOC为叔丁氧羰基，n为1或2。一种优选的方法是叠氮-活化酯组合法。步骤一、BOC-Lys(BOC)-OSU制备：将L-Lys-OH溶于碱性水溶液(如1NNaOH溶液)中，在室温下(如4-20℃)滴加BOC酸酐的叔丁醇溶液，维持反应液pH约为8-9。反应时间没有特别限制，通常为1-24小时。反应完成后，反应溶液用冰浴冷却，调节pH至酸性(如约pH4)，用乙酸乙酯抽提，以NaCl水溶液洗至pH中性，干燥，减压抽去乙酸乙酯，即可获得BOC-Lys(BOC)-OH。将BOC-Lys(BOC)-OH溶于惰性有机溶剂(如THF)中，与等摩尔的HOSU(300毫克分子)在-10℃至-2℃(如-5℃左右)反应。反应完成后，去除DCU副产物，用结晶法等方法可获得所需的BOC-Lys(BOC)-OSU。步骤二、2HCl-His-OCH3制备：向L-His-OH与无水甲醇的混合物中，通入氯化氢至饱和，回流至His完全溶解，反应1-50小时(如放置过夜)。反应结束后，可析出大量结晶，即为2HCl-His-OCH3。步骤三、BOC-Lys(BOC)-His-NHNH2制备：将BOC-Lys(BOC)-OSU溶于合适的惰性溶剂(如THF中)，加入2HCl-His-OCH3，并加入三乙胺，搅拌反应。反应时间通常为1-50小时(如反应过夜)。反应结束后，减压抽去溶剂，经乙酸乙酯萃取、洗涤、干燥、结晶等，加入乙醚结晶等步骤，可获得固体形式的BOC-Lys(BOC)-His-OCH3。将BOC-Lys(BOC)-His-OCH3溶于合适的惰性溶剂(如甲醇)中，加入水合肼，加热回流(约65±5℃)反应一段时间(如2-10小时，更佳地约6小时)，冷却后析出固体，过滤，收集固体，洗涤，干燥，就获得了BOC-Lys(BOC)-His-NHNH2。步骤四、BOC-Lys(BOC)-His-Gly-NH2制备：将BOC-Lys(BOC)-His-NHNH2溶于合适的惰性溶剂中(如DMF)中，在约-20℃(如-25℃至-15℃)的温度下，加入氯化氢的THF溶液和亚硝酸叔丁酯，维持反应温度半小时后，加入三乙胺，反应液pH调至7-8左右。随后加入H-Gly-NH2，反应完成后，滤去三乙胺盐酸盐固体。从滤液中分离获得反应产物，即为BOC-Lys(BOC)-His-Gly-NH2粗产物。对BOC-Lys(BOC)-His-Gly-NH2粗产物进行硅胶层析，即可获得纯化的BOC-Lys(BOC)-His-Gly-NH2精制固体。步骤五、2HCl-Lys-His-Gly-NH2对上述精制固体用常规方法去除保护基BOC，例如溶于HCl/HOAc溶液中，25℃搅拌反应1.5小时，减压抽去HCl/HOAc，残留物用甲醇100毫升溶解，再次减压抽干，带去多余HCl，用无水乙醚研磨成粉，即可获得2HCl-Lys-His-Gly-NH2。另一种优选的方法是胰蛋白酶酶促合成法。步骤一、BOC-His(BOC)-OSU制备：将BOC-His(BOC)-OH溶于合适的惰性有机溶剂(如THF)中，加入HOSU，在约-5℃以下(如-10℃至-5℃)，加入DCCI，反应完成后，滤去DCU固体，从滤液中用常规方法分离获得固体，即为BOC-His(BOC)-OSU步骤二、BOC-His(BOC)-Gly-NH2制备：将BOC-His(BOC)-OSU溶于合适的惰性溶剂(如THF)中，与HCl-Gly-NH2和三乙胺混合，将反应混合物维持pH7.7左右(如7.5-8.0)，搅拌反应一段时间(如1-50小时)。反应结束后，用乙酸乙酯萃取，洗涤、无水硫酸钠干燥，滤去干燥剂，滤液减压浓缩至小体积，加入石油醚至微混，可析出固体，即为BOC-His(BOC)-Gly-NH2。步骤三、HCl2-His-Gly-NH2制备：对BOC-His(BOC)-Gly-NH2用常规方法去除保护基BOC，例如用HCl/HOAc溶液处理，即可获得HCl2-His-Gly-NH2。步骤四、BOC-Lys-His-Gly-NH2酶促合成：将BOC-Lys-OH和HCl2-His-Gly-NH2溶于合适的惰性溶剂(如1,4-丁二醇∶水(7∶1)混合溶剂)中，调节pH为6.5-7.5。在胰蛋白酶(优选的是各种市售的固相化胰蛋白酶，其中固相酶与底物重量比为1∶10～1∶20)存在下，于30-37℃保温并搅拌反应，用硅胶薄层层析监测HCl2-His-Gly-NH2二肽基本消失时停止反应。然后，从反应混合物中分离出BOC-Lys-His-Gly-NH2。5.HCl2-Lys-His-Gly-NH2的制备：对上述获得的BOC-Lys-His-Gly-NH2用常规方法去除保护基，例如溶于35毫升4NHCl/HOAC室温反应1.5小时，减压抽干醋酸，加入甲醇100毫升溶解残留物，再次减压抽干甲醇，去除残余HCl，抽干后用少量甲醇溶解，加入乙醚，析出固体，滤集固体，乙醚洗涤，干燥，即可获得2HCl-Lys-His-Gly-NH2。对于获得的2HCl-Lys-His-Gly-NH2，可以直接使用。另外，将其溶解于常规的PBS等缓冲液时，会转化成相应的Lys-His-Gly-NH2。疫苗组合物本发明还提供了一种药物组合物(包括免疫组合物，如疫苗)，它含有安全有效量的本发明三肽囊素作为免疫佐剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如注射剂之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。三肽囊素的给药量是治疗有效量或有效预防量，例如给予猪时，用量为5-20微克/千克体重，更佳地为5-15微克/千克体重。例如，当三肽囊素被用作猪瘟疫苗中免疫佐剂时，其用量可以是按动物体重每公斤使用三肽囊素1-5微克，优选为5微克。当三肽囊素被用作猪蓝耳病苗中免疫佐剂时，其用量可以是按动物体重每公斤使用三肽囊素5-20微克，优选为15微克。本发明的药物组合物可以用常规方式施用于动物。例如，本发明的疫苗采用注射或口服或眼滴或喷雾法给予猪或其它家畜。本发明的主要优点在于：1.本发明的方法所产生的三肽囊素可作为免疫佐剂增加猪瘟或猪蓝耳病疫苗的免疫功能，从而预防和治疗猪瘟或猪蓝耳病。2.本发明的三肽囊素制备方法适合规模化生产，成本低廉，并且可保持活性多肽的光学性质，进而保持活性。本发明所制备三肽囊素质量达高压液相98％纯，质谱测定分子量为339.1，符合理论分子量。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。另外，除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计算。实施例1：酶促合成三肽囊素1.BOC-His(BOC)-OSU制备：称取106.6克BOC-His(BOC)-OH(300毫克分子)溶于500毫升THF中，加入34.5克HOSU(300毫克分子)全部溶解后，盐冰浴冷至-5℃以下，滴加61.8克DCCI的THF溶液，加毕后反应液放置冰箱过夜。次日，滤去DCU固体，滤液减压浓缩至干，加入150毫升热的异丙醇溶解残留物，待冷后加入500毫升正己烷，析出固体，滤集固体，得113.4克，产率83.6％，熔点：66.2-68℃。2.BOC-His(BOC)-Gly-NH2制备：称取112.2克BOC-His(BOC)-OSU(248毫克分子)溶于THF300毫升中，加入27.2克HCl-Gly-NH2(248毫克分子)，混合后慢慢滴加68毫升三乙胺，反应液维持pH7.2左右，室温搅拌反应过夜。次日，减压抽去THF，加入乙酸乙酯500毫升，依次用5％柠檬酸水溶液、5％NaCl水溶液洗至pH中性及5％碳酸钾水溶液100毫升、5％NaCl水溶液洗至pH中性，无水硫酸钠干燥，滤去干燥剂，滤液减压浓缩至小体积，加入石油醚至微混，析出固体，制得BOC-His(BOC)-Gly-NH2，产率65％，熔点78℃。3.HCl2-His-Gly-NH2制备：称取60克BOC-His(BOC)-Gly-NH2加入400毫升4NHCl/HOAC室温反应1.5小时，减压抽干醋酸，加入甲醇100毫升溶解残留物，再次减压抽干甲醇，去除残余HCl，抽干后用少量甲醇溶解，加入乙醚，溶液浑浊，放置得28.2克HCl2-His-Gly-NH2。4.BOC-Lys-His-Gly-NH2酶促合成：称取24.6克BOC-Lys-OH(100毫克分子)和8.14克HCl2-His-Gly-NH2(33毫克分子)溶于100毫升1,4-丁二醇∶水(7∶1)混合溶剂中，并调pH6.5-7.5，分批加入固相化的胰蛋白酶(固相酶与底物重量比为1∶10～1∶20)，于30-37℃保温并搅拌反应，用硅胶薄层层析监测HCl2-His-Gly-NH2二肽基本消失时停止反应，滤去固相酶，滤液加入5％碳酸钾水溶液，并用乙酸乙酯抽提2次，合并乙酸乙酯层，5％NaCl洗至pH中性，无水硫酸钠干燥，滤去干燥剂，乙酸乙酯减压浓缩至小体积，加入正己烷，析出固体，得8.7克，产率60％5.HCl2-Lys-His-Gly-NH2的制备：上述获得的8.7克BOC-Lys-His-Gly-NH2溶于35毫升4NHCl/HOAC室温反应1.5小时，减压抽干醋酸，加入甲醇100毫升溶解残留物，再次减压抽干甲醇，去除残余HCl，抽干后用少量甲醇溶解，加入乙醚，析出固体，滤集固体，乙醚洗2次，干燥，得7.74克，产率95％，熔点188-195℃。6.产物鉴定：⑴.氨基酸组成分析：Lys∶His∶Gly＝0.9∶0.95∶1(表1)。表1三肽囊素氨基酸组成分析结果氨基酸理论值实测值Lys10.90His10.95Gly11⑵.HPLC分析：柱：ZorbaxEclipseXDB-C8(Agilent)4.6×150mmI.D.,5μmparticlesize；鉴定条件：线性AB梯度(从0至30分钟,B是从0至60％,A是从0.1％TFA起，并且洗脱剂B是甲醇)；流速：1毫升/分钟；紫外检测：230nm；温度：室温。结果证明本实施例中成功获得了目的产物。⑶.质谱分析结果符合理论值MW：339.1。实施例2：囊素三肽用于猪瘟和猪蓝耳病疫苗的免疫增强效果一、实验步骤口服给药方式1、动物分组同时断奶仔猪40头(品种、饲养条件一样、体重相近)，随机分成对照组、低剂量组(5ug/kg)、中剂量组15ug/kg、高剂量组30ug/kg，对照组不添加囊素三肽，低剂量组、中剂量组、高剂量组每天分别在饲料或水中按1ug/kg、10ug/kg和30ug/kg剂量添加囊素三肽，连续饲喂7天。按常规免疫程序进行疫苗免疫。2、测定指标(1)猪瘟、蓝耳病抗体消长规律第一周、第三周和第六周采血，分离血清，进行猪瘟和蓝耳病抗体检测。(2)血清IL-2和IL-6含量测定第一周、第三周和第六周采血，分离血清，进行IL-2、IL-6检测。注射给药方式1、动物分组动物分组及测定指标同口服给药方式。在注射猪瘟疫苗和蓝耳病疫苗时，同时注射三肽囊素。注射囊素三肽剂量为：低剂量组(1ug/kg)、中剂量组(5ug/kg)和高剂量组(10ug/kg)。2、测定指标(1)猪瘟、蓝耳病抗体消长规律第一周、第三周和第六周采血，分离血清，进行猪瘟和蓝耳病抗体检测。(2)血清IL-2和IL-6含量测定第一周、第三周和第六周采血，分离血清，进行IL-2、IL-6检测。二、实验结果对IL-2、IL-6检测的结果表明，无论口服方式或注射方式给药，在六周后，猪血清中的IL-2和IL-6水平均有显著的提高。由表2可知:猪在免疫后第7天，饲料中添加30μg/kg三肽囊素组平均阻断率和阳性率均高于其它组，但差异不显著；免疫后第42天，该组猪瘟疫苗平均阻断率和阳性率也高于对照组。说明在饲料中添加三肽囊素可提高猪瘟疫苗的免疫效果。表2囊素三肽对猪瘟疫苗抗体ELISA的平均阻断值和阳性率的影响(口服)由表3可知，注射1μg/kg和5μg/kg剂量的三肽囊素猪从免疫第7天开始血清猪瘟疫苗抗体水平均高于对照组，但10μg/kg剂量组抗体水平低于对照组，且一直保持到试验结束。说明1μg/kg和5μg/kg的三肽囊素可促进猪瘟疫苗的免疫效果，而高剂量(10μg/kg)的三肽囊素抑制了猪对猪瘟疫苗的应答反应。表3囊素三肽对猪瘟疫苗抗体ELISA的平均阻断值和阳性率的影响(注射)由表4可知，口服三肽囊素的猪在免疫第7天低、中剂量组猪蓝耳病疫苗抗体水平高于对照组，且以15μg/kg剂量的三肽囊素效果最好。表4囊素三肽对“猪蓝耳病”疫苗抗体S/P平均值和阳性率的影响(口服)由表5可知，注射三肽囊素的各组猪在免疫第7天阳性率和抗体水平(S/P比值)高于对照组，随后亦在高于对照组范围内波动，直至试验结束。表5囊素三肽对“猪蓝耳病”疫苗抗体S/P平均值和阳性率的影响(注射)实施例3疫苗组合物的配制将三肽囊素应用于猪疫苗佐剂，预防和治疗猪瘟或猪蓝耳病。在实施例2中研究了不同剂量三肽囊素对免疫作用，及机理的影响。在市售的猪瘟疫苗中，按每1000毫升(或1000g)动物疫苗加入100、200、500、或1000微克的三肽囊素，制得4种规格的含三肽囊素的猪瘟疫苗。使用时，按5微克三肽囊素/公斤的剂量施用于猪。结果表明，接种后，三肽囊素可以明显地提高接种猪血清IL-6和IL-2的水平，提示对猪免疫功能的明显促进作用。实施例4三肽囊素对体液免疫起着重要的调节作用1日龄墟岗黄肉鸡母鸡苗202只(佛山墟岗畜牧有限公司)，随机分成4组，每组3个重复，分别为对照组和低、中、高剂量组，每组的给药剂量与给药方式见表6。试验鸡组的免疫按照鸡场大规模养殖的标准操作进行免疫(表7)。鸡群采用网筛笼养，试验期为56天。1－3周采用全日制光照，以后逐渐过度到自然光照。鸡群自由采食、饮水。鸡群健康，用药组体重增加高于对照组。各组的HI-ND抗体滴度见表8，数据表明三肽囊素在低、中剂量使用时免疫增强作用明显，维持时间较长，免疫增强效果在加入囊素肽后比单用囊素抽提液提高14％，同时也提高了机体γ-球蛋白水平(图1)，说明三肽囊素提高了机体体液免疫和细胞免疫水平(图2，3)，在整个养殖过程中，将肉鸡体内新城疫弱毒苗的抗体含量提高28％以上。表6，肌肉注射三肽囊素(BS)的给药剂量与方式表7，试验鸡组的免疫程序表8，墟岗黄鸡血浆HI-ND抗体滴度(平均值±标准误，n＝50，log2)在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3