技术领域
本发明涉及作为癌的治疗和/或预防剂等有用的新型免疫诱导剂。
背景技术：
癌症是占据所有死亡原因第一位的疾病，目前进行的治疗以手术疗法为主，组合使用放射疗法和化学疗法。近年来，尽管开发了新手术方法并发现了新的抗癌剂，但现状是除了部分癌症以外，癌的治疗效果仍未见提高。近年来，由于分子生物学与癌免疫学的进步，逐渐能够鉴定出被作用于癌的细胞毒性T细胞所识别的癌抗原及编码该癌抗原的基因，对抗原特异性免疫疗法的期待日渐高涨(参照非专利文献1)。在免疫疗法中，为了减轻副作用，作为其抗原被识别的肽或者蛋白质必须在正常细胞中几乎不存在，而特异性地存在于癌细胞中。1991年，比利时Ludwig研究所的Boon等人通过使用自身癌细胞株与癌反应性T细胞的cDNA表达克隆法，分离出CD8阳性T细胞识别的人黑色素瘤抗原MAGE1(参照非专利文献2)。之后，报导了采用基因表达克隆的方法鉴别在癌症患者体内与自身的癌反应产生的抗体所识别的肿瘤抗原，即SEREX法(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)(非专利文献3；专利文献1)，逐渐分离出各种癌抗原(参照非专利文献4-9)。正在开始进行以其一部分作为靶的癌症免疫疗法临床试验。
另一方面，已知犬与猫与人类相同，有乳腺肿瘤、鳞状上皮癌等多种肿瘤，并在犬与猫的疾病统计中排名也较高。然而，目前针对犬与猫的癌肿尚无有效的治疗药物、预防药物以及诊断药物。大部分犬与猫的肿瘤，几乎都是在该肿瘤进行性扩大后，方为饲主察觉，入院之后，即使经过外科手术切除并投以人类药物(抗癌剂等)，多数情况下为时已晚，在处理之后不久即死亡。在上述现状下，如有可能获取对犬与猫癌症有效的治疗药物、预防药物及诊断药物，则可以期望开拓其针对犬癌症的用途。
专利文献1：美国专利第5698396号
非专利文献1：秋吉毅，“癌与化学疗法”，1997年，第24卷，551～519页
非专利文献2：Bruggen P,et al.,Science,254:1643-1647(1991)
非专利文献3：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:11810-11813(1995)
非专利文献4：Int.J.Cancer,72:965-971(1997)
非专利文献5：Cancer Res.,58:1034-1041(1998)
非专利文献6：Int.J.Cancer,29:652-658(1998)
非专利文献7：Int.J.Oncol.,14:703-708(1999)
非专利文献8：Cancer Res.,56:4766-4772(1996)
非专利文献9：Hum.Mol.Genet 6:33-39,1997
非专利文献10：井上直和，山口亮，伊川正人蛋白质核酸酵素vol.50No.11 1405-1412
非专利文献11：J Cell Sce.115:1825-35
非专利文献12：Blood.95:1788-96
非专利文献13：Mol Endocrinol.9:243-54(1995)
非专利文献14：J Cell Biol.145:83-98(1999)
技术实现要素：
本发明的目的在于提供作为癌的治疗和/或预防剂等有用的新型免疫诱导剂。
本发明的发明人经努力研究，结果发现：通过使用来自犬睾丸cDNA文库以及罹癌犬血清的SEREX法，取得cDNA，所述cDNA编码与来自罹癌生物体血清中存在的抗体相结合的蛋白质，并以此cDNA为基础，制作具有序列号2所示氨基酸序列的多肽，具有序列号16所示氨基酸序列的犬钙镁蛋白(Calmegin protein)，具有序列号26所示氨基酸序列的犬中心体蛋白质(centrosomal protein，以下有时简称为CEP)，以及具有序列号39所示氨基酸序列的犬甲状腺激素受体相互作用因子11(thyroid hormone receptor interactor 11，以下有时简称为“TRIP11”)。另外，以与上述序列号26所示犬CEP具有高同源性的犬注册基因为基础，制作具有序列号28所示氨基酸序列的犬CEP。另外，以所得基因的人类同源性基因为基础，制作具有序列号4所示氨基酸序列的多肽，具有序列号18所示氨基酸序列的人钙镁蛋白，具有序列号30所示氨基酸序列的人CEP，以及具有序列号41所示氨基酸序列的人TRIP11。然后，向生物体给与这些多肽，由此可以在生物体内诱导免疫细胞，并使已经生成的肿瘤萎缩，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种免疫诱导剂，所述免疫诱导剂含有多肽或重组载体作为有效成分，所述多肽为具有免疫诱导活性的下述(a)至(c)中的任一多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸，能够在生物体内表达该多肽：
(a)由序列表中序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中连续7个以上氨基酸组成的多肽，
(b)与(a)多肽有80％以上的同源性、由7个以上的氨基酸组成的多肽，
(c)包含(a)多肽或(b)多肽作为其部分序列的多肽。
另外，本发明提供了一种免疫诱导方法，所述免疫诱导方法包括给与个体有效量的多肽或重组载体，所述多肽为具有免疫诱导活性的上述(a)至(c)中的任一多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸且能够在生物体内表达该多肽。进而，本发明提供了一种抗原呈递细胞的处理方法，所述处理方法包括使多肽与抗原呈递细胞接触，所述多肽为具有免疫诱导活性的上述(a)至(c)中的任一多肽。进而，本发明还提供了多肽或重组载体在免疫诱导剂制备中的应用，所述多肽为具有免疫诱导活性的上述(a)至(c)中的任一多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸且能够在生物体内表达该多肽。
通过本发明，提供了一种作为癌的治疗和/或预防剂等有用的新型免疫诱导剂。如下述实施例中的具体说明所示，向罹癌犬给与本发明所用的多肽时，可以在该罹癌犬体内诱导免疫细胞，进而能够使已经生成的癌缩小或萎缩。因此，该多肽对于癌的治疗和预防有用。
本发明提供下述项：
1.一种免疫诱导剂，含有多肽或重组载体作为有效成分，所述多肽为具有免疫诱导活性的下述(a)至(c)中的任一多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸且能够在生物体内表达该多肽，
(a)由序列表中序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中连续7个以上氨基酸组成的多肽，
(b)与(a)多肽有80％以上的同源性、由7个以上的氨基酸组成的多肽，
(c)包含(a)多肽或(b)多肽作为其部分序列的多肽。
2.如项1所述的免疫诱导剂，其中，所述(b)多肽为与所述(a)多肽具有95％以上同源性的多肽。
3.如项1所述的免疫诱导剂，其中，所述具有免疫诱导活性的多肽为序列表中序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中连续7个以上氨基酸组成的多肽，或包含该多肽作为其部分序列的多肽。
4.如项3所述的免疫诱导剂，其中，所述具有免疫诱导活性的多肽为具有序列表中序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列的多肽。
5.如项1至4中任一项所述的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂含有多肽作为有效成分。
6.如项5所述的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂是抗原呈递细胞的处理剂。
7.如项1至5中任一项所述的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂是癌症的治疗剂和/或预防剂。
8.如项7所述的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂用于人、犬或猫。
9.如项7或8所述的免疫诱导剂，所述免疫诱导剂还含有免疫增强剂。
10.如项9所述的免疫诱导剂，其中，所述免疫增强剂为选自由弗氏不完全佐剂，Montanide，多聚IC及其衍生物、CpG寡核苷酸、白细胞介素12、白细胞介素18、干扰素α，干扰素β，干扰素ω，干扰素γ以及Flt3配体构成的组中的至少一种。
11.一种免疫诱导方法，包括给与个体有效量的多肽或重组载体，所述多肽为具有免疫诱导活性的下述(a)至(c)中的任一多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸且能够在生物体内表达该多肽，
(a)由序列表中序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中连续7个以上氨基酸组成的多肽，
(b)与(a)多肽有80％以上的同源性、由7个以上的氨基酸组成的多肽，
(c)包含(a)多肽或(b)多肽作为其部分序列的多肽。
12.一种抗原呈递细胞的处理方法，包括使多肽与抗原呈递细胞接触，所述多肽为下述(a)至(c)中的任一多肽、具有免疫诱导活性，
(a)由序列表中序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中连续7个以上氨基酸组成的多肽，
(b)与(a)多肽有80％以上的同源性、由7个以上的氨基酸组成的多肽，
(c)包含(a)多肽或(b)多肽作为其部分序列的多肽。
13.多肽或重组载体在免疫诱导剂制备中的应用，所述多肽为具有免疫诱导活性的下述(a)至(c)中的任一多肽，所述重组载体含有编码该多肽的多核苷酸且能够在生物体内表达该多肽，
(a)由序列表中序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中连续7个以上氨基酸组成的多肽，
(b)与(a)多肽有80％以上的同源性、由7个以上的氨基酸组成的多肽，
(c)包含(a)多肽或(b)多肽作为其部分序列的多肽。
附图说明
[图1]表示实施例A-1中鉴别出的基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱。标号1：表示鉴别出的基因表达谱；标号2：表示GAPDH基因的表达谱。
[图2]为本发明中鉴别出的犬源蛋白质经考马斯染色被检出的图，所述犬源蛋白质是在实施例A中由大肠杆菌产生并经提纯的。标号3：表示本发明中犬源蛋白质的条带。
[图3]表示在本发明中鉴别出的钙镁蛋白基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱。标号1：表示钙镁基因的表达谱；标号2：表示GAPDH基因的表达谱。
[图4]为犬钙镁蛋白经考马斯染色被检出的图，所述犬钙镁蛋白是在实施例B中由大肠杆菌产生并经提纯的，为本发明中所用的多肽之一。标号3：表示犬钙镁蛋白的条带。
[图5]表示编码CEP蛋白的基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱。标号1：表示编码CEP蛋白的基因表达谱；标号2：表示GAPDH基因的表达谱。
[图6]为序列号26的犬CEP经考马斯染色被检出的图，所述犬CEP是在实施例C中由大肠杆菌产生并经提纯的、为本发明中所用的多肽之一。标号3：表示犬CEP蛋白的条带。
[图7]表示编码TRIP11蛋白的基因在正常组织及肿瘤细胞株中的表达谱。标号1：表示编码TRIP11蛋白的基因表达谱；标号2：表示GAPDH基因的表达谱。
[图8]为犬TRIP11经考马斯染色被检出的图，所述犬TRIP11是在实施例D中由大肠杆菌产生并经提纯的，为本发明中所用的多肽之一。标号3：表示犬TRIP11蛋白的条带。
具体实施方式
作为本发明免疫诱导剂中作为有效成分所含的多肽，可以举出以下例子。需要说明的是，在本发明中，所谓“多肽”，是指多个氨基酸通过肽键形成的分子，不仅包括由许多氨基酸构成的多肽分子，而且包括由少数氨基酸构成的低分子量分子(寡肽)和全长蛋白质，还包括在本发明中由序列号2、4、16、18、26、28、30、39或者41的全长组成的蛋白质。
(a)由具有序列表中序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列的多肽中的连续7个以上氨基酸组成的、具有免疫诱导活性的多肽。
(b)与(a)多肽有80％以上的同源性、由7个以上的氨基酸组成的、具有免疫诱导活性的多肽。
(c)包含(a)多肽或(b)多肽作为其部分序列的、具有免疫诱导活性的多肽。
需要说明的是，在本发明中，所谓“具有氨基酸序列”，是指氨基酸残基按照所示顺序排列。因此，例如所谓“具有序列号2所示氨基酸序列的多肽”，是指具有序列号2所示Met Ala Ala Leu..(省略)..Ile Thr Ser Pro的氨基酸序列，大小为306个氨基酸残基的多肽。另外，例如有时将“具有序列号2所示氨基酸序列的多肽”简称为“序列号2的多肽”。“具有碱基序列”之类的表达其含义也与上述类似。
在本申请中，所谓“免疫诱导活性”，是指在生物体内对分泌干扰素等细胞因子的免疫细胞加以诱导的能力。多肽是否具有免疫诱导活性可以通过例如众所周知的ELISPOT法等方法来确认。具体而言，如下列实施例所述，向生物体给与需评价免疫诱导活性的多肽，从该生物体中获得末梢血单核细胞等细胞，将该细胞与该多肽共同培养，通过使用特异性抗体测量来自该细胞的细胞因子生成量，可以测定该细胞中免疫细胞的数量，从而可以评价免疫诱导活性。此外，如下述实施例所示，向罹癌生物体给与基于序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所述氨基酸序列制成的重组多肽使，亦可通过其免疫诱导活性使肿瘤退减。因此，上述免疫诱导活性，也可以作为抑制表达序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所述多肽的癌细胞增殖以及使癌组织(肿瘤)缩小或消失的能力(以下称为“抗肿瘤活性”)进行评价。多肽的抗肿瘤活性，例如如下述实施例中的具体记载所述，实际上可以在向罹癌生物体给与该多肽后通过调查是否能使肿瘤缩小等方法来加以确认。另外，通过调查由该多肽所激活的T细胞(即与呈递该多肽的抗原呈递细胞相接触的T细胞)是否在生物体外显示出对肿瘤细胞的细胞毒性，亦可对该多肽的抗肿瘤活性加以评价。T细胞与抗原呈递细胞的接触，如下所述，可以通过在液体培养基中将两者共同培养来进行。细胞毒性的测定可以通过例如Int.J.Cancer,58:p317,1994中记载的名为51Cr释放法的公知方法来进行。当该多肽用于癌的治疗和/或预防时，没有特别限定，但优选用抗肿瘤活性为指标对免疫活性进行评价。
本发明公开的序列表中序列号2所示的氨基酸序列，是一种功能未知的多肽氨基酸序列，是使用来自犬类睾丸的cDNA文库与罹癌犬的血清通过SEREX法，以与特异性存在于来自罹癌犬血清中的抗体相结合的多肽的形式被分离出的(参照实施例A-1)。虽然该多肽分别以Accession No.XP_535343(蛋白质)与Accession No.XM_535343(编码基因)的形式注册于NCBI的数据库中，但是其功能尚未有报导。另外，序列号4所示的氨基酸序列，是如上所述已分离的序列号2的多肽的人同源因子的氨基酸序列。该人同源因子也为功能未知的蛋白质，在NCBI的数据库中分别以Accession No.NP_689873(蛋白质)与Accession No.NM_152660(编码基因)的形式注册。需要说明的是，两者在碱基序列上的同源性为93％，在氨基酸序列上的同源性为99％。
序列表中序列号16以及18分别所示的氨基酸序列是钙镁蛋白(Calmegin)的氨基酸序列，该氨基酸序列是使用来自犬睾丸的cDNA文库与罹癌犬的血清通过SEREX法，以与特异性存在于来自罹癌犬血清中的抗体相结合的多肽及其的人同源因子的形式被分离出的(参照实施例B-1)。钙镁蛋白经鉴定是一种在精细胞分化期特异性表达的蛋白质，并在体外显示出伴侣蛋白的活性。由于为只在睾丸内表达、在成熟精子中即消失的蛋白质，所以一般认为其具有将精细胞分化相关蛋白质折叠的功能(非专利文献10，井上直和，山口亮，伊川正人蛋白质核酸酵素vol.50No.11 1405-1412)。然而，目前尚无关于该蛋白质在癌中表达、对癌症治疗与预防有用的报导。需要说明的是，犬钙镁蛋白基因与人钙镁蛋白基因在碱基序列上的同源性为90％，在氨基酸序列上的同源性为89％。
序列表中序列号26、28及30分别所示的氨基酸序列是CEP的氨基酸序列，该氨基酸序列是使用来自犬睾丸的cDNA文库与罹癌犬的血清通过SEREX法，以与特异性存在于来自罹癌犬血清中的抗体相结合的多肽、与该多肽具有高同源性的犬类因子、以及该多肽的人同源因子的形式被分离出的(参照实施例C-1)。CEP是中心体控制微管所必需的蛋白质，也与中心体的成熟相关。已知在部分骨髓增殖性疾病中染色体易位现象屡有出现，而CEP基因位于发生该易位的位点上，因而认为两者之间存在某种相关性。然而，目前尚无关于该蛋白质在癌中表达、对癌症的治疗与预防有用的报导(非专利文献11J Cell Sci.115:1825-35，非专利文献12Blood.95:1788-96)。需要说明的是，序列号26所示编码CEP的犬CEP基因与人CEP基因在碱基序列上的同源性为87％，在氨基酸序列上的同源性为84％。
序列表中序列号39以及40分别所示的氨基酸序列是TRIP11蛋白质的氨基酸序列，该氨基酸序列是使用来自犬睾丸的cDNA文库与罹癌犬的血清通过SEREX法，以与特异性存在于来自罹癌犬血清中的抗体相结合的多肽及其的人同源因子的形式被分离出的(参照实施例D-1)。TRIP11(thyroid hormone receptor interactor11)最初被鉴定为与甲状腺激素受体β相互作用的因子，但也判定其与高尔基体及微管结合，因而认为其结合高尔基体与微管，发挥维持这些细胞器形状的功能。然而，目前尚无关于该蛋白质在癌中表达、对癌症治疗与预防有用的报导(非专利文献13Mol Endocrinol.9:243-54(1995)，非专利文献14J Cell Biol.145:83-98(1999))。需要说明的是，犬TRIP11基因与人TRIP11基因在碱基序列上的同源性为88％，在氨基酸序列上的同源性为86％。
上述(a)的多肽具有免疫诱导活性，是由具有序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列的多肽中的连续7个以上、优选连续9个以上的氨基酸组成的多肽。特别优选该多肽具有序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41的氨基酸序列。需要说明的是，在本领域中众所周知，为大约7个以上氨基酸残基的多肽时，能够发挥抗原性。因此，只要为序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41的氨基酸序列中的连续7个以上氨基酸残基的多肽，即能具有免疫诱导活性，因此可以用来配制本发明所述的免疫诱导剂。但是，如果考虑到在生物体中针对抗原物质产生的抗体为多克隆抗体，则氨基酸残基越多时，由于能够识别抗原物质上的多个位点，从而能够诱导更多种类的抗体，所以可以进一步提高免疫诱导活性。因此，为了提高免疫诱导活性，序列号2或4的情况下，氨基酸残基数优选为30以上，进一步优选为100以上，进一步优选为200以上，进一步更优选为250以上。序列号16或18的情况下，氨基酸残基数优选为30以上，进一步优选为100以上，进一步优选为200以上，进一步优选为400以上，进一步更优选为550以上。序列号26、28或30的情况下，氨基酸残基数优选为30以上，进一步优选为100以上，进一步优选为300以上，进一步优选为600以上，进一步优选为1000以上，进一步优选为1500以上，进一步更优选为2000以上。序列号39或41的情况下，氨基酸残基数优选为30以上，进一步优选为100以上，进一步优选为300以上更理想，进一步优选为600以上，进一步优选为1000以上，进一步更优选为1500以上。
另外，作为通过给与癌抗原多肽进行免疫诱导的原理，已知为：该多肽被抗原呈递细胞吞噬，其后在该细胞内被肽酶分解为更小的片段，呈递于该细胞的表面上，细胞毒性T细胞将其识别，选择性地杀灭呈递该抗原的细胞。
呈递到抗原呈递细胞表面上的多肽的尺寸较小，氨基酸数为7～30个左右。因此，从使其呈递到抗原呈递细胞表面上的角度来看，上述(a)的多肽，只要为由序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示氨基酸序列中的连续7～30个左右、优选9～30个左右的氨基酸组成的多肽，即可。这些较小尺寸的多肽有时也直接呈递于抗原呈递细胞表面，不被抗原呈递细胞所吞噬。
但是，如上所述，被抗原呈递细胞所吞噬的多肽在随机位置被该细胞内的肽酶切断，产生不同的多肽片段，上述多肽片段呈递于抗原呈递细胞表面，因此若给与如序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41的全长序列所示的大尺寸的多肽，则经过抗原呈递细胞内的分解作用，必然会产生对抗原呈递细胞介导的免疫诱导有效的多肽片段。因此即使对于抗原呈递细胞介导的免疫诱导，也优选使用尺寸大的多肽。序列号2或4的情况下，氨基酸残基数优选为30以上，进一步优选为100以上，进一步优选为200以上，进一步更优选为250以上。序列号16或18的情况下，氨基酸残基数优选为30以上，进一步优选为100以上，进一步优选为200以上，进一步优选为400以上，进一步更优选为550以上。序列号26、28或30的情况下，氨基酸残基数优选为30以上，进一步优选为100以上，进一步优选为300以上，进一步优选为600以上，进一步优选为1000以上，进一步优选为1500以上，进一步更优选为2000以上。序列号39或41的情况下，氨基酸残基数优选为30以上，进一步优选为100以上，进一步优选为300以上，进一步优选为600以上，进一步优选为1000以上，进一步更优选为1500以上。
上述(b)的多肽，是将上述(a)的多肽中的少数氨基酸加以取代、缺失和/或添加所得的多肽，是与原序列的同源性为80％以上、优选为90％以上、较优选为95％以上、更优选为98％以上、且具有免疫诱导活性的多肽。一般情况下，即使在蛋白质抗原中将该蛋白质的氨基酸序列中的少数氨基酸残基进行取代、缺失或添加的情况下，有时也具有与原蛋白质几乎相同的抗原性，这一点是本领域技术人员所公知的。因此，上述(b)的多肽也可发挥免疫诱导活性，故可用于制备本发明所述的免疫诱导剂。另外，上述(b)的多肽，也优选为将序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41所示的氨基酸序列中的一个至数个氨基酸进行取代、缺失和/或添加而得到的多肽。
在此，所谓氨基酸序列的“同源性”，是将需要比较的两个氨基酸序列的氨基酸残基尽可能相一致的整齐排列，以一致的氨基酸残基数除以全部氨基酸残基数后所得的以百分比表示的数值。在进行上述整齐排列时，根据需要，在加以比较的两个序列的一者或者两者中插入适当的间隔。可以使用诸如BLAST、FASTA、CLUSTAL W等众所周知的程序，将上述序列整齐排列。当有间隔插入时，在计算上述全部氨基酸残基数时，一个间隔应作为一个氨基酸残基计算。如果加以比较的两个序列用这样方法计算出的全部氨基酸残基数不同，则在计算同源性(％)时，应用两者一致的氨基酸残基数除以较长序列的全部氨基酸残基数。
此外，已知构成天然蛋白质的20种氨基酸可以根据性质的类似性分为以下几组：具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly，Ile，Val，Leu，Ala，Met，Pro)，具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn，Gln，Thr，Ser，Tyr，Cys)，酸性氨基酸(Asp，Glu)，碱性氨基酸(Arg，Lys，His)，芳香族氨基酸(Phe，Tyr，Trp)，在它们间发生取代时多数情况下不会导致多肽性质的变化。因此，取代本发明的上述(a)多肽中的氨基酸时，通过在上述各组间进行取代，维持免疫诱导活性的可能性提高。
上述(c)多肽是含有上述(a)多肽或(b)多肽作为部分序列、并具有免疫诱导活性的多肽。即，为在(a)多肽或(b)多肽的一端或两端附加其他的氨基酸或多肽、并具有免疫活性的多肽。这样的多肽也可用于本发明所述免疫诱导剂的制备。
上述多肽可以按照例如Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法合成。另外，也可以利用各种市售的肽合成仪器通过常规方法合成。另外，还可以使用众所周知的基因工程手段，制成编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸整合到表达载体上，导入宿主细胞，在该宿主细胞中使多肽合成，由此获得目标多肽。
编码上述多肽的多核苷酸可以通过众所周知的遗传工程手段或使用市售核酸合成仪的常规方法很简单地制成。例如，具有序列号1、15、25、27或38的碱基序列的DNA可以如下制备：使用犬类染色体DNA或cDNA文库为模板，将一对引物设计成能够分别扩增序列号1、15、25、27或38所述的碱基序列，使用上述引物对进行PCR法，由此制成。具有序列号3、17、29或40的碱基序列的DNA可以通过使用人染色体DNA或cDNA文库作为上述模板同样地制成。PCR的反应条件可以适当地设定，例如可以举出如下条件等：将由94℃下30秒(变性)、55℃下30秒～1分钟(退火)，72℃下2分钟(延伸)构成的反应过程作为1循环，例如进行30循环后，在72℃下使其反应7分钟，但是反应条件并不限于此。此外，基于本说明书序列表中序列号1至4、15至18、25至30、38至41所示的碱基序列与氨基酸序列的信息，制成适当的探针或引物，并用其筛选犬或人的cDNA文库由此，能够分离出所期望的DNA。上述cDNA文库，优选用表达序列号2、4、16、18、26、28、30、39或41的蛋白质的细胞、器官或组织制成。上述探针或引物的制备，cDNA文库的构筑，cDNA文库的筛选，以及靶基因的克隆等操作是本领域技术人员所公知的，例如，可以按照分子克隆第2版、现代生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)等记载的方法进行。用上述方法获得的DNA，可以得到编码上述(a)多肽的DNA。另外，由于已知编码各氨基酸的密码子，所以可以很容易地特定编码特定氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列。因而，也能够容易地特定编码上述(b)与(c)所述多肽的多核苷酸的碱基序列，故上述多核苷酸也可以使用市售核酸合成仪按照常规方法容易地合成。
作为上述宿主细胞，只要是能够表达上述多肽的细胞即可，作为原核细胞的例子可举出大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可举出猴肾脏细胞COS1、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物培养细胞，出芽酵母，分裂酵母，蚕细胞，非洲爪蟾卵细胞等，但并不限于以上例子。
使用原核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体使用具有可以在原核细胞中复制的复制起点、启动子、核糖体结合部位、DNA克隆部位、终止子等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以举出pUC系列，pBluescriptII，pET表达系统，pGEX表达系统等。将编码上述多肽的DNA整合到上述表达载体中，使用该载体转化原核宿主细胞后，培养所得的转化细胞时，可以在原核宿主细胞中表达上述DNA编码的多肽。在此情况下，也可使该多肽以与其他蛋白质的融合蛋白的形式进行表达。
使用真核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体使用具有启动子，剪接区域，poly-A附加部位等的真核细胞用表达载体。作为上述表达载体，例如可以举出pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等。与上述相同地，将编码上述多肽的DNA整合到上述表达载体中，用该载体转化原核宿主细胞后，培养所得的转化细胞时，可以使上述DNA编码的多肽在真核宿主细胞中表达。当使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等作为表达载体时，能够以附加有His标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP标签等各种标签的融合蛋白的形式，表达上述多肽。
将表达载体导入宿主细胞，可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等众所周知的方法。
为了从宿主细胞中分离提纯目标多肽，可以组合使用众所周知的分离手段。例如，可以举出使用尿素等改性剂或表面活性剂进行的处理、超声波处理、酶消化、盐析或溶剂分步沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电聚焦电泳、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和色谱法、反相色谱法等方法，但并不限于此。
使用以上方法所得的多肽，如上所述也可以以与其他任意蛋白质的融合蛋白的形式存在。例如可以举出与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或His标签的融合蛋白。上述以融合蛋白形式存在的多肽也作为上述(c)多肽包含在本发明的范围之内。进而，由转化细胞所表达的多肽在翻译之后，有时在细胞内进行各种修饰。上述翻译后经修饰的多肽只要具有免疫诱导活性，则也包含在本发明的范围内。作为上述翻译修饰，可以举出N末端移除蛋氨酸、N末端乙酰化、附加糖链、由细胞内蛋白酶导致的限制分解、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、磷酸化等。
如下述实施例中具体记载所述，对罹癌生物体给与上述具有免疫诱导活性的多肽时，可以使得已经产生的肿瘤萎缩。因此，本发明的免疫诱导剂可以用作癌的治疗和/或预防剂。在此情况下，作为治疗对象的癌症，为表达编码序列号2或者4所示多肽的基因的癌症，可以举出脑肿瘤、头部、颈部、肺部、子宫或食道的鳞状上皮癌、黑色素瘤、肺部、乳房或子宫的腺癌、肾癌、恶性混合肿瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘细胞瘤样龈瘤、口腔内肿瘤、肛门周围腺癌、肛门囊肿瘤、肛门囊顶泌腺癌、塞尔托利细胞瘤、阴道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹腔内平滑肌瘤、平滑肌瘤、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、消化管淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、肾上腺髓质肿瘤、粒层细胞瘤(granulosa cell tomor)、嗜铬细胞瘤、膀胱癌(移行细胞癌)、化脓性炎症、腹腔内肝脏肿瘤、肝癌、浆细胞瘤、恶性血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、肛门囊腺癌、口腔癌、转移性恶性黑色素瘤、无色素性恶性黑色素瘤、皮肤恶性黑色素瘤、恶性肌上皮瘤、恶性睾丸上皮瘤、精原细胞瘤(seminoma)、大肠腺癌、胃腺癌、低度皮脂腺癌、耳垢腺癌、顶泌腺癌(Apocrine carcinoma)、低分化型顶泌腺癌、恶性纤维组织细胞瘤、多发性骨髓瘤、间叶组织来源恶性肿瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、起因不明的肉瘤、软组织肉瘤(纺锤形细胞肿瘤)、低分化肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、转移性恶性上皮肿瘤、管状乳腺腺癌、乳腺导管癌、炎症性乳癌、生殖细胞瘤、白血病、浸润性毛发上皮瘤、中细胞型淋巴瘤、多中心型淋巴瘤、骨肉瘤(乳腺)、肥大细胞瘤(Patnaik II型)、肥大细胞瘤(Grade II)、平滑肌肉瘤等，但不限定于此。另外，对象动物为哺乳动物，特别优选为人、犬和猫。
本发明的免疫诱导剂向生物体的给药途径，可以口服也可以非口服，但优选肌肉内给与、皮下给与、静脉内给与、动脉内给与等非口服途径。以治疗癌症为目的使用该免疫诱导剂时，为了提高抗癌作用，如下述实施例所示可向靠近治疗对象肿瘤的所属淋巴结给与。给与量只要是对免疫诱导有效的量即可，例如当用于癌症治疗和/或预防时，为对癌症的治疗和/或预防癌症有效的量即可。对癌症的治疗和/或预防癌症有效的量，应根据肿瘤大小或症状等适当选取，但通常情况下，对于对象动物而言每1日的有效量为0.0001μg～1000μg，优选为0.001μg～1000μg，可分一次或多次给与。理想情况为分数次间隔数日至数月给与。如下述实施例具体所示，本发明的免疫诱导剂，可以使已经形成的肿瘤萎缩。因此，对癌症发生早期的少数的癌细胞也能发挥抗癌作用，从而用于癌症发病前或癌症治疗后时，可以防止癌症的发病和复发。即，本发明所述的免疫诱导剂对癌症治疗和预防两方面都是有效的。
本发明所述的免疫诱导剂，既可仅由多肽组成，也可适应于各种给药方式，适当地与药理学上允许的填充剂，稀释剂、赋形剂等添加剂混合后做成制剂。制剂的方法及可使用的添加剂，在医药制剂的领域众所周知，可以使用其中任何方法或添加剂。作为添加剂的具体实例，可以举出如生理缓冲液之类的稀释剂；如砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、甘氨酸等赋形剂；糖浆、明胶、阿拉伯胶、山梨醇、聚氯乙烯、黄芪胶等结合剂；硬脂酸镁、聚乙二醇、滑石粉、二氧化硅等润滑剂，但并不限于此。作为制剂形态，可以举出片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等口服剂，吸入剂、注射剂、栓剂、液剂等非口服剂。上述制剂可由一般所知的制法制得。
本发明的免疫诱导剂，可与能够在生物体内增强免疫应答的免疫增强剂组合使用。免疫增强剂既可包含在本发明的免疫诱导剂中，也可作为其他的组成物与本发明的免疫诱导剂一并给与患者。
作为上述免疫增强剂，例如可以举出佐剂。佐剂为抗原提供储存场所(细胞外或巨噬细胞内)，激活巨噬细胞、并且刺激特定组的淋巴细胞，由此可以增强免疫应答，从而可以提高抗癌作用。因此，特别指出的是当使用本发明的免疫诱导剂治疗和/或预防癌症时，免疫诱导剂除包含上述多肽作为有效成分外，优选还包含佐剂。在本领域中多种佐剂众所周知，使用其中任何一种佐剂均可。作为佐剂的具体例，可以举出MPL(SmithKline Beecham)、沙门氏菌属Salmonella Minnesota Re 595脂多糖纯化及酸解后得到的同源物质；QS21(SmithKline Beecham)、从Quillja saponaria提取物中纯化所得的QA-21皂苷；PCR申请WO96/33739(SmithKline Beecham)中记载的DQS21；QS-7、QS-17、QS-18及QS-L1(So及其他10人，“Molecules and Cells”、1997年，第7卷，p178-186)；弗氏不完全佐剂；弗氏完全佐剂；维生素E；Montanide；明矾；CpG寡核苷酸(例如，参见Kreig及其他7人，“Nature”，第374卷，p546-549)；多聚IC(Poly IC)及其衍生物(如多聚ICLC等)以及鲨烯和/或生育酚之类由可生物降解油制成的各种油包水乳剂。其中，优选弗氏不完全佐剂、Montanide、多聚IC及其衍生物以及CpG寡核苷酸。上述佐剂和多肽的典型混合比约为1:10～10:1，优选约为1:5～5:1，更优选约为1:1。不过，佐剂并不限于上述例子，本领域众所周知的上述以外佐剂在给与本发明的免疫诱导剂时也可使用(例如，参见Goding著，“Monoclonal Antibodies:Principles and Practice”第二版，1986年)。多肽与佐剂的混合物或乳剂的制备方法，对于疫苗接种领域的一般技术人员来说是众所周知的。
另外，作为上述免疫增强剂，除上述佐剂以外还可以使用刺激对象免疫应答的因子。例如，可以将具有刺激淋巴细胞和抗原呈递细胞的特性的各种细胞因子作为免疫增强剂，与本发明的免疫诱导剂组合使用。上述可增强免疫应答的细胞因子多数为本领域技术人员所周知，作为其例，可以举出显示增强疫苗防御作用的白细胞介素12(IL-12)、GM-CSF、IL-18、干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素γ及Flt3配体，但并不限于此。这些因子也可用作上述免疫增强剂，可以包含在本发明的免疫诱导剂中或作为其他组成物与本发明的免疫诱导剂并用给与患者。
另外，通过使上述多肽与抗原呈递细胞在体外接触，可使抗原呈递细胞呈递该多肽。即，上述(a)至(c)的多肽可以用作抗原呈递细胞的处理剂。在此，作为抗原呈递细胞，优选使用带有MHC类I分子的树状细胞或B细胞。多种MHC类I分子已被鉴定、并周知。人类的MHC分子称为HLA。作为HLA类I分子，可以举出HLA-A、HLA-B、HLA-C，更具体而言，可以举出HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A0204、HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602等。
带有MHC类I分子的树状细胞或B细胞，可以使用众所周知的方法由末梢血制得。例如，自骨髓、脐带血或患者的末梢血中，使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与IL-3(或IL-4)诱导树状细胞，并在该培养细胞系中添加肿瘤相关肽，由此可以诱导肿瘤特异性的树状细胞。通过给与有效量的树状细胞，可以诱导出癌症治疗所期望的应答。使用的细胞，可以是健康者提供的骨髓或脐带血，患者本人的骨髓或末梢血等，但使用患者本来的自身细胞时安全性高，也可以期待避免严重的副作用。末梢血或骨髓使用新鲜样品、低温保存样品或冷冻保存样品皆可。使用末梢血时，可以培养全血，也可以只分离出白细胞成分加以培养，但从效率方面考虑，优选后者。进而，即使在白细胞成分中也可以分离单核细胞。另外，以骨髓或脐带血作为来源时，可以培养构成骨髓的所有细胞，也可以从中分离出单核细胞加以培养。在末梢血或其白细胞成分、骨髓细胞中，可以包含为树状细胞起源的单核细胞、造血干细胞或未成熟树状细胞或CD4阳性细胞等。所用的细胞因子，只要是确认具有安全性和生理活性的物质时，则无论天然型或基因重组型等其生产方法皆可，但优选以必要最低量使用确保能够用于医疗的质量的标准品。添加的细胞因子的浓度只要是可诱导树状细胞的浓度即可没有特殊限定，通常细胞因子的总浓度优选为10～1000ng/ml左右，优选为20～500ng/ml左右。可以使用众所周知的通常用于白细胞培养的培养基进行培养。培养温度只要可使白细胞增殖即可没有特殊限定，但最优选为人体温度的37℃左右。另外，培养种的气体环境只要可使白细胞增殖即可没有特殊限定，但优选通气5％CO2。进而，培养时间只要是可诱导出必要数量的细胞的时间即可没有特殊限定，但通常为3天～2周。供细胞分离和培养所用的仪器，可使用适宜的仪器，但优选能确认医疗用安全性、且操作稳定简单。特别指出的是，对于细胞培养装置，并不限于培养皿、烧瓶、烧杯等一般的容器，也可使用层合型容器或多段式容器、滚瓶(Roller Bottle)、转瓶(Spinner Bottle)、袋式培养起、中空柱等。
在体外使上述多肽与抗原呈递细胞接触的方法本身，可使用众所周知的方法进行。例如，可以通过在含有上述多肽的培养液中培养抗原呈递细胞进行。培养基中的肽浓度无特别限定，但通常为1μg/ml至100μg/ml左右，优选为5μg/ml至20μg/ml左右。培养时的细胞密度无特别限定，但通常为103个细胞/ml至107个细胞/ml左右，优选为5×104个细胞/ml至5×106个细胞/ml左右。优选根据常规方法在37℃下在5％CO2氛围气中进行。需要说明的是，在抗原呈递细胞表面呈递的肽的长度，通常最大为30个氨基酸残基左右。因此，无特别限定，但在体外使抗原呈递细胞与多肽接触时，可以将该多肽制成长度为大约30个氨基酸残基以下。
通过在上述多肽共存下培养抗原呈递细胞，该肽被抗原呈递细胞的MHC分子捕获，使其在抗原呈递细胞表面呈递。因此，使用上述多肽，可以制得含有该多肽与MHC分子复合物的分离抗原呈递细胞。上述抗原呈递细胞在生物体内或体外，针对T细胞呈递该多肽，从而诱导对该多肽特异性的细胞毒性T细胞并使其增殖。
通过使依照上述方法制得的含有上述多肽与MHC分子复合物的抗原呈递细胞在体外与T细胞接触，能够诱导对该多肽特异性的细胞毒性T细胞并使其增殖。其可以通过将上述抗原呈递细胞和T细胞在液体培养基中共存培养来进行。例如，可将抗原呈递细胞悬浮在液体培养基中，移入微孔板的孔等的容器中，并向其中添加T细胞进行培养，由此进行。共存培养时的抗原呈递细胞与T细胞的混合比例，无特别限定，但通常细胞数比率为1:1～1:100左右，优选为1:5～1:20左右。另外，液体培养基中悬浮的抗原呈递细胞的密度无特别限定，但通常为100～1000万细胞/ml左右，优选为10000～100万细胞/ml左右。共存培养优选按照常规方法在37℃下在5％CO2氛围气中进行。培养时间无特别限定，但通常为2日～3周，优选为4日～2周左右。另外，共存培养优选在例如IL-2、IL-6、IL-7及IL-12之类的白细胞介素的一种或多种存在下进行。这种情况下，IL-2及IL-7的浓度，通常为5U/ml到20U/ml左右，IL-6的浓度通常为500U/ml至2000U/ml左右，IL-12的浓度通常为5ng/ml到20ng/ml左右，但均不限于上述范围。上述共存培养，可以追加新鲜抗原呈递细胞一次至多次重复进行。例如，舍弃共存培养后的培养液上清，添加新鲜抗原呈递细胞的悬浊液进一步进行共存培养，上述操作可以重复一次到数次。各共同培养的条件可以与上述相同。
通过上述的共存培养，可以诱导对该多肽特异的细胞毒性T细胞使其增殖。因此，使用上述多肽，可以制得选择性结合上述多肽与MHC分子复合体的分离T细胞。
如下述实施例记载所示，编码序列号2、16、26、28、39及4、18、30、41的多肽的基因，分别在犬以及人的癌细胞及睾丸中特异性表达。因此，一般认为序列号2、16、26、28、39及4、18、30、41的多肽与正常细胞相比显著多地存在于癌细胞中。癌细胞内存在的多肽的一部分呈递于癌细胞表面上的MHC分子上，将用上述方法制得的细胞毒性T细胞给与生物体内时，这些细胞毒性T细胞可以以上述被呈递的多肽为目标毒杀癌细胞。另外，由于呈递上述多肽的抗原呈递细胞在生物体内也可诱导和增殖对该多肽特异性的细胞毒性T细胞，所以即使向生物体内给与该抗原呈递细胞，也可毒杀癌细胞。即，使用上述多肽制得的上述细胞毒性T细胞与抗原呈递细胞也与本发明的免疫诱导剂相同地作为癌的治疗和/或预防剂有用。
在将上述分离抗原呈递细胞或分离T细胞给与生物体时，为了避免生物体内免疫应答将这些细胞作为异物而加以攻击，优选如上所述使用上述(a)至(c)的多肽制备从接受治疗的患者体内采集的抗原呈递细胞或T细胞。
含有抗原呈递细胞或分离T细胞作为有效成分的癌症的治疗剂和/或预防剂，其给与途径优选为静脉内给与及动脉内给与这样的非口服途径。另外，给与量应根据症状及给与目的等适当地选择，但通常为1个～1兆个，优选为100万个～10亿个，优选数日至数月给与一次上述细胞。制剂例如可以为将细胞悬浮于生理盐水中的制剂等，也可以与其他抗癌剂及细胞因子并用。另外，也可添加制剂领域中众所周知的一种或两种以上添加剂。
另外，通过在对象动物体内表达编码上述(a)至(c)多肽的多核苷酸，可以在该生物体内产生抗体并诱导细胞毒性T细胞，获得与给与该多肽时的同等效果。换言之，本发明的免疫诱导剂，可以含有编码上述(a)至(c)多肽的多核苷酸，含有可以在生物体内表达该多肽的重组载体作为其有效成分。上述可用于表达抗原多肽的重组载体，也可被称为基因疫苗。用于制造基因疫苗的载体，只要是能够在对象动物细胞中(优选哺乳动物细胞中)表达的载体即可，没有特别限定，质粒载体或病毒载体皆可，也可以使用在基因疫苗领域内众所周知的任何载体。需要说明的是，编码上述多肽的DNA及RNA等多核苷酸，如上所述可以使用常规方法容易地制备。另外，可用本领域技术人员众所周知的方法将该多核苷酸整合到载体中。
基因疫苗的给与途径，优选为肌肉内给与、皮下给与、静脉内给与、动脉内给与等非口服给与途径，其给与量可以根据抗原种类等适当地选择，但通常每1kg体重以基因疫苗的重量计为0.1μg～100mg左右，优选为1μg～10mg左右。
作为利用病毒载体的方法，例如可以举出将编码上述多肽的多核苷酸整合到逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、疫苗病毒、痘病毒(pox virus)、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)等RNA病毒或DNA病毒中，并用其感染对象动物的方法。其中，特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疫苗病毒等的方法。
作为其他方法，可以举出将表达质粒直接给与肌肉内的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、Lipofectin法、微注射法、磷酸钙法、电穿孔法，特别优选DNA疫苗法、脂质体法。
为使本发明所用的编码上述多肽的基因可实际上作为药物使用，有将基因直接导入体内的in vivo方法，以及从对象动物体内采集某种细胞，在体外将基因导入该细胞，然后将该细胞放回体内的ex vitro方法(日经科学，1994年4月，p20-45；月刊药事，1994年，第36卷，第1号，p.23-48；实验医学增刊，1994年，第12卷，第15号；及其所引用的文献等)。较优选in vivo方法。
通过in vivo方法给与药物时，可以按照与治疗目标的疾病、症状等相应的适当的给与途径给与。例如，可以通过静脉、动脉、皮下、肌肉内等途径给与。通过in vivo方法给与时，例如可以采取液剂等制剂形式，但一般而言，制成含有本发明中编码上述多肽的DNA为有效成分的注射剂，根据需要，可以添加常用的填充剂。另外，在含有该DNA的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)时，可以制成悬浊剂、冻结剂、离心分离浓缩冻结剂等的脂质体制剂形态。
需要说明的是，在本发明中，当提及“序列号1所示的碱基序列”时，除序列号1实际所示的碱基序列外，还包含其互补序列。因此，当提及“具有序列号1所示的碱基序列的多核苷酸”时，包括具有序列号1实际所示的碱基序列的单链多核苷酸、具有其互补碱基序列的单链多核苷酸以及由上述两者组成的双链多核苷酸。在制备编码本发明所用多肽的多核苷酸时，选择适当的任一碱基序列，对于本领域技术人员来说是很容易选择的。
实施例
以下，根据实施例更加具体地说明本发明。
实施例A-1：通过SEREX法制取新型癌抗原蛋白质
(1)构建cDNA文库
使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)从健康犬的睾丸组织中提取全RNA，用Oligotex-dT30mRNA purification Kit(宝酒造社制造)按照该试剂盒所附操作说明书提纯多聚A RNA。
使用由此所得的mRNA(5μg)，构建出犬睾丸cDNA噬菌体文库。构建cDNA噬菌体文库时，使用cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE社制造)按照试剂盒所附的操作说明书构建cDNA文库。构建出的cDNA噬菌体文库大小为1.3×106pfu/ml。
(2)利用血清筛选cDNA文库
用上述已构建的源自犬睾丸的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中，感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)使其为2340克隆，在42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，在37℃下用浸透了IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Cellulose Nitrate Membranes)(Hybond C Extra：GE Healthecare Bio－Science公司制)覆盖培养板4小时，从而诱导·表达蛋白质，并使蛋白质转印到膜上。之后，回收该膜，将其浸在含0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一晚，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释500倍的患病犬血清反应2～3小时。
作为上述患病犬血清，使用从患有鳞状上皮癌的犬体内采取的血清。这些血清保存在-80℃，在即将使用前进行预处理。血清预处理的方法按照如下方法进行。即，用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)后，在NZY培养板的培养基中在37℃下培养一晚。然后，向培养板中添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3pH8.3缓冲液，在4℃下静置15小时后，回收上清作为大肠杆菌/噬菌体提取液。然后将回收所得的大肠杆菌/噬菌体提取液通过NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制造)，将来自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。在此蛋白质固定化柱中使患病犬血清通过·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。用含有0.5％脱脂奶粉的TBS将只是仅仅通过柱子的血清馏分稀释500倍，将其作为免疫筛选的材料。
将经上述处理血清与上述融合蛋白质印迹的膜用TBS-T(0.05％Tween20/TBS)清洗4次之后，将用含0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat Anti Dog IgG-h+I HRP conjugated:BETHYL Laboratories公司制造)作为第二抗体在室温下与其反应1小时，使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制造)通过酶显色反应检出，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，使其溶解在500μl SM缓冲液(100mM NaCl，10mM MgClSO4，50mM Tris-HCl，0.01％明胶pH7.5)中。采用与上述同样的方法将显色反应呈阳性的菌落反复筛选二次、三次，直至菌落单一化，筛选出与血清中IgG反应的30940个噬菌体克隆，分离出一个阳性克隆。
(3)分离抗原基因的同源性检索
为了将通过上述方法分离所得的一个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作从噬菌体载体转换为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL-1-Blue M RF’)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与100μl经提纯的噬菌体溶液以及1μl ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制造)混合后，在37℃下反应15分钟，然后，添加3ml LB培养基，在37℃下培养2.5～3小时，立即置于70℃水浴中保持温度20分钟，之后在4℃下以1000×g离心15分钟，回收上清作为噬粒溶液。然后，将噬粒宿主大肠杆菌(SOLR)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与10μl经提纯的噬菌体溶液混合后，在37℃下反应15分钟，取50μl播于含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一晚。采集经转化的SOLR单菌落，用含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB培养基在37℃下培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN公司制造)提纯含有目标插入片段的质粒DNA。
提纯所得的质粒，可以使用序列号5所记载的T3引物与序列号6所记载的T7引物，通过引物步移法(primer-walking)来解析插入片段的全长序列。通过该序列解析获得了序列号1所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列，运行同源性检索程序BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因同源性的检索，结果表明所得的基因是编码未知功能蛋白质(Accession No.XP_535343)的基因(Accession No.XM_535343)。另外，该基因的人同源因子也为编码未知功能蛋白质(Accession No.NP_689873)的基因(Accession No.NM_152660)(同源性：碱基序列93％，氨基酸序列99％)。人同源因子的碱基序列如序列号3所示，氨基酸序列如序列号4所示。
(4)在各种组织中的表达解析
对于通过上述方法所得的基因，通过RT-PCR法(Reverse Transcription-PCR法)研究其在犬与人的正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制造)按照所附操作说明书从50～100mg各种组织及各种细胞株5-10×106个的细胞中提取全RNA。通过Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen公司制造)按照所附操作说明书，用上述全RNA合成cDNA。人正常组织(脑，海马，睾丸，结肠，胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制造)、QUICK-Clone cDNA(Clontech公司制造)及Large-Insert cDNA Library(Clontech公司制造)。PCR反应使用对获得的犬基因及其人同源基因具有特异性的引物(如序列号7及8所示)按照下列方法进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中使通过逆转录反应制得的样品为0.25μl，上述引物各为2μM，各dNTP为0.2mM，ExTaq多聚酶为0.65U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以94℃-30秒、55℃-30秒、72℃-1分钟为1循环，将该循环重复进行30次。需要说明的是，对具有上述序列号7与8所示碱基序列的基因具有特异性的引物，是扩增下述区域的引物，所述区域是序列号1所示的碱基序列中87～606号及序列号3所示碱基序列中173～695号碱基所在的区域，使用此引物也可以研究犬基因及/或其的人同源基因中任一者的表达。为了比较对照，同时也使用了GAPDH特异性的引物(如序列号9与10所示)。其结果如图1所示，获取的犬基因，在健康的犬组织中显著表达于睾丸，另一方面，也发现该基因在犬乳癌细胞株中显著表达。人同源基因的表达与犬类基因相同，在人正常组织中能够确认其表达的部位仅限于睾丸，但在人癌细胞中则于脑肿瘤、白血病、乳癌、肺癌中均检测出其表达，因此可以确定人同源基因也特异性地表达于睾丸与癌细胞中。
需要说明的是，在图1中，纵轴上标号1表示上述鉴定的基因表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因表达谱。
实施例A-2：新型癌抗原蛋白的制备
(1)重组蛋白质的制备
基于实施例A-1中所得的序列号1的基因，通过以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使由实施例A-1中所得的噬粒溶液制备的供序列解析的载体为1μl、使含有NdeI及XhoI限制性酶剪切序列的两种引物(如序列号11及12所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制造)为1.25U，，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-1分钟为1循环，将该循环重复进行三十次。需要说明的是，上述两种引物是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号2的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制造)提纯出约930bp的DNA片段。
将提纯出的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制造)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认经扩增的基因片段与靶序列相一致。用NadI及XhoI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提纯后，将靶基因序列插入到经NdeI、XhoI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET16b(Novagen公司制造)中。通过使用该载体可制得His标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，能够使靶蛋白在大肠杆菌内表达。
此外，基于序列号3的基因，使用以下方法制得人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，实施例A-1制备的各种组织·细胞cDNA中已确认通过RT-PCR法表达的cDNA1μl、使含有EcoRV及EcoRI限制性酶剪切序列的两种引物(记载于序列号13及14)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制造)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-1分钟为1循环，将该循环重复进行三十次。需要说明的是，上述两种引物是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号4的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制造)提纯出约930bp的DNA片段。
将提纯出的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制造)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认经扩增的基因片段与靶序列相一致。用EcoRV及EcoRI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提纯后，将靶基因序列插入到经EcoRV、EcoRI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制造)中。通过使用该载体可制得His标记融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG的表达诱导，使靶蛋白在大肠杆菌内表达。
(2)重组蛋白质的提纯
将由上述方法获得的、表达序列号1及序列号3所述序列的各个重组大肠杆菌在含有100μg/ml氨苄西林的LB培养基中在37℃下进行培养直至600nm处吸光度为0.7左右，然后，添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷至终浓度为1mM，进一步在37℃下培养4小时。之后以4800rpm离心10分钟集菌。将此菌体球状物悬浮在磷酸盐缓冲生理盐水中，进而以4800rpm离心10分钟，清洗菌体。
将上述菌体悬浮于50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，在冰上进行超声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以6000rpm离心分离20分钟，所得上清为可溶馏分，沉淀为不溶馏分。
将不溶馏分悬浮于50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，以6000rpm离心15分钟。重复该操作2次，除去蛋白酶。
将所得残渣悬浮于含有6M胍盐酸盐、0.15M氯化钠的50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)中，在4℃下静置20小时，使蛋白质变性。变性处理后，以6000rpm离心30分钟，将所得可溶馏分添加到按照常用方法制得的镍螯合柱(载体：Chelateing Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司)，柱容量5mL，平衡缓冲液：含有6M胍盐酸盐、0.15M氯化钠的50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0))中，进一步在4℃下静置一晚，使其吸附到经镍螯合化载体上。将该柱载体以1500rmp离心5分钟，回收上清液，将柱载体悬浮在磷酸盐缓冲生理盐水中后，再次填充到柱中。
将未被柱吸附的馏分用为柱容量10倍量的含0.5M氯化钠的0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)清洗处理后，立即用含0.5M氯化钠的0.1M醋酸缓冲液(pH3.0)洗脱，形成提纯馏分，以后将该提纯馏分作为给与试验用的材料。需要说明的是，各洗脱馏分中的靶蛋白，根据按照常用方法进行的考马斯染色法确认。其中，目标的犬蛋白质如图2所示。
由上述方法所得的提纯标准品用反应用缓冲液(50mM Tris-Hcl，100mM NaCl，5mM CaCl2pH8.0)置换后，使用FactorXa Cleavage Capture Kit(Novagen公司制造)按照所附操作说明书利用FactorXa蛋白酶切除His标签并提纯靶蛋白。然后，使用超滤NANOSEP 10K OMEGA(PALL公司制造)，将由上述方法所得的提纯标准品1.2ml进行生理用磷酸缓冲液(日水制药社制造)置换后，用0.22μm HT Tuffryn Acrodisc(PALL公司制造)进行无菌过滤，用于以下的实验。
实施例A-3：对罹癌犬给与重组蛋白质的实验
(1)抗肿瘤评价
评价用上述方法提纯的两种重组蛋白质对表皮患有肿瘤的两只罹癌犬(两只患有乳腺肿瘤的犬)的抗肿瘤效果。
在如上所述提纯的重组多肽(源自犬及人)各100μg(0.5ml)中混合等量的弗氏不完全佐剂(和光纯药社制造)，制得两种癌症治疗剂。向膀胱附近的所属淋巴结给与该治疗剂共计3次，给与时间分别为初次、初次给与3日后以及7日后。其结果，在给与癌症治疗剂(源自犬及人)时大小分别为约25mm3与50mm3的肿瘤，在癌症治疗剂初次给与10日后分别缩小至约20mm3与42mm3，20日后分别缩小至约13mm3与26mm3，30日后分别缩小至约5mm3与10mm3。
此外，在上述源自犬的多肽100μg(0.5ml)中混合0.5ml的弗氏不完全佐剂，将所得的混合物按照与上述相同的间隔给与患有恶性黑色素瘤的犬的肿瘤周围的皮内，共计给与3次，另外同时，每次皮下给与10MU重组型猫干扰素Intercat。其结果，在给与癌症治疗剂时，是大小约为142mm3的肿瘤，而在癌治疗剂初次使用29日后肿瘤完全萎缩。
进而，在上述源自犬的多肽100μg(0.5ml)中混合0.5ml的弗氏不完全佐剂，与上述相同地将该混合物向患有鼻腺癌的犬给与三次。另外同时每次皮下给与100μg犬白细胞介素12。其结果，在给与癌症治疗剂时，是大小约57mm3的肿瘤，而在癌治疗剂初次使用14日后肿瘤完全萎缩。
(2)免疫诱导能力的评价
在给与癌治疗剂前与初次给与10日后以及30日后的各个时间点，采集在上述(1)的给与实验中已取得抗肿瘤效果的患病犬的血液，使用常规方法分离出末梢血单核细胞，根据使用其的IFNγ酶联免疫斑点法(EliSpot Assay)，对给与的各重组蛋白质进行免疫诱导能力评价。
将70％乙醇以100μL/孔分别添加到Millipore公司制造的96孔培养板(MultiScreen-IP,MAIPS4510)上，静置5分钟，吸取并弃去，然后用灭菌水清洗，以300μL/孔添加200mM碳酸氢钠(pH8.2)，静置5分钟后，吸取并弃去，清洗培养板。然后，将添加在200mM碳酸氢钠(pH8.2)中的抗犬干扰素γ单克隆抗体(R&D公司制造，clone142529，MAB781)以0.5μg/孔分别添加到培养板中，在37℃下温育一晚，使第一抗体固相化。吸取并弃去第一抗体后，将封闭溶液(1％BSA-5％蔗糖-200mM碳酸氢钠(pH8.2))以300μL/孔分别添加到培养板中，在4℃下温育一晚，封闭培养板。吸取并弃去封闭液后，以300μL/孔分别添加含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen公司制造)，静置5分钟后吸取并弃去培养基。之后，将悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中的犬末梢血单核细胞分别以5×105/孔分别添加到培养板的各个孔中，向其中以10μL/孔分别添加在各次给药中使用的源自犬的多肽或源自人的多肽，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时，从而使存在于末梢血单核细胞中的免疫细胞产生干扰素γ。培养后，弃去培养基，用清洗液(0.1％Tween20-200mM碳酸氢钠(pH8.2))将孔清洗6次。将用上述封闭液稀释1000倍的兔抗犬多克隆抗体以100μL/孔分别添加到各个孔中，在4℃下温育一晚。用上述清洗液将孔清洗3次后，将用上述封闭液稀释1000倍的HRP标记抗兔抗体以100μL/孔分别添加到各个孔中，在37℃下反应2小时。用上述清洗液将孔清洗3次后，用Konica免疫显色剂(Konica公司制造)使其显色，清洗孔使反应停止。反应停止后，将膜干燥，用KS Elispot(Carl Zeiss公司制造)计算出现的斑点数。
其结果，无论给与犬多肽或人多肽的患病犬，在给与多肽之前的末梢血单核细胞中均未检出斑点。另一方面，给与犬多肽的患病犬，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检出斑点20个、36个。另外，给与人多肽的患病犬，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检出斑点24个、36个。
根据上述结果可以确认，所有施药的患病犬，都可以诱导免疫细胞，该免疫细胞与给与的重组蛋白质特异性地反应、产生干扰素γ，一般认为通过以上述免疫细胞为中心的免疫反应，能够发挥上述(1)所述的抗肿瘤效果。
实施例B-1：通过SEREX法获取新型癌抗原蛋白质
(1)构建cDNA文库
使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)自健康的犬睾丸组织中提取全RNA，用Oligotex-dT30mRNA purification Kit(宝酒造社制造)按照该试剂盒所附操作说明书提纯出多聚A RNA。
使用由此所得的mRNA(5μg)，构建出犬睾丸cDNA噬菌体文库。在cDNA噬菌体文库的构建中，使用cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE社制造)按照试剂盒所附的操作说明书，构建cDNA文库。构建出的cDNA噬菌体文库的大小为1.3×106pfu/ml。
(2)利用血清筛选cDNA文库
用上述构建的源自犬睾丸的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中，使宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)感染使其为2340克隆，在42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，在37℃下用浸透了IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Hybond C Extra:GE Healthecare Bio-Science公司制造)覆盖培养板4小时，由此诱导·表达蛋白质，并使蛋白质转印到膜上。之后，回收该膜，将其浸在含0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一晚，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释500倍的患病犬血清反应2～3小时。
作为上述患病犬血清，使用从患有肛门近位肿瘤的犬的体内采集的血清。这些血清保存在-80℃下，在即将使用前进行预处理。血清预处理的方法如下。用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)之后，在NZY培养板培养基上37℃培养一晚。然后向培养板中添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3pH8.3缓冲液，在4℃静置15小时后，将上清作为大肠杆菌/噬菌体提取液加以回收。然后将回收所得的大肠杆菌/噬菌体提取液通过NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制造)，将来自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。在此蛋白质固定化了的柱中使患病犬血清通过·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。将只是仅仅通过柱子的血清馏分用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释500倍，将其作为免疫筛选的材料。
将经上述处理血清和上述融合蛋白质印迹的膜用TBS-T(0.05％Tween20/TBS)清洗4次之后，将用含0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat Anti Dog IgG-h+I HRP conjugated:BETHYL Laboratories公司制造)作为第二抗体在室温下使其反应1小时，通过使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制造)的酶显色反应检出，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，使其溶解在500μl SM缓冲液(100mM NaCl，10mM MgClSO4，50mM Tris-HCl，0.01％明胶pH7.5)中。采用与上述同样的方法反复筛选显色反应呈阳性的菌落二次、三次，直至菌落单一化，筛选出与血清中的IgG反应的30940个噬菌体克隆，分离出一个阳性的克隆。
(3)分离抗原基因的同源性检索
为了将通过上述方法分离所得的一个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作将噬菌体载体转换为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL-1-Blue MRF’)制备成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与100μl经提纯的噬菌体溶液以及1μl ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制造)混合后，在37℃反应15分钟，然后，添加3ml LB培养基，在37℃下培养2.5～3小时，立即置于70℃水浴中保持温度20分钟，之后在4℃1000×g下离心15分钟，回收上清作为噬粒溶液。然后将噬粒宿主大肠杆菌(SOLR)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与10μl经提纯的噬菌体溶液混合后，在37℃下反应15分钟，取50μl播于含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一晚。采集经转化的SOLR单菌落，用含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB培养基在37℃下培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN公司制造)提纯含有目标插入片段的质粒DNA。
提纯所得的质粒，使用序列号5所记载的T3引物与序列号6所记载的T7引物，通过引物步移法来解析插入片段的全长序列。通过该序列解析获得序列号1所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列，运行同源性检索程序BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因的同源性检索后，结果表明所得的基因是钙镁蛋白(calmegin)的基因。犬钙镁蛋白的人同源因子是人钙镁蛋白(同源性：碱基序列90％，氨基酸序列89％)。人钙镁蛋白的碱基序列如序列号17所示，氨基酸序列如序列号18所示。(4)在各种组织中的表达解析
对于通过上述方法所得的基因，通过RT-PCR法(Reverse Transcription-PCR法)研究其在犬与人的正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制造)按照所附的操作说明书从50～100mg各种组织及各种细胞株5-10×106个细胞中提取全RNA。通过Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen公司制造)按照所附的操作说明书，用上述全RNA合成cDNA。人正常组织(脑，海马，睾丸，结肠，胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制造)，QUICK-Clone cDNA(Clontech公司制造)及Large-Insert cDNA Library(Clontech公司制造)。PCR反应使用对获得基因具有特异性的引物(如序列号19与20所示)如下进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中，使通过逆转录反应制得的样品为0.25μl，使上述引物各为2μM，各种dNTP为0.2mM，ExTaq聚合酶为0.65U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以94℃-30秒、55℃-30秒、72℃-1分钟为一个循环，重复进行30次。需要说明的是，上述基因的特异性的引物，是扩增下述区域的引物，所述区域是序列号15的碱基序列(犬钙镁蛋白基因)中的755～1318号及序列号17的碱基序列(人钙镁蛋白)中的795～1358号碱基的区域，使用此引物也可以研究犬钙镁蛋白基因及/或人钙镁蛋白基因的任一者的表达。为比较对照，也同时使用了GAPDH特异性的引物(如序列号9与10所示)。其结果，如图3所示，犬钙镁蛋白基因在健康的犬类组织中显著表达于睾丸内，另一方面，也发现该基因在犬肿瘤细胞株中显著表达。人钙镁蛋白基因与犬钙镁蛋白基因同样，在人类正常组织中能够确认其表达的部位仅限于睾丸，但在人癌细胞中则于脑肿瘤、白血病、食道癌中均检测出其表达，因此可以确定人同源基因也特异性地表达于睾丸与癌细胞中。
需要说明的是，在图3中，纵轴上标号1表示钙镁蛋白基因的表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达谱。
实施例B-2：犬及人的钙镁蛋白的制备
(1)重组蛋白质的制备
基于实施例B-1中所得的序列号15的基因，通过以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：，加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使由实施例B-1中所得的噬粒溶液制备的供序列解析的载体为1μl、且使含有BamHI及EcoRI限制性酶剪切序列的两种引物(记载于序列号21及22)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制造)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分钟为一个循环，将该循环反复进行三十次。需要说明的是，上述两种引物是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号16的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制造)提纯出约1.9kbp的DNA片段。
将提纯出的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制造)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了扩增出的基因片段与靶序列一致。用BamHI及EcoRI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提纯后，将靶基因序列插入到经BamHI、EcoRI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制造)中。通过使用该载体可制得His标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过1mM IPTG进行表达诱导，使靶蛋白在大肠杆菌内表达。
另外，基于序列号17所示的基因，使用以下方法制得人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，实施例B-1所得的各种组织·细胞cDNA中已确认通过RT-PCR法表达的cDNA1μl，使含有EcoRI及XhoI限制性酶剪切序列的两种引物(如序列号23及24所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制造)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分钟为一个循环，将该循环重复进行三十次。需要说明的是，上述两种引物是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号18的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制造)提纯出约1.9kbp的DNA片段。
将提纯出的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制造)连接。将其转化至大肠杆菌中后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用EcorRI及XhoI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提纯后，将靶基因序列插入到经EcoRI、XhoI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制造)中。通过使用该载体可制得His标记融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过1mM IPTG进行表达诱导，使靶蛋白在大肠杆菌内表达。
(2)重组蛋白质的提纯
将由上述方法获得的、表达序列号15及序列号17所述序列的各个重组大肠杆菌在含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中在37℃下进行培养直至600nm处吸光度为0.7左右之后，添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷至终浓度为1mM，进一步在37℃下培养4小时。之后以4800rpm离心10分钟集菌。将此菌体块悬浮在磷酸盐缓冲生理盐水中，进一步以4800rpm离心10分钟清洗菌体。
将所得菌体块悬浮于20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，在冰上进行超声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以6000rpm离心分离20分钟，所得上清为可溶馏分，沉淀为不溶馏分。
将可溶组分添加至离子交换柱(载体SP Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司)，柱容量5mL，平衡缓冲液20mM磷酸缓冲液(pH7.0))中。以柱容量10倍量的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)清洗之后，用含有0.3M-1.0M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)通过盐的阶段性的浓度梯度进行洗脱。分别取为柱容量6倍量的各洗脱馏分。
在洗脱馏分中，将含有0.3M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)馏分的第1至第6馏分、与含有1.0M氯化钠的20mM磷酸缓冲液馏分的第1馏分合并，通过二次柱，进一步提纯。
二次柱使用的柱载体为Bio gel HT Type II(BioRad公司)，柱容量为5mL。用柱容量10倍量的含有0.3M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡化之后，添加上述洗脱馏分。用柱容量10倍量的含有0.3M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)与0.1M磷酸缓冲液，清洗未吸附馏分后，用0.2M磷酸缓冲液洗脱，作为提纯馏分，以后即使用此提纯馏分作为给与试验用的材料。需要说明的是，洗脱馏分中的靶蛋白，通过根据常用方法进行的考马斯染色来确认。其中，犬钙镁蛋白如图4所示。
由上述方法所得的提纯样品中取200μl分注到1ml反应用缓冲液(20mM Tris-Hcl，50mM NaCl，2mM CaCl2pH7.4)中后，添加2μl肠激酶(Novagen公司制造)后，在室温下静置一晚令其反应，切除His标签，使用Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen公司制造)按照所附操作说明书进行提纯。然后，使用超滤NANOSEP 10K OMEGA(PALL公司制造)将1.2ml上述方法所得的提纯标准品进行生理用磷酸缓冲液(日水制药社制造)置换后，用0.22μm HT Tuffryn Acrodisc(PALL公司制造)进行无菌过滤，用于以下的实验。
实施例B-3：对罹癌犬给与重组蛋白质的实验
(1)抗肿瘤评价
评价用上述方法提纯的两种重组蛋白质对表皮患有肿瘤的两只罹癌犬(两只患有乳腺肿瘤的犬)的抗肿瘤效果。
在如上所述提纯的重组犬钙镁蛋白与人钙镁蛋白各100μg(0.5ml)中混合等量的弗氏不完全佐剂(和光纯药社制造)，作为癌症治疗剂，向膀胱附近的所属淋巴结给与该治疗剂共3次，给与时间分别为初次、初次给与3日后以及7日后。其结果，在给与癌症治疗剂时是大小分别约为45mm3与78mm3的肿瘤，而在癌症治疗剂初次给与10日后，分别缩小至约27mm3与46mm3，20日后分别缩小至约15mm3与26mm3，30日后分别缩小至约7mm3与15mm3。
另外，在上述犬钙镁蛋白100μg(0.5ml)中混合0.5ml弗氏不完全佐剂，将所得的混合物按照与上述同样的间隔给与患有恶性黑色素瘤的犬，总计给与三次。另外，同时每次皮下给与100μg犬白细胞介素12。其结果，在给与癌症治疗剂时大小约为38mm3的肿瘤，在癌治疗剂初次使用21日后完全萎缩。
(2)免疫诱导能力的评价
在给与癌治疗剂前与初次给与10日后以及30日后的各时间点采集在上述(1)的给与试验中已取得抗肿瘤效果的患病犬的血液，使用常规方法分离出末梢血单核细胞，并将其用于IFNγ酶联免疫斑点法，对给与的各重组蛋白质进行免疫诱导能力的评价。
将70％乙醇以100μL/孔分别添加到Millipore公司制造的96孔培养板(MultiScreen-IP,MAIPS4510)中，静置5分钟，吸取并弃去后，用灭菌水清洗，以300μl/孔添加200mM碳酸氢钠(pH8.2)静置5分钟后，吸取并弃去，清洗培养板。然后，将添加在200mM碳酸氢钠(pH8.2)中的抗犬干扰素γ单克隆抗体(R&D公司制造，clone142529，MAB781)以0.5μg/孔分别添加到培养板中，在37℃下温育一晚，使第一抗体固相化。吸取并弃去第一抗体后，将封闭溶液(1％BSA-5％蔗糖-200mM碳酸氢钠(pH8.2))以300μl/孔分别添加到培养板中，在4℃下温育一晚，封闭培养板。吸取并弃去封闭液后，以300μl/孔分别添加含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen公司制造)，静置5分钟后吸取并弃去培养基。之后，将悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中的犬末梢血单核细胞分别以5×105/孔添加到培养板的各个孔中，以10μl/孔向其中分别各次给药中使用的犬钙镁蛋白或人钙镁蛋白，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时，从而使存在于末梢血单核细胞中的免疫细胞产生干扰素γ。培养后，弃去培养基，用清洗液(0.1％Tween20-200mM碳酸氢钠(pH8.2))将孔清洗6次。将用上述封闭液稀释1000倍的兔抗犬多克隆抗体以100μL/孔分别添加到各个孔中，在4℃下温育一晚。将孔用上述清洗液清洗3次后，向各个孔中分别添加用上述封闭液稀释1000倍的HRP标记抗兔抗体100μl，在37℃下使其反应2小时。将孔用上述清洗液清洗3次后，用Konica免疫显色剂(Konica公司制造)显色，清洗孔使反应停止。反应停止后，使膜干燥，将孔图像化，用KS Elispot Compact System(Carl Zeiss，德国)计算斑点形成细胞(SFC)数。
其结果，无论给与犬钙镁蛋白或人钙镁蛋白的患病犬，在给与之前的末梢血单核细胞中均未检出斑点。另一方面，对给与犬钙镁蛋白的患病犬，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检出斑点15个、45个。另外，对给与人钙镁蛋白的患病犬，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检出斑点12个、39个。
根据上述结果可以确认，所有施药的患病犬，都可以诱导免疫细胞，该免疫细胞与给与的重组蛋白质特异性地反应且产生干扰素γ，一般认为通过以上述免疫细胞为中心的免疫反应，能够发挥上述(1)所述的抗肿瘤效果。
实施例C-1：通过SEREX法制取新型癌抗原蛋白质
(1)构建cDNA文库
使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)从健康犬的睾丸组织中提取全RNA，用Oligotex-dT30mRNA purification Kit(宝酒造社制造)按照该试剂盒所附操作说明书提纯多聚A RNA。
使用由此所得的mRNA(5μg)，构建出犬睾丸cDNA噬菌体文库。构建cDNA噬菌体文库时，使用cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE社制造)按照试剂盒所附的操作说明书构建cDNA文库。构建出的cDNA噬菌体文库大小为1.3×106pfu/ml。
(2)利用血清筛选cDNA文库
用上述已构建的源自犬睾丸的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中，使宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)感染使其为2340克隆，在42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，在37℃下用浸透了IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Hybond C Extra:GE Healthecare Bio-Science公司制造)覆盖培养板4小时，由此诱导·表达蛋白质，并使蛋白质转印到膜上。之后，回收该膜，将其浸在含0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一晚，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释500倍的患病犬血清反应2～3小时。
作为上述患病犬血清，使用从患有乳癌的犬体内采集的血清。这些血清保存在-80℃，在即将使用前进行预处理。血清预处理的方法按照如下方法进行。即，用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)之后，在NZY培养板的培养基上在37℃下培养一晚。然后向培养板中添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3pH8.3缓冲液，在4℃静置15小时后，回收上清作为大肠杆菌/噬菌体提取液。然后将回收的大肠杆菌/噬菌体提取液通过NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制造)，将来自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。在此蛋白质固定化柱中使患病犬血清通过·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。用含有0.5％脱脂奶粉的TBS将只是仅仅通过柱子的血清馏分稀释500倍，将其作为免疫筛选的材料。
将经上述处理血清和上述融合蛋白质印迹的膜用TBS-T(0.05％Tween20/TBS)清洗4次之后，将用含0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat Anti Dog IgG-h+I HRP conjugated:BETHYL Laboratories公司制造)作为第二抗体在室温下反应1小时，使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制造)通过酶显色反应检出，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，是其溶解在500μl SM缓冲液(100mM NaCl，10mM MgClSO4，50mM Tris-HCl，0.01％明胶pH7.5)中。采用与上述相同的方法将显色反应呈阳性的菌落反复筛选二次、三次直至菌落单一化，筛选出与血清中IgG反应的30940个噬菌体克隆，分离出一个阳性克隆。
(3)分离抗原基因的同源性检索
为了将通过上述方法分离的1个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作从噬菌体载体转换为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL-1-Blue MRF’)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与100μl经提纯的噬菌体溶液以及1μl ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制造)混合后，在37℃下反应15分钟后，添加3ml LB培养基，在37℃下培养2.5～3小时，立即置于70℃水浴中保持温度20分钟，之后在4℃下以1000×g离心15分钟，回收上清作为噬粒溶液。然后，将噬粒宿主大肠杆菌(SOLR)制成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与10μl经提纯的噬菌体溶液混合后，在37℃下反应15分钟，取50μl播于含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一晚。采集经转化的SOLR的单菌落，用含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB培养基在37℃下培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN公司制造)提纯含有目标插入片段的质粒DNA。
提纯所得的质粒，使用序列号5所记载的T3引物与序列号6所记载的T7引物，通过引物步移法来解析插入片段的全长序列。通过该测序手段获得了序列号25所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列，运行同源性检索程序BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因同源性的检索后，结果表明所得的基因与序列号27所示的CEP基因的碱基序列·氨基酸序列均显示99％的(其中，只计算了相重叠的序列)同源性，判断该基因为CEP基因。犬CEP的人同源蛋白为人CEP(与序列号25所示的CEP基因的同源性：碱基序列87％，氨基酸序列84％)。人CEP的碱基序列如序列号29所示，氨基酸序列如序列号30所示。
(4)在各种组织中的表达解析
对于通过上述方法所得的基因，通过RT-PCR法(Reverse Transcription-PCR法)研究其在犬与人的正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制造)按照所附操作说明书从50～100mg各种组织及各种细胞株5-10×106个的细胞中提取全RNA。通过Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen公司制造)按照所附的操作说明书，用上述全RNA合成cDNA。人正常组织(脑，海马，睾丸，结肠，胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制造)，QUICK-Clone cDNA(Clontech公司制造)及Large-Insert cDNA Library(Clontech公司制造)。PCR反应使用对获得的基因具有特异性的引物(如序列号31与32所示)按照下列方法进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中，通过逆转录反应制得的样品为0.25μl，使上述引物各为2μM、各种dNTP为0.2mM、ExTaq聚合酶(宝酒造社制造)为0.65U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以94℃-30秒、55℃-30秒、72℃-30秒为一个循环，将该循环反复进行三十次。需要说明的是，上述基因特异性的引物，是扩增下述区域的引物，所述区域是序列号25与27的碱基序列中的4582～5124号及序列号29的碱基序列中的4610～5152号碱基所在的区域，也可使用此引物来研究犬CEP基因及/或人CEP基因的任一者的表达。为了比较对照，也同时使用对GAPDH特异性的引物(如序列号9与10所示)。其结果如图5所示，犬CEP基因在健康的犬类组织中显著表达于睾丸，另一方面，也发现该基因在犬乳癌细胞中显著表达。人CEP基因的表达与犬CEP基因相同，在人正常组织中能够确认其表达的部位仅限于睾丸，但在人癌细胞中则于脑肿瘤、白血病、食道癌中均检测出其表达，由于在白血病细胞株中特别显著地表达，所以可以确认人CEP基因也特异性地表达于睾丸与癌细胞中。
需要说明的是，在图5中，纵轴的标号1表示CEP基因的表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达谱。
实施例C-2：犬及人CEP的制备
(1)重组蛋白质的制备
基于实施例C-1中所得的序列号25的基因，通过以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使由实施例C-1中所得的噬粒溶液制得的供序列解析用的载体为1μl，使含有BamHI及SalI限制性酶剪切序列的2种引物(记载于序列号33及34)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制造)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以98℃-10秒、55℃-5秒、72℃-7分钟为一个循环，将循环反复进行三十次。需要说明的是，上述2种引物，是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号26的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制造)提纯出约7.0kbp的DNA片段。
将提纯出的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制造)连接。将其转化至大肠杆菌后，回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用BamI及SalI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，在用QIAquick Gel Extraction Kit提纯后，将靶基因序列插入到经BamHI、SalI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制造)中。通过使用该载体可制得His标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过1mM IPTG进行表达诱导，使靶蛋白在大肠杆菌内表达。同样，基于序列号27的基因，以犬睾丸cDNA为模板，使用含有BamH1与SalI1限制性酶剪切序列的两种引物(序列号33与35)，制得已注册的犬CEP基因的重组蛋白质。需要说明的是，上述两种引物是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号28的氨基酸序列全长的约7.8kpb区域.
此外，基于序列号29的基因，使用以下方法制得人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，实施例C-1制备的各种组织·细胞cDNA中已确认通过RT-PCR法表达的cDNA1μl，使含有BamHI及SalI限制性酶剪切序列的两种引物(如序列号36及37所示)各为0.4μM、dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制造)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以98℃-10秒、55℃-5秒、72℃-7分钟为一个循环，将该循环重复进行三十次。需要说明的是，上述两种引物，是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号30的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对经扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制造)提纯出约7.0kbp的DNA片段。
将提纯出的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制造)连接。将其转化至大肠杆菌后，回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用BamHI及SalI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提纯后，将靶基因序列插入到经BamHI、SalI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30a(Novagen公司制造)中。通过使用该载体可制得His标记融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过1mM IPTG进行表达诱导，使靶蛋白在大肠杆菌内表达。
(2)重组蛋白质的提纯
将上述获得的、表达序列号25、序列号27及序列号29所示序列的各个重组大肠杆菌，用含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基在37℃下培养直至600nm处的吸光度为0.7左右之后，添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷至终浓度为1mM，在37℃下培养20小时。之后以4800rpm离心10分钟集菌。将菌体球状物悬浮在磷酸盐缓冲生理盐水中，进一步以4800rpm离心10分钟清洗菌体。
将上述菌体悬浮于磷酸缓冲生理盐水中，在冰上进行超声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以7000rpm离心分离20分钟，所得上清为可溶馏分，沉淀为不溶馏分。将不溶馏分悬浮于Triton X-100溶液中，以7000rpm离心20分钟。重复该操作2次，进行除去蛋白酶处理。之后，将残渣悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，进行脱表面活性剂的操作。将该残渣悬浮于含有8M尿素的10mM Tris盐酸、100mM磷酸缓冲液(以下称为8M尿素溶液)及蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktails)中，在4℃下静置20小时，使蛋白质变性。
上述变性处理后，以7000rpm离心20分钟，将所得可溶组分添加到按照常用方法制得的镍螯合柱(载体：Chelateing Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司)，柱容量5mL，平衡缓冲液：8M尿素溶液)中，进一步在4℃下静置一晚。将该柱载体以1500rmp离心5分钟，回收上清液，柱载体用磷酸盐缓冲生理盐水悬浮后，再次填充到柱中。未被柱吸附的组分用柱容量5倍量的8M尿素溶液与柱容量10倍量的含0.5M氯化钠的0.1M乙酸缓冲液(pH4.0)及含有10mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)清洗处理后，立即用分为5阶段的100mM-500mM咪唑阶段性的浓度梯度进行洗脱，制成提纯馏分，以后将该提纯馏分作为给与试验用的材料。需要说明的是，各洗脱馏分中的靶蛋白，通过按照常用方法进行的考马斯染色法进行确认。其中，序列号26所示的重组犬CEP如图6所示。
由上述方法所得的提纯标准品中取200μl分注到1ml反应缓冲液(20mM Tris-Hcl，50mM NaCl，2mM CaCl2pH7.4)中后，添加2μl肠激酶(Novagen公司制造)后，在室温下静置一晚令其反应，切除His标签，使用Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen公司制造)按照所附的操作说明书进行提纯。然后，将由上述方法所得的提纯标准品1.2ml用超滤NANOSEP 10K OMEGA(PALL公司制造)进行生理用磷酸缓冲液(日水制药社制造)置换后，用0.22μm HT Tuffryn Acrodisc(PALL公司制造)进行无菌过滤，用于以下的实验。
实施例C-3：对罹癌犬给与重组蛋白质的实验
(1)抗肿瘤评价
评价用上述方法提纯的两种重组蛋白质对表皮患有肿瘤的两只罹癌犬(两只患有肛周腺肿瘤的犬)的抗肿瘤效果。
在如上所述提纯的序列号26所示的重组犬CEP及人CEP分别100μg(0.5ml)中混合等量的弗氏不完全佐剂(和光纯药社制造)，制成癌症治疗剂，向肿瘤附近的所属淋巴结给与上述治疗剂共计3次，给与时间分别为初次、初次给与3日后及7日后。其结果，在给与癌症治疗剂时大小分别为约87mm3与69mm3的肿瘤，在癌症治疗剂初次给与10日后分别缩小至约69mm3与56mm3，20日后分别缩小至约24mm3与31mm3，30日后分别缩小至约10mm3与8mm3。
此外，在序列号26所示的犬CEP蛋白100μg(0.5ml)中混合0.5ml的弗氏不完全佐剂，将所得混合物与上述相同地给与患有乳腺癌的犬共计三次。另外，同时每次皮下给与10MU重组型猫干扰素“Intercat”。其结果，在给与癌症治疗剂时大小约为126mm3的肿瘤，在癌治疗剂初次使用26日后完全萎缩。需要说明的是，即使在使用序列号28所记载的犬CEP时也同样具有对罹癌犬的抗肿瘤效果。
进而，在序列号26所记载的犬CEP蛋白质100μg(0.5ml)中混合0.5ml的弗氏不完全佐剂，将所得的混合物与上述相同地给与患有肥大细胞瘤的犬共计三次。另外，同时每次皮下给与100μg犬白细胞介素12。结果，在给与癌症治疗剂时大小约为83mm3的肿瘤，在癌治疗剂初次使用18日后完全萎缩。
(2)免疫诱导能力的评价
在给与癌治疗剂前与初次给与10日后以及30日后的各个时间点，采集在上述(1)的给与试验中已取得抗肿瘤效果的患有肛周腺肿瘤的犬的血液，使用常规方法分离出末梢血单核细胞，使用其，通过IFNγ酶联免疫斑点法对已给与的蛋白质进行免疫诱导能力的评价。
将70％乙醇以100μL/孔分别添加到Millipore公司制造的96孔培养板(MultiScreen-IP,MAIPS4510)中，静置5分钟，吸取并弃去，然后用灭菌水清洗，以300μl/孔添加200mM碳酸氢钠(pH8.2)，静置5分钟后，吸取并弃去，清洗培养板。然后，将添加在200mM碳酸氢钠中的抗犬干扰素γ单克隆抗体(R&D公司制造，clone142529，MAB781)以0.5μg/孔分别添加到培养板中，在37℃下温育一晚，使第一抗体固相化。吸取并弃去第一抗体后，以300μl/孔分别添加封闭溶液(1％BSA-5％蔗糖-200mM碳酸氢钠(pH8.2))，在4℃下温育一晚将培养板封闭。吸取并弃去封闭液后，以300μl/孔分别添加含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen公司制造)，静置5分钟后吸取并弃去培养基。之后，将悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中的犬末梢血单核细胞分别以5×105/孔添加到培养板的各个孔中，将用于施药的序列号26所示的犬CEP或人CEP分别以10μl/孔添加到培养板的各个孔中，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时，由此使存在于末梢血单核细胞中的免疫细胞产生干扰素γ。培养后，弃去培养基，用清洗液(0.1％Tween20-200mM碳酸氢钠(pH8.2))将孔清洗6次。将用上述封闭液稀释1000倍的兔抗犬多克隆抗体以100μL/孔分别添加到各个孔中，在4℃下温育一晚。将孔用上述清洗液清洗3次后，向各个孔中分别添加100μl用上述封闭液稀释1000倍的HRP标记抗兔抗体，在37℃下反应2小时。将孔用上述清洗液清洗3次后，用Konica免疫显色剂(Konica公司制造)显色，清洗孔使反应停止。反应停止后，使膜干燥，将孔图像化，用KS Elispot Compact System(Carl Zeiss，德国)计算斑点形成细胞(SFC)数。
结果，无论给与序列号26所示的犬CEP或人CEP的患病犬，在给与前的末梢血单核细胞中均未检出斑点。另一方面，给与犬CEP的患病犬，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检出斑点23个、52个。另外，给与人CEP的患病犬，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检出斑点19个、49个。
根据上述结果可以缺认，所有施药的患病犬，都可以诱导免疫细胞，该免疫细胞与给与的重组蛋白质特异性地反应且产生干扰素γ，一般认为通过以该免疫细胞为中心的免疫反应，能够发挥上述(1)所述的抗肿瘤效果。
实施例D-1：通过SEREX法制取新型癌抗原蛋白质
(1)构建cDNA文库
使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)从健康犬的睾丸组织中提取全RNA，用Oligotex-dT30mRNA purification Kit(宝酒造社制造)按照该试剂盒所附操作说明书提纯出多聚A RNA。
使用由此所得的mRNA(5μg)，构建出犬睾丸cDNA噬菌体文库。构建cDNA噬菌体文库时，使用cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE社制造)按照试剂盒所附的操作说明书，构建cDNA文库。构建出的cDNA噬菌体文库大小为1.3×106pfu/ml。
(2)利用血清筛选cDNA文库
用上述已构建的源自犬睾丸的cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体而言，在Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中，使宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)感染使其为2340克隆，在42℃下培养3～4小时，形成溶菌斑(plaque)，在37℃下用浸透了IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素滤膜(Hybond C Extra:GE Healthecare Bio-Science公司制造)覆盖培养板4小时，由此诱导·表达蛋白质，并使蛋白质转印到膜上。之后，回收该膜，将其浸在含0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl pH7.5)中，在4℃下振荡一晚，由此抑制非特异性反应。在室温下使此过滤膜与稀释500倍的患病犬血清反应2～3小时。
作为上述患病犬血清，使用从患有乳癌的犬体内采集的血清。这些血清保存在-80℃，在即将使用前进行预处理。血清预处理的方法如下。即，用未插入外来基因的λZAP Express噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)之后，在NZY培养板的培养基中在37℃下培养一晚。然后，向培养板中添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3pH8.3缓冲液，在4℃下静置15小时后，回收上清作为大肠杆菌/噬菌体提取液。然后，将回收的大肠杆菌/噬菌体提取液通过NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制造)，将来自大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。在此蛋白质固定化的柱中使患病犬血清通过·反应，从血清中除去吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体。将只是仅仅通过柱子的血清馏分用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释500倍，将其作为免疫筛选的材料。
将经上述处理血清和上述融合蛋白质印迹的膜用TBS-T(0.05％Tween20/TBS)清洗4次之后，将用含0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗犬IgG(Goat Anti Dog IgG-h+I HRP conjugated:BETHYL Laboratories公司制造)作为第二抗体在室温下使其反应1小时，使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制造)通过酶显色反应检出，从Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板中采集与显色反应阳性部位相一致的菌落，使其溶解在500μl SM缓冲液(100mM NaCl，10mM MgClSO4，50mM Tris-HCl，0.01％明胶pH7.5)中。采用与上述同样的方法将显色反应呈阳性的菌落反复筛选二次、三次，直至菌落单一化，筛选与血清中IgG反应的30940个噬菌体克隆，分离出一个阳性的克隆。
(3)分离抗原基因的同源性检索
为了将通过上述方法分离所得的一个阳性克隆用于碱基序列解析，进行操作将噬菌体载体转换为质粒载体。具体而言，将宿主大肠杆菌(XL-1-Blue MRF’)制备成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与100μl经提纯的噬菌体溶液、以及1μl ExAssist helper phage(STRATAGENE公司制造)混合后，在37℃反应15分钟，然后，添加3ml LB培养基，在37℃下培养2.5～3小时，立即用70℃水浴温育20分钟，之后在4℃1000×g下离心15分钟，回收上清作为噬粒溶液。然后，将噬粒宿主大肠杆菌(SOLR)制备成吸光度OD600为1.0的溶液，将上述溶液200μl与10μl经提纯的噬菌体溶液混合后，在37℃下反应15分钟，取50μl播于含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一晚。采集转化后的SOLR单菌落，用含有氨苄西林(终浓度50μg/ml)的LB培养基在37℃下培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN公司制造)提纯含有目标插入片段的质粒DNA。
提纯所得的质粒，使用序列号5所记载的T3引物与序列号6所记载的T7引物通过引物步移法来解析插入片段的全长序列。通过该序列解析获得了序列号38所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列及氨基酸序列，运行同源性检索程序BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，进行与已知基因的同源性检索，结果可以判定所得的基因为TRIP11基因。犬TRIP11的人同源因子为人TRIP11(同源性：碱基序列88％，氨基酸序列86％)。人TRIP11的碱基序列由序列号40所示，氨基酸序列由序列号41所示。
(4)在各种组织中的表达解析
对于通过上述方法所得的基因，通过RT-PCR法(Reverse Transcription-PCR法)研究其在犬与人的正常组织及各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制造)按照所附操作说明书，从50～100mg各种组织及各种细胞株5-10×106个的细胞中提取全RNA。通过Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen公司制造)按照所附操作说明书，用上述全RNA合成cDNA。人正常组织(脑，海马，睾丸，结肠，胎盘)的cDNA，使用Gene Pool cDNA(invitrogen公司制造)，QUICK-Clone cDNA(Clontech公司制造)及Large-Insert cDNA Library(Clontech公司制造)。PCR反应使用对获得的基因具有特异性的引物(如序列号42与43所示)按照下列方法进行。即，加入各试剂和附加缓冲液使总量为25μl，其中，使通过逆转录反应制得的样品为0.25μl，使上述引物各为2μM、各种dNTP为0.2mM、ExTaq聚合酶(宝酒造社制造)为0.65U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以94℃-30秒、55℃-30秒、72℃-1.5分钟为一个循环，将该循环反复进行三十次。需要说明的是，上述基因特异性的引物，是扩增下述区域的引物，该区域为序列号38的碱基序列(犬TRIP11基因)中的1519～2957号及序列号40的碱基序列(人TRIP11基因)中的1872～3310号碱基的区域，也可使用此引物来研究犬TRIP11基因及人TRIP11基因中任一者的表达。为了比较对照，也同时使用GAPDH特异性的引物(如序列号9与10所示)。其结果如图7所示，犬TRIP11基因，在健康的犬类组织中显著表达于睾丸，另一方面，发现该基因在犬乳癌细胞株中显著表达。人基因的表达与犬TRIP11基因相同，在人正常组织中能够确认其表达的部位仅限于睾丸，但在人癌细胞中则于脑肿瘤、白血病、乳癌，肺癌，食道癌细胞株等多种癌细胞株中均检测出其表达，因此可以确证人TRIP11也特异性地表达于睾丸与癌细胞中。
需要说明的是，在图7中，纵轴的标号1表示TRIP11基因的表达谱，标号2表示作为比较对照的GAPDH基因的表达谱。
实施例D-2：犬及人TRIP11蛋白质的制备
(1)重组蛋白质的制备
基于实施例D-1中所得的序列号38的基因，通过以下方法制备重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，使由实施例D-1中所得的噬粒溶液制得的供序列解析用的载体为1μl，使含有SalI及XhoI限制性酶剪切序列的两种引物(如序列号44及45所示)各为0.4μM，使dNTP为0.2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制造)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以98℃-10秒、55℃-5秒、72℃-6分钟为一个循环，将该循环反复进行三十次。需要说明的是，上述两种引物，是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号39的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制造)提纯出约6.0kbp的DNA片段。
将提纯出的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制造)连接。将其转化至大肠杆菌后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用SalI及XhoI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，在用QIAquick Gel Extraction Kit提纯后，将靶基因序列插入到经SalI、XhoI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30b(Novagen公司制造)中。通过使用该载体可制得His标签融合型重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)，通过利用1mM IPTG进行表达诱导，使靶蛋白在大肠杆菌内表达。
另外，基于序列号40的基因，使用以下方法制得人同源基因的重组蛋白质。PCR如下进行：加入各试剂和附加缓冲液使总量为50μl，其中，实施例D-1制备的各种组织·细胞cDNA中的已确认通过RT-PCR法表达的cDNA为1μl，使含有NdeI及KpnI限制性酶剪切序列的两种引物(如序列号46及47所示)各为0.4μM，使dNTP为0.2mM、使PrimeSTAR HS聚合酶(宝酒造社制造)为1.25U，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制造)，以98℃-10秒、55℃-5秒、72℃-6分钟为一个循环，将该循环反复进行三十次。需要说明的是，上述两种引物，是扩增下述区域的引物，所述区域是编码序列号41的氨基酸序列全长的区域。PCR之后，用1％琼脂糖凝胶对扩增的DNA进行电泳，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司制造)提纯出约6.0kbp的DNA片段。
将提纯出的DNA片段与克隆载体pCR-Blunt(invitrogen公司制造)连接。将其转化至大肠杆菌后回收质粒，通过测序确认了经扩增的基因片段与靶序列一致。用NdeI及KpnI限制性酶处理与靶序列一致的质粒，用QIAquick Gel Extraction Kit提纯后，将靶基因序列插入到经NdeI、KpnI限制性酶处理的大肠杆菌用表达载体pET30b(Novagen公司制造)中。通过使用该载体能够制得His标记融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用大肠杆菌BL21(DE3)中，通过利用1mM IPTG进行表达诱导，使靶蛋白在大肠杆菌内表达。
(2)重组蛋白质的提纯
将上述获得的、表达序列号38及序列号40所述序列的各个重组大肠杆菌用含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基在37℃下培养直至600nm处吸光度为0.7左右之后，添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷至终浓度为1mM，在37℃下培养20小时。之后以4800rpm离心10分钟集菌。将菌体块悬浮在磷酸盐缓冲生理盐水中，进而以4800rpm离心10分钟清洗菌体。
将所得菌体块悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，在冰上进行超声裂解。将大肠杆菌超声裂解液以7000rpm离心分离15分钟，所得上清为可溶馏分，沉淀为不溶馏分。
将不溶馏分悬浮于4％Triton X-100溶液中，以7000rpm离心10分钟。重复该操作2次，进行除去蛋白酶处理。之后，将残渣悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，进行脱表面活性剂的操作。
将该残渣悬浮于含有6M胍盐酸盐的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，在4℃下静置20小时，使蛋白质变性。变性处理后，以7000rpm离心20分钟，将所得可溶馏分添加至按照常用方法制得的镍螯合柱(载体：Chelateing Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care公司)，柱容量5mL，平衡缓冲液：含有6M胍盐酸盐的20mM磷酸缓冲液(pH8.0))中。将未被吸附的馏分用柱容量10倍量的含有6M胍盐酸盐的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)及含有10mM咪唑的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)进行清洗处理后，立即用分为4阶段的50mM-500mM咪唑阶段性的浓度梯度进行洗脱，形成提纯馏分，以后，使用该提纯馏分作为给与试验用的材料。需要说明的是，洗脱馏分中的靶蛋白，根据按照常用方法进行的考马斯染色法进行确认。其中，犬TRIP11蛋白质如图8所示。
上述方法所得的提纯标准品中取200μl分注到1ml反应用缓冲液(20mM Tris-Hcl，50mM NaCl，2mM CaCl2pH7.4)中后，添加2μl肠激酶(Novagen公司制造)后，在室温下静置一晚令其反应，切除His标签，用Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen公司制造)按照所附操作说明书提纯靶蛋白。然后，将上述方法所得的提纯标准品1.2ml用超滤NANOSEP 10K OMEGA(PALL公司制造)进行生理用磷酸缓冲液(日水制药社制造)置换后，用0.22μm HT Tuffryn Acrodisc(PALL公司制造)进行无菌过滤，用于以下的实验。
实施例D-3：对罹癌犬给与重组蛋白质的实验
(1)抗肿瘤评价
评价用上述方法提纯的两种重组蛋白质对表皮患有肿瘤的两只罹癌犬(两只患有乳腺肿瘤的犬)的抗肿瘤效果。
在如上述所述提纯的重组犬TRP11及人TRIP11各100μg(0.5ml)中混合0.5ml弗氏不完全佐剂(和光纯药社制造)，作为癌症治疗剂。向肿瘤附近的所属淋巴结给与该治疗剂共计三次，给与时间分别为初次，初次给与3日后以及7日后。其结果，在给与癌症治疗剂时大小分别为约75mm3与102mm3的肿瘤，在癌症治疗剂初次给与10日后分别缩小至约63mm3与85mm3，20日后分别缩小至约35mm3与42mm3，30日后分别缩小至约15mm3与19mm3。
另外，在犬TRP11蛋白质100μg(0.5ml)中混合0.5ml的弗氏不完全佐剂，与上述相同地将所得混合物给与患有肥大细胞瘤的犬共计三次，另外同时每次皮下给与100μg犬白细胞介素12。其结果，在给与癌症治疗剂时大小约为165mm3的肿瘤，在癌治疗剂初次使用23日后完全萎缩。
(2)免疫诱导能力的评价
从上述(1)的给与试验中已经获得抗肿瘤效果的患有乳腺肿瘤的犬中采集血液，按照常规方法分离出末梢血单核细胞，使用其通过IFNγ酶联免疫斑点法对给与的各种重组蛋白质进行免疫诱导能力评价。
将70％乙醇以100μl/孔分别添加到Millipore公司制造的96孔培养板(MultiScreen-IP,MAIPS4510)中，静置5分钟，吸取并弃去后，用灭菌水清洗，以300μl/孔添加200mM碳酸氢钠(pH8.2)，静置5分钟后，吸取并弃去，清洗培养板。然后，将添加在200mM碳酸氢钠(pH8.2)中的抗犬干扰素γ单克隆抗体(R&D公司制造，clone142529，MAB781)以0.5μg/孔分别添加到培养板中，在37℃下温育一晚，使第一抗体固相化。吸取并弃去第一抗体后，以300μl/孔添加封闭溶液(1％BSA-5％蔗糖-200mM碳酸氢钠(pH8.2))，在4℃下温育一晚，将培养板封闭。吸取并弃去封闭液后，以300μl/孔添加含有10％胎牛血清的RPMI培养基(Invitrogen公司制造)，静置5分钟，吸取并弃去培养基。之后，将悬浮在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中的犬末梢血单核细胞以5×105/孔分别添加到培养板中，将用于施药的犬TRIP11或人TRIP11分别以10μl/孔添加到上述培养板的各个孔中，在37℃，5％CO2的条件下培养24小时，从而使存在于末梢血单核细胞中的免疫细胞产生干扰素γ。培养后，弃去培养基，用清洗液(0.1％Tween20-200mM碳酸氢钠(pH8.2))将孔清洗6次。将用上述封闭液稀释1000倍的兔抗犬多克隆抗体以100μl/孔分别添加到各个孔中，在4℃下温育一晚。将孔用上述清洗液清洗3次后，将用上述封闭液稀释1000倍的HRP标记抗兔抗体以100μl/孔分别添加到各个孔中，在37℃下反应2小时。将孔用上述清洗液清洗3次后，用Konica免疫显色剂(Konica公司制造)显色，清洗孔使反应停止。反应停止后，使膜干燥，将孔图像化，用KS Elispot Compact System(Carl Zeiss，德国)计算斑点形成细胞(SFC)数。
其结果，无论给与犬TRIP11蛋白还是人TRIP11蛋白的患病犬，在给与前的末梢血单核细胞中均未检出斑点。与之相对，给与了犬TRIP11的患病犬，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检出斑点26个、65个。另外，给与了人TRIP11的患病犬，在给与10天后及30天后的末梢血单核细胞中分别检出斑点31个、72个。
由上述结果可以确认，所有施药的患病犬，都能够诱导免疫细胞，该免疫细胞与给与的重组蛋白质特异性反应产生干扰素γ，一般认为通过上述以该免疫细胞为中心的免疫反应，能够发挥上述(1)所述的抗肿瘤效果。