技术领域本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种基于Diels-Alder反应交联的温控药物释放聚合物微球材料的制备方法。
背景技术：
具有生物降解性能的微球材料可用于药物、蛋白或基因的包埋和释放，目前已广泛用于药物控释、组织工程和再生医学等领域的研究。选择合适的微球体系，可实现药物在体内的缓慢释放，达到理想的治疗效果。天然聚合物具有优异的生物相容性和可调的生物降解性，是制备微球的理想基体材料。常用的多聚糖包括：壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸、纤维素等。在组织工程和再生医学领域，常制备多聚糖微球材料用于包埋细胞生长因子和基因，以提高细胞支架的生物活性，增加支架在体内的组织诱导能力。采用智能化的控释手段，比如通过调节温度来控制药物的释放，可实现细胞生长因子在体内的靶向传递，达到更理想的治疗效果。但是，现有多聚糖微球材料还无法实现细胞生长因子等活性蛋白药物在体内的温控传递。此外，多聚糖微球在制备过程中普遍使用化学交联剂，这容易导致包埋的蛋白药物变性而失活。如能避免使用化学交联剂，则有望得到高生物活性的多聚糖微球材料。文献1(中成药，2014，36(3)：620～622)报道了以辣椒碱提取液为原料，制备了辣椒碱-壳聚糖/海藻酸钠微球，采用因素法优化了制备工艺，并研究了其体外缓释效果。最佳制备工艺条件为：海藻酸钠质量浓度为15g/L、氯化钙用量为4倍辣椒碱海藻酸钠混合液体积、壳聚糖用量为2倍辣椒碱海藻酸钠混合液体积、辣椒碱浓缩液质量浓度为1.49g/L，制备的辣椒碱-壳聚糖/海藻酸钠微球包封率达到43.6％，载药量为18.2mg/g。文献2(解放军药学学报，2012，28(4)：311～314)报道了一种海藻酸钠-壳聚糖微球的合成及其在固定化凝血酶方面的应用，以液体石蜡与司班80的混合溶液为油相，1.5％海藻酸钠溶液为水相，壳聚糖醋酸(1％)溶液中加入适量的氯化钙作为交联剂，采用乳化交联法制备微球。将水相逐滴加入到油相中，搅拌成O/W型乳剂，将交联剂滴加到处于搅拌状态的乳剂中，滴毕继续搅拌30min，离心弃去上层油相，石油醚洗涤下层微球两次后，冷冻干燥。结果显示该微球具有一定的吸附凝血酶的能力。文献3(高分子材料科学与工程，2007，23(1)：189～191)报道了一种磁性壳聚糖微粒材料用于负载5-氟尿嘧啶的研究，采用交联-聚合法，将四氧化三铁颗粒、5-氟尿嘧啶和100mL壳聚糖的醋酸溶液一起剧烈搅拌使其充分混合，然后在超声波的作用下，缓慢滴加到80mL的橄榄油和阴离子分散剂中，随后加入浓度50％的戊二醛溶液为交联剂，在60℃～90℃条件下反应1～2小时，得到了具有磁感应性能的纳米微球，测得其载药量为21.3％，药物包封率为55.4％，30小时内的累积释药率为67.6％。文献4(ActaBiomaterialia，2011，7(8)：3050～3059)报道了一种透明质酸-肝素多聚糖复合微球材料用于运载细胞生长因子的研究，采用反相乳液聚合法，将透明质酸和肝素分别溶于浓度为0.5M的氢氧化钠溶液，分别加入乳化剂并剧烈震荡，随后将两者混合，继续充分震荡下加入化学交联剂二乙烯基砜，室温下剧烈搅拌1小时，最后将反应溶液倒入丙酮中析出多聚糖微球，测得其平均粒径为1微米左右，最高载药浓度为186.6ng/mg。上述多聚糖微球材料的制备方法存在以下缺陷：(1)含有海藻酸钠的微球多采用氯化钙交联。由于在生理条件下，钙离子将不可避免与其它二价离子发生置换，这导致微球极易发生溶解而失去缓释能力。(2)所制备的多聚糖微球依靠材料本身的降解来达到释放药物的目的，这种缓释不能实现有效的控制，难以实现智能传递药物的目的，造成给药效果差。(3)也有微球采用戊二醛或二乙烯基砜等化学试剂进行交联，这些化学交联剂具有细胞毒性，交联过程导致蛋白变性，毒性残留还将产生毒副作用，难以进行临床使用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种温控药物释放聚合物微球材料的制备方法，其采用反相乳液交联技术，通过Diels-Alder反应来交联微球，使微球产生温度敏感性。实现本发明目的的技术解决方案为：一种温控药物释放聚合物微球材料的制备方法，包括以下步骤：步骤1、室温下将壳聚糖溶于乳酸溶液，加入琥珀酸酐，室温下进行反应，将反应溶液透析冻干后得到水溶性琥珀酰壳聚糖；步骤2、室温下将琥珀酰壳聚糖溶解于缓冲溶液中，向溶液中滴加糠胺-2-呋喃甲胺，然后加入碳化二亚胺进行反应，透析冻干后得到呋喃化壳聚糖；步骤3、室温下将海藻酸钠溶于水中，在避光条件下滴加高碘酸钠溶液，反应后透析并冻干得到醛基化海藻酸钠；步骤4、将醛基化海藻酸钠溶于水中，加入4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐反应，透析冻干后得到马来酰亚胺化海藻酸钠；步骤5、分别配制呋喃化壳聚糖水溶液和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液，室温下将所配制的两种溶液按等体积比例充分混合，再将混合后的溶液加入含有乳化剂司班80的石蜡油中，超声乳化得到微球乳化液；步骤6、将乳化液搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出聚合物微球，随后依次分别用异丙醇、正己烷和丙酮进行清洗，最后冷冻干燥得到温控药物释放聚合物微球材料。本发明与现有技术相比，其显著优点在于：(1)聚合物微球的交联基于Diels-Alder反应，不与被包埋活性药物发生化学反应，能有效保护药物的生物活性，特别适用于蛋白类药物的包埋；(2)制备中避免使用了有毒化学交联剂，因此微球中无毒性试剂残留，既保留了多聚糖的天然活性，又保证了微球材料的使用安全性；(3)本发明工艺和设备简单、易行、操作安全，具有制备温度低、固化速度快、处理周期短、对环境不产生污染等优点，适合商业化生产。附图说明图1是本发明方法所制备温控药物释放聚合物微球的结构示意图。图2是不同温度下微球的扫描电子图。图3为微球直径与温度变化的关系曲线图。图4是微球溶胀率与温度变化的关系曲线图。图5是微球在37℃下磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的失重曲线图。图6是改变温度情况下微球的药物释放行为曲线图。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。原料和试剂：壳聚糖、海藻酸钠、高碘酸钠、糠胺-2-呋喃甲胺、水溶性碳化二亚胺(EDC)购于美国Sigma公司；琥珀酸酐，分析纯，中国医药集团；乳酸，分析纯，上海化学试剂有限公司；4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐(MPBH)，购于美国ThermoFisher公司。司班80、分析纯，南京化学试剂有限公司；异丙醇、正己烷、丙酮，分析纯，上海化学试剂有限公司；氯化钠、氯化钾，分析纯，上海试剂三厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，分析纯，杭州化学试剂有限公司。骨形态发生蛋白(BMP-2)和酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，购于美国R&DSystems公司。本发明采用ANOVA方差分析法，显著差异值p设为≤0.05。本发明温控药物释放聚合物微球材料的制备方法，具体包括以下步骤：步骤1、室温下将0.5克的壳聚糖溶于40毫升浓度为5％(v/v)的乳酸溶液，搅拌3小时形成均匀溶液，随后加入1～4倍壳聚糖质量的琥珀酸酐，室温下搅拌12～24小时进行反应，将反应溶液透析冻干后得到水溶性琥珀酰壳聚糖；步骤2、室温下将0.5克的琥珀酰壳聚糖溶解于40毫升磷酸盐缓冲溶液中，向溶液中滴加100～500微升的糠胺-2-呋喃甲胺，然后加入加入1/5～1/2倍琥珀酰壳聚糖质量的碳化二亚胺后室温下搅拌12～24小时进行反应，透析冻干后得到呋喃化壳聚糖；步骤3、室温下将1.0克的海藻酸钠溶于100毫升水中，在避光条件下滴加2～5毫升浓度为0.5M的高碘酸钠溶液，避光条件下搅拌1～4小时，反应后透析并冻干得到醛基化海藻酸钠；步骤4、将1.0克的醛基化海藻酸钠溶于100毫升水中，加入3～12毫升浓度为0.5％的4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐反应，室温下反应0.5～2小时，透析冻干后得到马来酰亚胺化海藻酸钠；步骤5、分别配制呋喃化壳聚糖水溶液和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液，配制的呋喃化壳聚糖水溶液和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液的浓度均为0.5％～2.0％(w/v)，室温下将所配制的两种溶液按等体积比例充分混合，再将混合后的溶液加入含有乳化剂司班80的石蜡油中，所述乳化剂司班80的体积是石蜡油的1/20～1/10，超声乳化2～5分钟得到微球乳化液；步骤6、将乳化液搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出聚合物微球，随后依次分别用异丙醇、正己烷和丙酮进行清洗，最后冷冻干燥得到温控药物释放聚合物微球材料。微球的形貌与粒径检测：将干燥后的微球喷金(Cressington108Auto)，在扫描电子显微镜(FEISIRION100)上观察微观形貌及分析粒径。微球的失重检测：取一定干燥微球称重(W0)，置于37℃下的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中孵育。测试时，将微球从溶液中离心，用蒸馏水和丙酮分别清洗，真空干燥后称重(Wt)，每个样品平行测试5次。计算纳米微球失重的公式为100％×(W0–Wt)/W0，纳米微球保留质量为1–100％×(W0–Wt)/W0。磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取分析纯氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸氢二钠2.9克、磷酸二氢钾0.2克，溶于1000毫升蒸馏水中。药物的负载与释放：将骨形态发生蛋白溶于磷酸盐缓冲液，得到浓度为10微克/毫升的溶液，再将干燥的聚合物微球置于37℃的该溶液中孵育2小时，随后离心取出微球，用磷酸盐缓冲液反复清洗离心三次。进行释放测试时，将吸附蛋白药物的微球置于37℃的磷酸盐缓冲液中，在不同时间点吸取磷酸盐缓冲液，按照酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒标准操作流程执行定量分析。下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但这些实例并不用来限制本发明。实施例1：(1)在40毫升5％(v/v)的乳酸溶液中加入0.5克壳聚糖，室温下搅拌3小时，形成均匀溶液，随后加入2克琥珀酸酐，室温下搅拌24小时，然后将反应溶液透析冻干得到琥珀酰壳聚糖；(2)室温下将0.5克琥珀酰壳聚糖溶解于40毫升缓冲溶液中，然后滴加500微升的糠胺-2-呋喃甲胺，加入0.25克碳化二亚胺后室温下搅拌24小时，透析冻干得到呋喃化壳聚糖(结构示意图见图1)；(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后滴加5毫升浓度为0.5M的高碘酸钠溶液，避光条件下搅拌2小时，透析冻干得到醛基化海藻酸钠；(4)室温下将1.0克醛基化海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入10毫升浓度为0.5％的4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐溶液，室温下反应2小时，透析冻干得到马来酰亚胺化海藻酸钠(结构示意图见图1)；(5)分别配制浓度为0.5％(w/v)的呋喃化壳聚糖和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液，室温下按等体积充分混合，再将其加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积4毫升，超声乳化5分钟；(6)将步骤4得到的乳化液在40℃以1000rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干。所得聚合物微球的形貌见图2，成球性好；较高温度下微球的直径变大，显示出温度响应性。图3为微球直径与温度变化的关系，结果表明微球的直径随温度的升高而增大，比如，37℃下微球的平均粒径为0.72微米，45℃下微球的平均粒径为1.01微米，而60℃下微球的平均粒径增加到1.23微米。图4为微球溶胀率与温度变化的关系，表明微球的溶胀率也随温度的升高而增加，与微球直径随温度变化的结果一致。图5为微球在37℃下磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的失重，表明该微球具有生物降解性，并且降解速度比较稳定。图6为改变温度情况下骨形态发生蛋白从微球中的释放，结果显示在较高温度下(45℃)微球发生溶胀而导致释放速率增大，表明该材料是具有较好的温控释药性能。实施例2：(1)在40毫升5％(v/v)的乳酸溶液中加入0.5克壳聚糖，室温下搅拌3小时，形成均匀溶液，随后加入1.5克琥珀酸酐，室温下搅拌20小时，然后将反应溶液透析冻干得到琥珀酰壳聚糖；(2)室温下将0.5克琥珀酰壳聚糖溶解于40毫升缓冲溶液中，然后滴加400微升的糠胺-2-呋喃甲胺，加入0.2克碳化二亚胺后室温下搅拌20小时，透析冻干得到呋喃化壳聚糖；(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后滴加4.5毫升浓度为0.5M的高碘酸钠溶液，避光条件下搅拌3小时，透析冻干得到醛基化海藻酸钠；(4)室温下将1.0克醛基化海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入12毫升浓度为0.5％的4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐溶液，室温下反应1.8小时，透析冻干得到马来酰亚胺化海藻酸钠；(5)分别配制浓度为0.6％(w/v)的呋喃化壳聚糖和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液，室温下按等体积充分混合，再将其加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积3毫升，超声乳化4分钟；(6)将乳化液在40℃以800rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干。实施例3：(1)在40毫升5％(v/v)的乳酸溶液中加入0.5克壳聚糖，室温下搅拌3小时，形成均匀溶液，随后加入1.0克琥珀酸酐，室温下搅拌16小时，然后将反应溶液透析冻干得到琥珀酰壳聚糖；(2)室温下将0.5克琥珀酰壳聚糖溶解于40毫升缓冲溶液中，然后滴加350微升的糠胺-2-呋喃甲胺，加入0.15克碳化二亚胺后室温下搅拌18小时，透析冻干得到呋喃化壳聚糖；(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后滴加4毫升浓度为0.5M的高碘酸钠溶液，避光条件下搅拌4小时，透析冻干得到醛基化海藻酸钠；(4)室温下将1.0克醛基化海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入8毫升浓度为0.5％的4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐溶液，室温下反应1.5小时，透析冻干得到马来酰亚胺化海藻酸钠；(5)分别配制浓度为0.8％的呋喃化壳聚糖和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液，室温下按等体积充分混合，再将其加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积3毫升，超声乳化4分钟；(6)将乳化液在40℃以900rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干。实施例4：(1)在40毫升5％(v/v)的乳酸溶液中加入0.5克壳聚糖，室温下搅拌3小时，形成均匀溶液，随后加入0.5克琥珀酸酐，室温下搅拌12小时，然后将反应溶液透析冻干得到琥珀酰壳聚糖；(2)室温下将0.5克琥珀酰壳聚糖溶解于40毫升缓冲溶液中，然后滴加300微升的糠胺-2-呋喃甲胺，加入0.12克碳化二亚胺后室温下搅拌15小时，透析冻干得到呋喃化壳聚糖；(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后滴加3.5毫升浓度为0.5M的高碘酸钠溶液，避光条件下搅拌1小时，透析冻干得到醛基化海藻酸钠；(4)室温下将1.0克醛基化海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入5毫升浓度为0.5％的4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐溶液，室温下反应1.5小时，透析冻干得到马来酰亚胺化海藻酸钠；(5)分别配制浓度为1.0％(w/v)的呋喃化壳聚糖和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液，室温下按等体积充分混合，再将其加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积3毫升，超声乳化3分钟；(6)将乳化液在40℃以1100rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干。实施例5：(1)在40毫升5％(v/v)的乳酸溶液中加入0.5克壳聚糖，室温下搅拌3小时，形成均匀溶液，随后加入1.5克琥珀酸酐，室温下搅拌14小时，然后将反应溶液透析冻干得到琥珀酰壳聚糖；(2)室温下将0.5克琥珀酰壳聚糖溶解于40毫升缓冲溶液中，然后滴加200微升的糠胺-2-呋喃甲胺，加入0.1克碳化二亚胺后室温下搅拌12小时，透析冻干得到呋喃化壳聚糖；(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后滴加3毫升浓度为0.5M的高碘酸钠溶液，避光条件下搅拌2小时，透析冻干得到醛基化海藻酸钠；(4)室温下将1.0克醛基化海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入3毫升浓度为0.5％的4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐溶液，室温下反应1小时，透析冻干得到马来酰亚胺化海藻酸钠；(5)分别配制浓度为1.5％(w/v)的呋喃化壳聚糖和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液，室温下按等体积充分混合，再将其加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积2毫升，超声乳化3分钟；(6)将乳化液在40℃以1200rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干。实施例6：(1)在40毫升5％(v/v)的乳酸溶液中加入0.5克壳聚糖，室温下搅拌3小时，形成均匀溶液，随后加入2.0克琥珀酸酐，室温下搅拌20小时，然后将反应溶液透析冻干得到琥珀酰壳聚糖；(2)室温下将0.5克琥珀酰壳聚糖溶解于40毫升缓冲溶液中，然后滴加100微升的糠胺-2-呋喃甲胺，加入0.18克碳化二亚胺后室温下搅拌12小时，透析冻干得到呋喃化壳聚糖；(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后滴加2毫升浓度为0.5M的高碘酸钠溶液，避光条件下搅拌3小时，透析冻干得到醛基化海藻酸钠；(4)室温下将1.0克醛基化海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入6毫升浓度为0.5％的4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸盐溶液，室温下反应0.5小时，透析冻干得到马来酰亚胺化海藻酸钠；(5)分别配制浓度为2％(w/v)的呋喃化壳聚糖和马来酰亚胺化海藻酸钠水溶液，室温下按等体积充分混合，再将其加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积2毫升，超声乳化2分钟；(6)将乳化液在40℃以1500rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干。以上实施例涵盖了最具代表性的实验数据。综上所述，本发明温控药物释放聚合物微球材料的制备方法，提供了一种制备智能传递药物材料的手段。以天然聚合物壳聚糖和海藻酸钠为基体材料，采用反相乳液交联技术，通过分子间交联作用，得到了结构稳定的温敏聚合物微球材料。本发明采用Diels-Alder反应交联微球，从而可通过温度来控制药物从微球的释放，另外制备工艺避免使用了有毒化学交联剂，保留了天然聚合物及被包埋药物的生物活性，显著改善了微球材料的安全使用性。本发明工艺和设备简单、操作安全易行，具有制备温度低、固化速度快、处理周期短等优点，在药物控释和基因治疗方面有应用价值。