含有丁基吡啶鎓或其衍生物的用于预防或治疗与肌无力有关的疾病的药物组合物的制作方法

本发明涉及：用于促进成肌细胞分化的组合物，该组合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐；用于预防或治疗与肌无力有关的疾病的药物组合物；用于预防或缓解与肌无力有关的疾病的食品组合物；用于强化肌肉的组合物；以及用于强化肌肉的饲料或饲料添加剂。

此外，本发明涉及：使用丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐用于促进成肌细胞分化的方法；用于制备分化的成肌细胞的方法；以及用于治疗与肌无力有关的疾病的方法。

背景技术：

引起肌无力的疾病包括：随着老龄化而发展的少肌症；由蛋白质代谢失衡和肌肉使用减少引起的肌肉萎缩症；和随着饥饿、衰竭性疾病(癌症等)和老龄化而发展的心萎缩症。

少肌症是指随着老龄化过程中由于骨骼肌质量下降而引起的肌肉强度的下降。作为少肌症的最重要特性的骨骼肌质量下降会与另外在肌纤维类型方面的变化同时被观察到。1型和2型肌纤维的直径随着老龄化的进行以相似速率减少，而在少肌症下，2型肌纤维的直径不会明显改变，但1型肌纤维的直径显著减小。据报道，少肌症引起在老年人当中出现的衰老和功能障碍。

少肌症是由多种因素造成的，但关于每个因素的研究仍在进展中。少肌症是由生长激素水平的降低或神经变化、生理活性变化、代谢变化、性激素或脂肪和分解代谢的细胞因子的量增加以及蛋白质合成和降解的平衡变化诱导的。已知骨骼肌质量下降(其为少肌症的最显著特征)的最重要原因是卫星细胞活化的降低。卫星细胞是位于肌纤维的肌纤维膜和基底膜之间的小单核细胞。这些卫星细胞通过刺激(例如损伤或锻炼)被活化并增殖作为成肌细胞，而随着分化的发展，它们与其他细胞融合以形成多核肌纤维。因此，当使卫星细胞活化降低时，使受损的肌肉再生的能力或对分化信号的响应能力降低，从而导致肌肉形成减少。

肌肉萎缩症是由营养缺乏或长时间的身体不活动造成的，并且其通过由于蛋白质合成和降解之间的平衡破坏而发生的蛋白质降解来指示。

另一方面，心萎缩是由饥饿、衰竭性疾病(癌症等)以及衰老引起的，心肌纤维变得更薄，并且细胞核变浓并表现出红细胞大小不均。因此，肌束的体积减小，心脏总体变小，心外膜脂肪组织的尺寸明显下降，且冠状动脉变弯。可消耗的色素(脂褐质)作为棕色色素出现在心肌纤维的细胞核的两端，且随着脂肪组织的减少，整个心脏显示褐色。

针对少肌症的治疗方法包括三种方法。第一种方法是锻炼。锻炼会在短期内改善骨骼肌肉的蛋白质合成能力，且据报道会提高老年人的肌肉强度和移动性。然而，锻炼不适合作为长期治疗方法。第二种方法作为药物治疗，是给药睾酮或合成代谢类固醇，但这引起女性的男性化，和对男性的副作用例如可能发生前列腺症状。对于其它经批准的方法，可用脱氢表雄酮(DHEA)和生长激素，且研究报道可以在包括选择性雄激素受体调节剂(SARM)的区域将这些用作治疗方法(D.D.Thompson,J.Musculoskelet Neuronal Interact 7,344-345,2007)。具体地，尽管已知节食作为一种治疗方法，但根据营养评定，营养不良和现代的饮食习惯对于保持适当的总体重是不恰当的。

近来，干细胞治疗(其中卫星细胞在体外被分离并分化使得将它们引入体内)以及用于直接在体内活化卫星细胞以促进肌生成从而维持或强化肌肉的方法，正被强调作为用于治疗肌无力例如少肌症的可能治疗方法(Shihuan Kuang和Michael A.Rudnicki,Trends in Molecular Medicine 14,82-31,2008)。

因此，为了治疗与肌无力有关的疾病，作为没有副作用的更加根本性的方法，需要用于分化成肌细胞的方法，因此，能够促进成肌细胞分化的物质的开发是高度必要的。

技术实现要素：

技术问题

本发明人致力于开发一种用于治疗与肌无力有关的疾病的药物，该药物增加骨骼肌肉质量并有效地恢复肌肉功能，因此，通过验证包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐的组合物能够促进成肌细胞分化从而预防或治疗与肌无力有关的疾病而完成本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供一种用于促进成肌细胞分化的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于促进成肌细胞分化的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于制备分化的成肌细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗与肌无力有关的疾病的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或缓解与肌无力有关的疾病的食品组合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于强化肌肉的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于强化肌肉的饲料或饲料添加剂。

本发明的另一个目的是提供一种用于治疗与肌无力有关的疾病的方法。

有益效果

根据本发明，丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐促进成肌细胞分化并能够形成肌管从而预防肌无力，并能够有效地改善肌肉功能。因此，包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐的药物组合物能够有效地用于预防或治疗与肌无力有关的疾病。

附图说明

图1示出了在相差显微镜下验证用丁基吡啶鎓氯化物及其衍生物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物处理过的C2C12成肌细胞系的分化的结果。

图2示出了通过免疫细胞化学法验证用丁基吡啶鎓氯化物及其衍生物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物处理过的C2C12成肌细胞系的分化的结果。

图3示出了通过Western印迹法验证在用乙基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十六烷基吡啶鎓溴化物处理过的C2C12成肌细胞系中的肌球蛋白重链3(MYH3)的表达的结果。

图4示出了在肌肉固定周期前后由于丁基吡啶鎓氯化物的处理引起的小鼠的握力改善效果的对比。

图5示出了在肌肉固定周期前后由于丁基吡啶鎓氯化物的处理引起的小鼠的平衡能力改善效果的对比。

图6示出了在肌肉固定周期前后由于丁基吡啶鎓氯化物的处理引起的小鼠的耐力改善效果的对比。

图7示出了在肌肉固定周期前后由于十六烷基吡啶鎓氯化物的处理引起的小鼠的握力改善效果的对比。

图8示出了在肌肉固定周期前后由于十六烷基吡啶鎓氯化物的处理引起的小鼠的平衡能力改善效果的对比。

图9示出了在肌肉固定周期前后由于十六烷基吡啶鎓氯化物的处理引起的小鼠的耐力改善效果的对比。

具体实施方式

作为实现上述目的的一个方面，本发明的一个示例性实施方式涉及一种用于促进成肌细胞分化的组合物，该组合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐，且丁基吡啶鎓如下面的式1中所示。

[式1]

如在本文中所使用的，术语“衍生物”是指通过向丁基吡啶鎓引入官能团或取代、氧化或还原丁基吡啶鎓的官能团等而在使得母体化合物的结构和性质不会明显改变的程度上改变的化合物。例如，键合到丁基吡啶鎓的含有4个碳原子的烷基可以被含有4个或更多个碳原子的烷基的官能团取代。具体地，它可以被含有4至16个碳原子的官能团、更具体地含有4、12或16个碳原子的官能团取代，但不限于此。

具体地，该衍生物可以是被具有12个碳原子的烷基取代的十二烷基吡啶鎓，如下面的式2中所示。

[式2]

此外，该衍生物可以是被具有16个碳原子的烷基取代的十六烷基吡啶鎓，如下面的式3中所示。

[式3]

十六烷基吡啶鎓的国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)名称是1-十六烷基吡啶鎓，且它可以与盐酸、溴等反应而以盐的形式存在，例如十六烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓溴化物等，但不限于此。

在本发明中，作为丁基吡啶鎓的衍生物的“十六烷基吡啶鎓”是以十六烷基吡啶鎓氯化物的形式，且已知其通过杀灭口腔内的有害细菌而表现出优秀的对抗牙周疾病的作用，但是尚未知晓它与成肌细胞分化有关。此外，尚未知晓丁基吡啶鎓、十二烷基吡啶鎓等与成肌细胞的分化有关。因此，本发明人首次研究了丁基吡啶鎓、其衍生物，或其药学上可接受的盐具有使成肌细胞分化的作用，从而完成了本发明。

如在本文中所使用，术语“药学上可接受的盐”是指当给药给有机体时不会引起严重刺激且不会损害化合物的生物活性和性质的化合物制剂。药物盐可以包括形成包含药学上可接受的阴离子的无毒酸加成盐的酸，例如，通过由无机酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸等；由有机羧酸，例如酒石酸、甲酸、柠檬酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、葡糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸、水杨酸等；通过由磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等形成的酸加成盐。例如，药学上可接受的羧酸盐可以包括由锂、钠、钾、钙或镁等形成的金属盐或碱土金属盐；氨基酸盐，例如赖氨酸、精氨酸或胍等；和有机盐，例如二环己基胺、N-甲基-D-葡糖胺、三(羟甲基)甲胺、二乙醇胺、胆碱和三乙胺等。

作为本发明的具体的示例性实施方式，盐可以是丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓溴化物、十二烷基吡啶鎓溴化物或十六烷基吡啶鎓溴化物，但不限于此。

如在本文中所使用，术语“成肌细胞分化”是单核的成肌细胞通过融合形成多核肌管的过程。与肌肉前体细胞对应的成肌细胞在自我更新的情况下表达Pax7⁺标记物，而在增殖的情况下表达Pax7⁺/MyoD⁺标记物。处于形成肌管的分化阶段的细胞可以通过使用Pax7^-MyoD⁺MyoG⁺标记物来进行区分。处于形成肌管的分化初始阶段的细胞表现出肌原性转录因子例如MyoD的表达增加，而在中间阶段，肌细胞生成素表达增加。在当分化几乎完成的后期阶段，肌球蛋白重链(MyHC)表达增加。

具体地，本发明的一个示例性实施方式涉及一种用于促进成肌细胞分化的组合物，该组合物包括浓度在0.001μM到5.0μM范围内的丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐。该组合物可以是包括马血清的用于分化的DMEM培养基，但可包括培养基或能够促进成肌细胞分化的组合物，而没有限制。更具体地，该组合物可包括浓度在0.005μM到2.5μM、最具体地0.01μM到0.5μM范围内的丁基吡啶鎓、其衍生物或药学上可接受的盐。此外，该组合物还可以括细胞培养或分化所需的另外的材料。

当所包括的丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐的浓度低于0.001μM时，可能由于低浓度而使分化促进效果下降，而当其浓度超过5.0μM时，可能引起毒性。

本发明的另一示例性实施方式是用于促进成肌细胞分化的方法，所述方法包括用丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐来处理成肌细胞。丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐如上所述。具体地，用于促进成肌细胞分化的方法可以通过用十六烷基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐在体外或体内处理成肌细胞来促进分化。

本发明的另一个示例性实施方式提供了用于制备分化的成肌细胞的方法，所述方法包括用丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐来处理成肌细胞以使成肌细胞分化。

丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐如上所述。本发明的方法的特征在于，通过用丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐在体外或体内处理成肌细胞来制备分化的成肌细胞。

在本发明的一个实施例中，在用浓度为0.2μM的十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物的每一个处理成肌细胞后，在相差显微镜下观察分化的程度，验证了与负对照组(DMSO)相比，促进了分化，从而形成了很多肌管(图1)，并且通过免疫细胞化学法和Western印迹法验证了促进肌细胞分化的效果非常高(图2和图3)。

因此，本发明能够形成肌管并制备在体外或体内表达MYH3蛋白的分化的成肌细胞。

本发明的另一个示例性实施方式涉及用于预防或治疗与肌无力有关的疾病的药物组合物，该药物组合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐。丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐的浓度如上所述。

如在本文中所使用，术语“肌无力”是指一种或多种肌肉的强度降低的情况。肌无力可限于任何一种肌肉、身体的一侧、上肢或下肢等，或其可能表现在整个身体中。此外，肌无力的自觉症状例如肌肉疲劳或肌肉疼痛可以通过经体检的客观方法来量化。

与在本发明中的肌无力有关的疾病是指由肌无力引起的任何疾病，并且可以是，例如，少肌症、肌肉萎缩症、肌肉营养不良症或心萎缩症，但不限于此。

因此，本发明的组合物可以用于通过促进成肌细胞分化来预防或治疗少肌症、肌肉萎缩症、肌肉营养不良症或心萎缩症。

具体地，本发明的少肌症是指直接导致肌肉强度降低的骨骼肌质量的逐渐减少，因此，它是指可能发生各种身体功能下降或紊乱的状况。

此外，肌肉萎缩症是指肢体的肌肉几乎对称地持续收缩从而使脊髓中的运动神经纤维和细胞的逐渐劣化，并由此引起肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和脊髓性进行性肌萎缩(SPMA)的状况。

肌肉营养不良症是表现出进行性肌肉萎缩和肌无力的疾病，在病理上，它是指由肌纤维坏死为特征的退行性肌病。在经历了由于对肌细胞膜的损伤引起的肌纤维坏死和退化的过程之后发生肌无力和肌肉萎缩症。

本发明的心萎缩症是指由于外部因素或内部因素、以及由于饥饿、衰竭性疾病或衰老、心肌纤维变得更瘦和更薄引起的心脏萎缩，且它可能导致脂肪组织减少并引起显现褐色的心脏萎缩的症状。

如在本文中使用，术语“预防”是指通过给药组合物来抑制与肌无力有关的疾病或延迟发病的任何行为。

如在本文中使用，术语“治疗”是指通过给药组合物来改善或缓解与肌无力有关的症状的任何行为。

用于给药的本发明的药物组合物包含丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐，具体为丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓溴化物、十二烷基吡啶鎓溴化物或十六烷基吡啶鎓溴化物，或药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂和稀释剂可以是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶无定形纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

本发明的药物组合物可以使用本领域中公知的方法来制备为药物制剂，以提供丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐的快速释放、持续释放或延迟释放。在制剂的制备中，期望将活性成分用载体混合或稀释，或将活性成分以容器的形状包裹在载体中。

此外，本发明的药物组合物可用作任何制剂，但期望将其制备用于肠胃外使用。肠胃外制剂可以是以用于注射、外用的形式或以喷雾形式例如气溶胶。

用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮剂、乳剂、冻干药物和栓剂。对于作为悬浮剂的非水溶剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，以及可注射的酯例如油酸乙酯。

为了配制成注射制剂，可以将丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐与在水中的缓冲液或稳定剂混合以制备成为溶液或悬浮剂，且也可以将其制备成作为安瓿或小瓶中的单位剂量使用。

包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐的本发明的药物组合物，可以被直接给药至具有与肌无力有关的疾病的受试者或处于该疾病的发作风险中的受试者的部位；或在通过将该组合物施用至体外或体内的成肌细胞而制备了分化的成肌细胞之后，可将分化的成肌细胞给药至具有与肌无力有关的疾病的受试者或处于该疾病的发作风险中的受试者的需要强化肌肉的部位。

此外，该组合物可以包括附加成分，例如已知作为治疗与肌无力有关的疾病的药物的化合物，其中丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐不会干扰对与肌无力有关的疾病的预防或治疗。

具体地，本发明的药物组合物的特征在于促进成肌细胞的分化。在本发明的一个实施例中，在用浓度为0.2μM的十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物的每一个处理成肌细胞后，在相差显微镜下观察分化程度，并验证了与负对照组(DMSO)相比，促进了分化，从而形成了很多肌管(图1)，并且通过免疫细胞化学法和Western印迹法证实了对肌肉细胞的分化的促进效果非常高(图2和图3)。此外，将胫骨前肌肌肉固定3天(肌肉固定)，从而诱导肌肉损伤。之后，将肌肉从固定化释放并使其再生。七天后，通过在给药了十六烷基吡啶鎓氯化物的实验组中进行同样的运动能力改善实验，证实了与对照组相比，握力的下降范围降低(图4)，保持平衡感的运动能力得以改善(图5)，且耐力得以改善(图6)。

通过这些结果，显示丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐有效促进成肌细胞的分化，并且它对于预防或治疗与肌无力有关的疾病是有用的。

本发明的另一个示例性实施方式涉及一种用于预防或缓解与肌无力有关的疾病的食品组合物，该食品组合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或营养学上可接受的盐。本发明的组合物可以与治疗该疾病的另一种药物在相同的时间或间隔开的时间下用于预防或缓解与肌无力有关的疾病(在该疾病的发展之前或在该疾病发作后)。丁基吡啶鎓、其衍生物或其营养学上可接受的盐的浓度如上所述。

与肌无力有关的疾病是指可由肌无力引起的所有疾病，例如，少肌症、肌肉萎缩症、肌肉营养不良症或心萎缩症，但不限于此。优选地，该食品组合物的特征是促进成肌细胞的分化。

如在本文中所使用，术语“缓解”是指例如至少降低了与被治疗的病症有关的参数，例如降低了症状的严重程度的所有行为。

而且，当将本发明的食品组合物用作食品添加剂时，可以将该组合物直接加入或与其它食品或食品成分一起使用，并且可以根据传统方法适当使用。通常，在食品或饮料的制造过程中，可以相对于原料以小于15重量％、优选地小于10重量％的量加入本发明的组合物。然而，出于健康和卫生目的，或者在长期摄取用于控制健康目的的情况下，所述量可以小于该范围，并且由于在安全性方面不存在问题，因此活性成分可以以超过该范围的量被使用。

对食品的类型没有任何特别限制。可以包括该组合物的食品的例子包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、糖食、比萨饼、拉面、其它面条、口香糖、包括冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料和维生素复合物等，包括所有传统意义上的健康食品。

本发明的健康饮料组合物可以包括另外的成分，例如各种香料或天然糖类。上述天然糖类可以是单糖例如葡萄糖和果糖，二糖例如麦芽糖和蔗糖，和天然甜味剂例如糊精和环糊精；和合成的甜味剂例如糖精，阿斯巴甜等。天然糖类的比例可以由本领域的技术人员适当确定。

除上述之外，本发明的组合物可以包括各种营养增补剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、在碳酸饮料中使用的充二氧化碳剂等。本发明的其它组合物可以包括用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的水果块。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域技术人员适当确定。

本发明的另一示例性实施方式涉及一种用于强化肌肉的组合物，该组合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐。

此外，本发明的另一个示例性实施方式涉及一种用于强化肌肉的组合物，该组合物包括丁基吡啶鎓、其衍生物、或其营养学上可接受的盐。

如在本文中所使用，术语“肌肉强化”意指增强身体性能、增强最大耐力、增加骨骼肌质量、增强肌肉恢复、降低肌肉疲劳、改善能量平衡或它们的任意组合效果。

本发明的用于强化肌肉的组合物包括能够通过其将成肌细胞分化为肌细胞的能力增加总的骨骼肌肉质量的丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上或营养学上可接受的盐，该组合物增加了骨骼肌肉质量并能够增强最大耐力，从而增强人体性能并降低肌肉疲劳。此外，由于肌细胞可以被迅速更换，所以肌肉损伤可以很快痊愈。

为了给药本发明的用于强化肌肉的组合物，除了丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上或其营养学上可接受的盐以外，用于强化肌肉的组合物可以包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂如上所述。

另外，本发明的用于强化肌肉的组合物可以以食品组合物或食品添加剂的形式来制备，特别是以健康食品组合物的形式。因此，本发明的用于强化肌肉的组合物，不仅可以用于由于老龄化造成的肌肉减少，而且可以以用于肌肉形成和肌肉强化的增补剂的形式用于正常个体等。

在本发明的一个示例中，通过用十六烷基吡啶鎓氯化物和丁基吡啶鎓氯化物来处理小鼠，然后进行握力试验、转棒试验和跑步机试验，通过证实改善肌肉强度而验证了组合物能够用于强化肌肉。

本发明的另一示例性实施方式涉及一种用于强化肌肉的饲料或饲料添加剂，其包括丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐。

如在本文中所用，术语“饲料”是指供应维持动物生命所必需的有机或无机营养素的物质。饲料可以供应动物例如家畜所必需的能量和营养素，例如蛋白质、脂类、维生素、矿物质等；并可以是植物类饲料，例如谷物、坚果、食品副产品、藻类、纤维、脂肪和油、淀粉、粗粉、谷物副产品等；或可以是动物类饲料，例如蛋白质、无机物质、脂肪和油、矿物质、单细胞蛋白质等，但并不限于此。

如在本文中所使用的，术语“饲料添加剂”是指添加到饲料中以改善生产率和动物健康的物质，具体地，尽管不限于此，但其可以另外包括氨基酸、维生素、酶、调味剂、硅酸盐剂、缓冲剂、萃取剂、寡糖等。

在用于强化肌肉的饲料或饲料添加剂中包括的丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐的含量可以是在0.001％(w/w)到1％(w/w)、具体地0.005％(w/w)到0.9％(w/w)、且更具体地0.01％(w/w)到0.5％(w/w)的范围内，但并不特别地限于此。

本发明的另一示例性实施方式涉及一种用于治疗与肌无力有关的疾病的方法，该方法包括将丁基吡啶鎓、其衍生物或其药学上可接受的盐给药至需要其的受试者。

与肌无力有关的疾病是指可能由肌无力引起的所有疾病，且可以是例如少肌症、肌肉萎缩症、肌肉营养不良症或心萎缩症，但不限于此。

实施例

在下文中，将根据示例性实施方式来更详细地描述本发明。然而，在本文中公开的示例性实施方式仅用于说明的目的，而不应该被解释为限制本发明的范围。

实施例1.C2C12成肌细胞系的培养

C2C12是从C3H品种活老鼠中获得的成肌细胞的细胞系，它广泛用于成肌细胞的分化研究中。

将上述C2C12细胞在用于细胞生长的一般培养基和用于分化的培养基中的每个中培养。在正常细胞生长培养基(GM)中，使用补充有10％胎牛血清的DMEM；而在分化培养基(DM)中，使用包含2％马血清的DMEM。

实施例2.成肌细胞的分化

在将细胞在细胞培养基中分装并培养24小时后，将经培养的细胞分别用DMSO、十六烷基吡啶鎓氯化物(0.2μM)、丁基吡啶鎓氯化物(0.2μM)和十二烷基吡啶鎓氯化物(0.2μM)在各个分化培养基中处理，然后诱导分化3天。在实验中使用的DMSO、十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物均购自Sigma-Aldrich。

实施例3.通过丁基吡啶鎓氯化物或其衍生物促进成肌细胞分化(体外)

3-1.相差显微镜

为了通过用丁基吡啶鎓氯化物及其衍生物(即，十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物)中的每个处理成肌细胞来验证许多肌管的形成，将在涂有0.1％明胶的盖玻片上的C2C12细胞分化3天，同时用浓度为0.2μM的DMSO(一种药物载体)、丁基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每个处理，并在相差显微镜下进行观察。根据实验结果，与作为对照组的DMSO相比，当用丁基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物、和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每个处理时，形成更多的肌管，从而验证了分化促进效果(×100)(图1)。

3-2.免疫细胞化学法

将在涂有0.1％明胶的盖玻片上的C2C12细胞分化为3天。将细胞用1X PBS洗涤后，在室温下用3.7％多聚甲醛固定15分钟，并用1X PBS洗涤3次，加入透化缓冲液，并使细胞在室温下反应15分钟。将细胞用1X PBS再次洗涤三次后，使细胞与含有1％BSA的PBST(封闭缓冲液，含有0.5％吐温20的PBS)反应30分钟以阻止抗体的任何非特异性结合。将针对MYH3(SC-20641,Santa Cruz Biotechnology)的一级抗体通过以1:500的比例稀释而加入到封闭缓冲液中，并使其在室温下反应1小时。在将细胞用1X PBS洗涤三次后，将在封闭缓冲液中以1:5000的比例稀释的二级抗体(山羊抗兔IgG-HRP)加入其中并使其在室温下反应1小时，并且将细胞用1X PBS洗涤三次。将盖玻片放在载玻片上，用荧光显微镜拍照，并分析结果。

在本发明中，在用DMSO(负对照组)、丁基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每个处理以诱导C2C12细胞系的分化后，在第三天，为了比较成肌细胞的分化程度，用针对MYH3的抗体染色后，验证了蛋白的表达。其结果是，验证了在用浓度为0.2μM的丁基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每个处理后MYH3的表达非常高。

3-3.Western印迹法

在将C2C12细胞分装在培养基中并培养24小时后，每天将浓度为0.2μM的DMSO(对照组)、乙基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十六烷基吡啶鎓溴化物施加到每个培养基，并诱导分化。在分化第三天收集细胞并将其在1200rpm下离心分离3分钟。在向细胞中加入100μL裂解缓冲液后，将细胞进行超声处理，并在3000rpm下离心分离10分钟，得到水溶性蛋白质，并且在加入4X样品缓冲液后，使细胞在沸水中反应5分钟。

将10μg蛋白质装载到12％SDS-PAGE凝胶上并显影，然后将其转移到硝酸纤维素膜上。在室温下将硝酸纤维素膜在5％的脱脂乳中封闭1小时，并用TTBS(0.03％吐温20、Tris 2.42g、NaCl 9g，pH值7.4，1L)洗涤5次，每次5分钟。将一级抗体在含有5％脱脂乳的TTBS中以1:500的比例稀释并将其加入到硝酸纤维素膜中，并且在室温下反应2小时后，将硝酸纤维素膜再次用TTBS洗涤5次，每次5分钟。再将二级抗体在含有5％脱脂乳的TTBS中以1:5000的比例稀释并将其加入，在室温下反应2小时后，用TTBS洗涤5次，每次5分钟，并加入ECL(增强化学发光溶液，Pierce)。然后，将该膜暴露于X-射线膜，并测定蛋白的量。

作为上述实验的结果，验证了在用十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物中的每个处理过的组中，在相同量的蛋白中所含的MYH3蛋白的量显著增加。由于DMSO处理，在对照组中的MYH3表达不明显，但通过十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物使MYH3表达增加。此外，当用十六烷基吡啶鎓溴化物处理时，验证了使MYH3表达增加(图3)。

这表明通过十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物和十二烷基吡啶鎓氯化物使在相同量的蛋白中所含的肌球蛋白的量快速增加，且发现丁基吡啶鎓氯化物、十二烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物和十六烷基吡啶鎓溴化物对成肌细胞的分化的促进效果非常高。

然而，不同于其它衍生物，在乙基吡啶鎓氯化物(作为丁基吡啶鎓氯化物的衍生物之一并且具有两个碳骨架)的情况下，MYH3的蛋白没有增加。从这个结果发现，在丁基吡啶鎓的衍生物中，只有具有四个或更多个碳骨架的衍生物是有效的。

实施例4.在给药丁基吡啶鎓氯化物后通过肌肉再生来验证动物运动能力的改善

作为实验动物，使用20只6周龄的C57BL/6雄性小鼠。将实验动物分为两组：对照组，被分配有具有相似重量的10只小鼠，不给药；和实验组，被分配有具有相似重量的10只小鼠，给药丁基吡啶鎓氯化物。

将丁基吡啶鎓氯化物溶解在蒸馏水中以制备成15mg/kg的浓度，并将其口服给药至实验组中的小鼠。在以下所述的肌肉固定时段也连续给药。

在该实验中，作为用于在小鼠中诱导肌肉再生的方法，使用胫骨前肌肌肉固定化方案。在该方法中，使用医用钉将小鼠的一条腿的大腿和小腿固定使得将腿固定化，在将固定化的小鼠单独放置3天后，将被固定的腿松开。在此方法中使用的原理是，当将腿放置在固定用敷料中并将腿的肌肉固定化(即，不频繁使用)时，肌肉损失。它是用于诱导肌肉再生的方法，其中，在由于将胫骨肌肉固定化而造成肌肉损失后，通过将固定化的肌肉松开使得肌肉可再次运动来使肌肉再生。在该实验中，通过将胫骨前肌肌肉固定化3天(肌肉固定化)来诱导肌肉损伤，并通过将肌肉再次松开而使得肌肉得以再生，且在7天后，进行了同样的运动能力改善试验。

4-1.握力试验

使用BIOSEB公司制造的握力测量仪器来测量握力。将小鼠放置在与仪器面板(能够监测力的强度)附接的金属丝网上，在将尾巴向下夹紧的同时测量小鼠握住金属丝网的力。使用在连续重复试验五次后得到的平均值。

作为握力的测量结果，验证了与对照组相比，在给药了丁基吡啶鎓氯化物的实验组中，使肌肉固定化后的握力下降的范围减小(图4)。

4-2.转棒试验

使用包括6个分区(直径为7cm，以15cm的间隔)的转棒装置和可旋转圆柱棒(高度为60cm)来实施锻炼。以10rpm的旋转速度开始并历时5分钟加速到至多40rpm的速度，测定小鼠没有从转棒跌落并保持在转棒上的时间。在将使小鼠休息15分钟并使小鼠锻炼的过程重复3次后测量所显示的平均值。

作为转棒测量的结果，验证了与对照组相比，在肌肉固定化后给药了丁基吡啶鎓氯化物的实验组中用以保持平衡感的运动能力得以改善(图5)。

4-3.跑步机试验

对于在本试验中使用的跑步机，使用了自制造装置。在将每只小鼠放置在单独的跑道中并使其跑动后，记录从起点到小鼠筋疲力尽(即，判断为不想跑动)的点的时间。如果小鼠没有跑而停留在跑道外的时间为10秒以上，则判断小鼠筋疲力尽，并且记录该时间。在该实验中，不能对同一小鼠进行重复实验。将小鼠放置在装置上并使得其以8rpm的速度跑动，每10分钟加速2rpm直到18rpm的速度，并从没有倾角开始，每30分钟将倾角增加5度。

作为跑步机测量的结果，与对照组相比，在给药了丁基吡啶鎓氯化物的实验组中，肌肉固定化后耐力显然得到改善(图6)。

在对照组中，验证了与肌肉固定化之前相比，肌肉固定化之后在握力试验、转棒试验和跑步机试验中的运动能力降低。然而，在给药了丁基吡啶鎓氯化物的实验组中，验证了运动能力没有降低；而是与对照组相比其得以维持或改善。

实施例5.在给药十六烷基吡啶鎓氯化物、丁基吡啶鎓氯化物衍生物后通过肌肉再生的动物运动能力的改善

为了验证与丁基吡啶鎓氯化物具有结构关联性的衍生物显示出相同的效果，将十六烷基吡啶鎓氯化物以50mg/kg的浓度口服给药于20只C57BL/6雄性小鼠2周，并验证在肌肉固定化之前和之后的运动能力的改善。

5-1.握力试验

以与上述实施例4-1相同的方法进行试验，并且在给药十六烷基吡啶鎓氯化物后，验证了与对照组相比，使肌肉固定化后的握力下降的范围减小(图7)。

5-2.转棒试验

以与上述实施例4-2相同的方法进行试验，并且在给药十六烷基吡啶鎓氯化物后，验证了与对照组相比，用以保持平衡感的运动能力得以改善(图8)。

5-3.跑步机试验

以与上述实施例4-3相同的方法进行试验，并且在给药十六烷基吡啶鎓氯化物后，验证了与对照组相比，耐力得以改善(图9)。

这些结果支持了不仅丁基吡啶鎓氯化物而且其衍生物对于肌肉细胞具有相同的分化作用，而且此外其衍生物具有预防或治疗与肌无力有关的疾病的作用。

从上可知，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本发明的技术概念或必要特征下可以将本发明以其它具体方式来实施。在这方面，本文中公开的示例性实施方式仅用于说明目的而不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅涵盖所述示例性实施方式，而且涵盖可以包括在由所附权利要求所限定的本发明的精神和范围内的多个替代方案、修改、等同方案和其它实施方式。