一种预防或治疗乳腺癌的外用制剂的制作方法

本发明涉及一种外用制剂，具体涉及一种预防或治疗乳腺癌的外用制剂，属于医药领域。

背景技术：

鸡血藤为豆科植物密花豆属密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎，是补血活血的传统中药。近年来临床上常用鸡血藤治疗贫血，各种原因(如放疗、化疗)引起的白细胞、血小板、红细胞等全血象减少和再生障碍性贫血等疾病，且疗效较好。现代药理学研究证明，鸡血藤还具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、对酪氨酸酶双向调节、抗炎、抗氧化、镇静催眠等作用。

关于鸡血藤抗肿瘤作用，现有技术已公开其对肺癌、大肠癌、白血病、宫颈癌、胃癌等具有治疗作用。但关于鸡血藤治疗乳腺癌的研究报道很少，未见关于其外用治疗乳腺癌的报道。

异甘草素是一种异黄酮类化合物，是鸡血藤的主要活性成分。现有技术研究表明异甘草素具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、对心血管和气管的作用等。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种预防或治疗乳腺癌的外用制剂。

本发明的另一个目的在于提供该制剂在制备外用预防或治疗乳腺癌药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供鸡血藤提取物和/或异甘草素口服制剂在制备预防或治疗乳腺癌药物中的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种预防或治疗乳腺癌的外用制剂，该外用制剂包括活性成分及外用制剂辅料，其特征在于，所述活性成分为鸡血藤提取物和/或异甘草素。

进一步，所述鸡血藤提取物为鸡血藤水提物、乙醇提取物或鸡血藤水提物、乙醇提取物用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次先后萃取或择一萃取得到的萃取物或萃取物经大孔树脂柱纯化得到的有效部位。

更进一步，所述鸡血藤水提取物优选60-120℃水提取1-8次得到的提取物；更优选提取2-5次；

所述鸡血藤乙醇提取物优选10-95％乙醇溶液提取得到的提取物，更优选20-80％乙醇提取得到的提取物，更优选30-70％乙醇提取得到的提取物，更优选40-70％乙醇提取得到的提取物；提取方式可以选择采用渗漉、回流、浸渍或超声提取；优选提取1-8次；更优选提取2-5次。

更进一步，所述大孔树脂柱纯化过程为：先用水洗脱，然后在10-95％浓度范围内依次用浓度逐渐增大的乙醇溶液洗脱，收集60-90％乙醇溶液洗脱物得到鸡血藤有效部位；更进一步，所述大孔树脂为弱极性的。

进一步，鸡血藤提取物与异甘草素的比例为1～5:1。更进一步，鸡血藤提取物与异甘草素的比例为2～4:1；更进一步，鸡血藤提取物与异甘草素的比例为3:1。

本发明所述异甘草素可以从市场购买，也可以从鸡血藤中提取得到，还可以从其他植物中分离纯化得到，也可以通过化学合成或生物合成方法得到，其结构式如下：

本发明所述外用制剂包括气雾剂、雾化剂、搽剂、酊剂、乳化剂、悬浮液、 纳米乳化剂、纳米悬浮液、脂质体、乳膏剂、软膏剂、糊剂、凝胶剂、贴剂、巴布剂，沐浴液(露)等。本发明所述常规外用辅料包括表面活性剂、乳化剂、保湿剂、防腐剂、抗氧剂、增稠剂、增溶剂、抛射剂、透皮促进剂、矫味剂等。其中，表面活性剂包括硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、季铵化物、卵磷脂、氨基酸性、甜菜碱、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯等；保湿剂包括丙三醇、丁二醇、聚乙二醇、丙二醇、木糖醇、聚丙二醇、山梨糖醇等；增稠剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚丙烯酸酯、明胶、海藻酸钠等；矫味剂包括卵磷脂、甘油、山梨醇、甘露醇、薄荷油、香精等。

附图说明

图1：空白制剂组和ISL实验组乳腺肿瘤的生长速率情况比较

图2：空白制剂组和ISL实验组肿瘤体积和肺转移情况比较

A行为乳腺肿瘤组织和肺组织；B行和C行为病理报告

图3：空白制剂组和ISL实验组平均转移性结节情况比较

图4：空白制剂组和ISL实验组小鼠存活率比较

具体实施方式

实施例1鸡血藤提取物的制备

取鸡血藤药材250g，用70％乙醇浸泡40min，加入10倍量70％乙醇超声提取两次，每次40min，合并超声提取液。减压回收乙醇，将浓缩液置于已经称重的容器中，再置于减压冷冻干燥装置中减压干燥48h后取出，收集粉末，置于干燥器中备用。

实施例2鸡血藤提取物的制备

鸡血藤药材100g，用10倍水(W/V)煎煮提取2次，每次1小时，合并两次提取液，减压浓缩至干，收集粉末，置于干燥器中备用。

实施例3鸡血藤提取物的制备

鸡血藤药材1000g，用10倍量(W/V)的60％乙醇超声提取2次，每次1 小时，合并两次提取液，减压浓缩至无醇味后，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。

实施例4鸡血藤提取物乳膏剂的制备

原料：鸡血藤提取物1500mg(按实施例1-3任一方法制备)；

辅料：硬脂酸24g、单甘油酯7g、白凡士林2.0g、羊毛脂10g、液体石蜡12ml、三乙醇胺100ml、蒸馏水120ml、樟脑约1.5g(50℃下)；

取上述原辅料，按常规制剂工艺制成乳膏剂。

实施例5鸡血藤提取物喷雾剂的制备

原料：鸡血藤提取物1500mg(按实施例1-3任一方法制备)；

辅料：樟脑3g、薄荷脑1g及冰片2g；

制备方法：分别取樟脑、薄荷脑及冰片，用适量70％的乙醇溶解，加入冷冻干燥得到的鸡血藤提取物粉末，加50％乙醇至总量为100ml，混匀，静置，滤过，灌装，封口，充入抛射剂适量，即得。

实施例6鸡血藤提取物沐浴液的制备

原料：鸡血藤提取物(按实施例1-3任一方法制备)；

制备方法：将EDTA-2Na溶解于去离子水中，加热至80℃，加入十二烷基醚硫酸铵(AESA)、月桂基硫酸铵(K12A)，搅拌溶解，在75℃时加入珠光粉、鸡血藤提取物粉末，搅拌冷却至60℃，加入丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、6501、甜菜碱(CAB-35)，搅拌冷却至50℃以下，加入香精、色素、防腐剂，再继续搅拌冷却至40℃，出料，即为沐浴液。

实施例7异甘草素乳膏剂的制备

原料：异甘草素500mg；

辅料：硬脂酸24g、单甘油酯7g、白凡士林2.0g、羊毛脂10g、液体石蜡12ml、三乙醇胺100ml、蒸馏水120ml、樟脑约1.5g(50℃下)；

取上述原辅料，按常规制剂工艺制成乳膏剂。

实施例8鸡血藤提取物和异甘草素乳膏剂的制备

原料：鸡血藤提取物1500mg(按实施例1-3任一方法制备)；异甘草素500mg；

辅料：硬脂酸24g、单甘油酯7g、白凡士林2.0g、羊毛脂10g、液体石蜡12ml、三乙醇胺100ml、蒸馏水120ml、樟脑约1.5g(50℃下)；

取上述原辅料，按常规制剂工艺制成乳膏剂。

实施例9鸡血藤提取物(SS)及异甘草素(ISL)乳膏剂抑制乳腺癌实验结果

1试验药物

空白制剂：按实施例8不加入SS和ISL制备的空白制剂。

实验制剂：按实施例8制备的乳膏剂。

2给药剂量换算

通过预实验，小鼠每次涂抹量为0.5ml，约为46.6mg(三次取平均值所得，47.0mg，46.3mg，46.6mg)，一天涂抹三次，则每天的给药量为139.8mg。

以小鼠重20g为计算单位，则小鼠的每天给药量为SS为1.366mg，ISL为0.455mg；即为SS 68.3mg/kg/day，ISL 22.76mg/kg/day。

3外用给药抗乳腺癌实验

3.1小鼠前处理

实验采用乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠。取大约三周半的阳性表达雌性转基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠内及胸部进行剃毛，再用脱毛膏使得试药部位平整无毛。

3.2小鼠分组

将小鼠均分为3组，分别为：

实验组①：阴性表达雌性转基因小鼠对照组；

实验组②：阳性表达雌性转基因小鼠无药物干预对照组(给予空白制剂)；

实验组③：阳性表达雌性转基因小鼠给药干预组(给予实验制剂)。

3.3给药

将乳膏剂及空白制剂均匀涂抹于剃毛部位，连续给药30天，每天3次，每次0.46克外涂，每隔二天记录每只老鼠肿瘤的生长情况，大小和小鼠状态。于第四周周末短颈处死，剥离癌肿块，记录重量和特征，肿瘤出现时间，生长速度，数量，并于终点对肿瘤的大小多少及的总体重量进行比较。观察肺组织 是否出现肺转移，如果肺部出现肿块，则表明已发生肺转移。

4实验结果

结果如下表1。

表1药物(SS+ISL)乳膏剂对抑制乳癌生长的实验研究

上表中N/A表示“未获得”；±/+表示“可疑转移/可见明显转移”

上述实验结果表明，实验制剂具有抑制肿瘤生长及转移的作用，与空白制剂对照组相比具有显著性差异。空白制剂对照组出现明显肺转移，而实验制剂组未见明显转移。

实施例10鸡血藤提取物(SS)乳膏剂抑制乳腺癌实验结果

1试验药物

空白制剂：按实施例4不加入SS制备的空白制剂。

实验制剂：按实施例4制备的乳膏剂，鸡血藤提取物按实施例1方法制备。

2给药剂量换算

通过预实验，小鼠每次涂抹量为0.5ml，约为46.6mg(三次取平均值所得，47.0mg，46.3mg，46.6mg)，一天涂抹三次，则每天的给药量为139.8mg。

以小鼠重20g为计算单位，则小鼠的每天给药量为SS为1.366mg，即为SS 68.3mg/kg/day。

3外用给药抗乳腺癌实验

3.1小鼠前处理

实验采用乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠。取大约三周半的阳性表达雌性转基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠内及胸部进行剃毛，再用脱 毛膏使得试药部位平整无毛。

3.2小鼠分组

将小鼠均分为3组，分别为：

实验组①：阴性表达雌性转基因小鼠对照组；

实验组②：阳性表达雌性转基因小鼠无药物干预对照组(给予空白制剂)；

实验组③：阳性表达雌性转基因小鼠给药干预组(给予实验制剂)。

3.3给药

将乳膏剂及空白制剂均匀涂抹于剃毛部位，连续给药30天，每天3次，每次0.46克外涂，每隔二天记录每只老鼠肿瘤的生长情况，大小和小鼠状态。于第四周周末短颈处死，剥离癌肿块，记录重量和特征，肿瘤出现时间，生长速度，数量，并于终点对肿瘤的大小多少及的总体重量进行比较。观察肺组织是否出现肺转移，如果肺部出现肿块，则表明已发生肺转移。

4实验结果

结果如下表2。

表2药物(SS)乳膏剂对抑制乳癌生长的实验研究

上表中N/A表示“未获得”；±/+表示“可疑转移/可见明显转移”

上述实验结果表明，实验制剂具有抑制肿瘤生长及转移的作用，与空白制剂对照组相比具有显著性差异。

实验例11异甘草素(ISL)乳膏剂抑制乳腺癌实验结果

1试验药物

空白制剂：按实施例7不加入ISL制备的空白制剂。

实验制剂：按实施例7制备的乳膏剂。

2给药剂量换算

通过预实验，小鼠每次涂抹量为0.5ml，约为46.6mg(三次取平均值所得，47.0mg，46.3mg，46.6mg)，一天涂抹三次，则每天的给药量为139.8mg。

以小鼠重20g为计算单位，则小鼠的每天给药量为ISL为0.455mg；即为ISL 22.76mg/kg/day。

3外用给药抗乳腺癌实验

3.1小鼠前处理

实验采用乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠。取大约三周半的阳性表达雌性转基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠内及胸部进行剃毛，再用脱毛膏使得试药部位平整无毛。

3.2小鼠分组

将小鼠均分为3组，分别为：

实验组①：阴性表达雌性转基因小鼠对照组；

实验组②：阳性表达雌性转基因小鼠无药物干预对照组(给予空白制剂)；

实验组③：阳性表达雌性转基因小鼠给药干预组(给予实验制剂)。

3.3给药

将乳膏剂及空白制剂均匀涂抹于剃毛部位，连续给药30天，每天3次，每次0.46克外涂，每隔二天记录每只老鼠肿瘤的生长情况，大小和小鼠状态。于第四周周末短颈处死，剥离癌肿块，记录重量和特征，肿瘤出现时间，生长速度，数量，并于终点对肿瘤的大小多少及的总体重量进行比较。观察肺组织是否出现肺转移，如果肺部出现肿块，则表明已发生肺转移。

4实验结果

结果如下表3。

表3药物(ISL)乳膏剂对抑制乳癌生长的实验研究

上表中N/A表示“未获得”；±/+表示“可疑转移/可见明显转移”

上述实验结果表明，实验制剂具有抑制肿瘤生长及转移的作用，与空白制剂对照组相比具有显著性差异。

实验例12鸡血藤提取物(SS)喷雾剂抑制乳腺癌实验结果

1试验药物

空白制剂：按实施例5不加入SS制备的空白制剂。

实验制剂：按实施例5制备的喷雾剂。

2用法与用量

外用；喷涂乳房局部，按摩5min至发热，每次喷射量为1ml(喷5次，每次0.2ml)，一日3次，相当于生药量9g/day。

3外用给药抑制乳腺癌实验

3.1小鼠前处理

实验采用乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠。取大约三周半的阳性表达雌性转基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠内及胸部进行剃毛，再用脱毛膏使得试药部位平整无毛。

3.2小鼠分组

将小鼠均分为3组，分别为：

实验组①：阴性表达雌性转基因小鼠对照组；

实验组②：阳性表达雌性转基因小鼠无药物干预对照组(给予空白制剂)；

实验组③：阳性表达雌性转基因小鼠给药干预组(给予实验制剂)。

3.3给药

取气雾剂喷射于剃毛部位，连续喷雾给药30天。每隔二天记录每只老鼠肿瘤的生长情况，大小和小鼠状态。于第四周周末短颈处死，剥离癌肿块，记录重量和特征，30天后处死老鼠记录每只老鼠的总量，剥离癌肿块并记录重量和特征，观察肺组织是否出现肺转移。

4实验结果

结果见表4。

表4药物(SS)喷雾剂对抑制乳癌生长的实验研究

上表中N/A表示“未获得”；±/+表示“可疑转移/可见明显转移”

上述实验结果表明，实验制剂具有抑制肿瘤生长及转移的作用，与空白制剂对照组相比具有显著性差异。

实验例13鸡血藤提取物(SS)沐浴液抑制乳腺癌实验结果

1试验药物

空白制剂：按实施例6不加入SS制备的空白制剂。

实验制剂：按实施例6制备的沐浴液，鸡血藤提取物按实施例1方法制备。

2用法

外用；沐浴时与适量水打湿，起泡后涂抹在身体上，重点在乳房周边涂抹。

3外用给药抗乳腺癌实验

3.1小鼠前处理

实验采用乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠。取大约三周半的阳性表达雌性转基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠内及胸部进行剃毛，再用脱毛膏使得试药部位平整无毛。

3.2小鼠分组

将小鼠均分为3组，分别为：

实验组①：阴性表达雌性转基因小鼠对照组；

实验组②：阳性表达雌性转基因小鼠无药物干预对照组(给予空白制剂)；

实验组③：阳性表达雌性转基因小鼠给药干预组(给予实验制剂)。

3.3给药

取将相对应的沐浴液用适量水打湿，药物均匀涂抹于剃毛部位，连续给药 30天，每次涂抹均匀即可。每隔二天记录每只老鼠肿瘤的生长情况，大小和小鼠状态。于第四周周末短颈处死，剥离癌肿块，记录重量和特征；并于终点记录每只老鼠的总量，剥离癌肿块并记录重量和特征，剥离肺组织并观察是否出现肺转移。

4实验结果

结果见表5。

表5药物(SS)沐浴液对抑制乳癌生长的实验研究

上表中N/A表示“未获得”；±/+表示“可疑转移/可见明显转移”

上述实验结果表明，实验制剂具有抑制肿瘤生长及转移的作用，与空白制剂对照组相比具有显著性差异。

实施例9-13实验结果表明，本发明制剂外用对乳腺癌具有显著的治疗效果。

实验例14异甘草素(ISL)抑制乳腺癌的生长与转移的实验结果

1、试验药物：异甘草素(98％)

2、分组、用法(内服给药)

空白制剂：阳性表达转基因小鼠，灌胃生理盐水每日0.5ml。

阴性对照组：阴性表达转基因小鼠，灌胃生理盐水每日0.5ml。

实验组：阳性表达转基因小鼠，灌胃ISL每日0.5ml，浓度为50 mg/kg/d，从断奶后(3周大)开始给药连续12周。

3、结果

连续观察，于12周时观察肿瘤的生长情况并取肿瘤组织测定其大小体积及重量，并对肺组织转移情况进行比较。

实验结果见表6，图1-4。

表6 ISL口服对乳癌生长与转移的抑制作用(mean±SD,n＝10)

与空白制剂组比较**P<0.005

由图1可见，ISL组的肿瘤生长速率显著低于空白制剂组。图2显示ISL组的肿瘤体积显著小于空白制剂组，且ISL组的肺转移情况较空白制剂组明显减轻。图3结果显示ISL组的肺转移情况较空白制剂组明显减轻。图4结果显示ISL组小鼠12周内存活率为100％，显著高于空白制剂组。

表6结果表明ISL实验组在12周与空白制剂组比较肿瘤质量及体积有显著性的差异(P<0.005)。

综上所述，ISL口服具有显著抑制乳腺肿瘤生长及其肺转移的效果。