一种microRNA分子用于检测和治疗乳腺癌的用途的制作方法

本发明涉及一种microRNA分子用于检测和治疗乳腺癌的用途。具体地，本发明涉及microRNA-4306分子作为诊断标志物诊断三阴性乳腺癌(TNBC)的用途。本发明还涉及microRNA-4306分子在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途。
背景技术：
：利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测来判断恶性肿瘤患者不同亚型，进而为个体化治疗这些疾病提供便利。乳腺癌是世界范围内妇女常见的恶性肿瘤，近年来我国乳腺癌的发病率明显升高，其发病率和死亡率位居女性恶性肿瘤之首，且呈上升趋势。乳腺癌是一类分子水平上具有高度异质性的疾病。即使是组织形态学相同的肿瘤，其分子遗传学改变也可能不尽一致，从而导致肿瘤治疗方案的差别。在乳腺癌中三阴性乳腺癌(雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均阴性)占10-15％，同非三阴性乳腺癌相比，具有独特的形态、亚结构、免疫组化特征。其易发生早期复发、远处转移、临床预后差并缺乏内分泌治疗和抗HER2靶向治疗的机会，目前尚无针对性的标准治疗方案。三阴性乳腺癌的内科治疗仍以化疗为主。美国食品药品监督管理局(FDA)尚未批准任何专门针对三阴性乳腺癌的药物。晚期三阴性乳腺癌的治疗选择有限。多数患者早已接受蒽环类、紫杉类和环磷酰胺治疗，一旦复发转移，可选择的药物很少，患者的预后极差。因此，新的治疗策略为改善三阴性乳腺癌预后所迫切需要。分子靶向治疗为近年来研究热点，并在部分恶性肿瘤治疗中取得突破性进展。如吉非替尼(irresa)治疗非小细胞肺癌，尤其女性、不吸烟、腺癌患者预后更佳；伊马替尼治疗胃肠道间质瘤，特别是对于有Kit外显子11突变者可获得更好的疗效，参见NilssonB,S.K., KindblomLG,etal(2007)."Adjuvantimatinibtreatmentimprovesrecurrence-freesurvivalinpatientswithhigh-riskgastrointestinalstromaltumours(GIST)."BrJCancer96:1656-1658.；C225。联合放疗治疗局部晚期头颈部癌，较单纯放疗，生存率提高近1倍,参见FischerB,MarinovM,ArcaroABonnerJA,H.P.,GiraltJ,etal(2006)."Radiotherapypluscetuximabforsquamous-cellcarcinomaoftheheadandneck."NEnglJMed354:567-578。因此，进一步了解三阴性乳腺癌分子机制对改善预后有很大的帮助。Stevens,K.N.(参见Stevens,K.N.,C.M.Vachon,etal.(2013)."Geneticsusceptibilitytotriple-negativebreastcancer."CancerRes73(7):2025-2030)等就近年来这方面研究进行了总结：三阴性乳腺癌常伴有BRCA1通路的失活。BRCA1在同源DNA双链的重组和DNA双链修复中起着重要作用。而铂类药物可与DNA双链交联，导致DNA双链断裂，阻碍DNA双链复制、转录并最终导致细胞死亡。由此，理论上讲铂类药物治疗三阴性乳腺癌可能更有效。但令人遗憾的是临床上并未取得期望的疗效。鉴于此，从其它方面了解三阴性乳腺癌分子机制或许是治疗的突破点。小RNA分子(MicroRNA)一般由18-25个核苷酸组成，是非编码RNA分子，可以通过与mRNA结合抑制mRNA功能，调节翻译过程。近年来有为数不多关于microRNA与恶性肿瘤不同亚型和治疗关系的文献发表，分别在肺癌，肾癌中得到证实：microRNA可以作为区分恶性肿瘤不同亚型的标志物，并对恶性肿瘤治疗影响显著。而关于乳腺癌分子亚型三阴性乳腺癌的标志物和分子治疗靶点的研究未见报道。MicroRNA-4306(简称miR-4306)定位于13号染色体，含有17个核苷酸，其序列如SEQIDNO.1:5’-UGGAGAGAAAGGCAGUA-3’所示，其中microRNA-4306在基因组上的全长显示在GenBank登录号为：NR_036191.1,第99643059～99643149bp序列，91bp，其功能在文献中未见相关报道。技术实现要素：本发明第一方面涉及一种microRNA分子用于制备治疗患有乳腺癌的患者的药物中的用途，其中所述microRNA分子是 MicroRNA-4306，其序列如SEQIDNO：1(5’-UGGAGAGAAAGGCAGUA-3’)所示。特别地，本发明涉及一种microRNA分子用于制备治疗患有三阴性乳腺癌的患者的药物中的用途，其中所述microRNA分子是microRNA-4306，其序列如SEQIDNO：1(5’-UGGAGAGAAAGGCAGUA-3’)所示。再一方面，本发明涉及一种用于治疗患有乳腺癌的患者的药物组合物，其中所述药物组合物包括如权利要求1所述的microRNA-4306分子或如本发明所述的载体，以及药学上可接受的赋形剂。根据本发明所述的药物组合物，可已经被含有顺铂。又一方面，本发明涉及一种或多种特异地检测如SEQIDNO：1所示的microRNA-4306分子表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断乳腺癌患者的试剂中的用途。特别地，本发明涉及特异地检测如SEQIDNO：1所示的microRNA-4306分子表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断三阴性乳腺癌患者的试剂中的用途。在另一方面，本发明提供了一种诊断患有乳腺癌患者的方法，包括步骤：a)提供来自个体的乳腺癌组织和癌旁组织的样品；和b)确定样品中如microRNA-4306分子的表达水平；c)比较癌组织和癌旁组织的样品中microRNA-4306分子的表达水平。在另一方面，本发明提供了一种区分三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺患者的方法，包括步骤：a)提供来自个体的乳腺癌组织的样品；和b)确定样品中如microRNA-4306分子的表达水平；c)比较癌组织的样品中microRNA-4306分子的表达水平。在一个具体的实施方案中，用于microRNA反转录的引物SEQIDNO.2：5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTACTGC-3’；microRNA通用正义引物为SEQIDNO.3：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；特异反义引物SEQIDNO.4:5’-ACTCGTCTGGAGAGAAAGGCA-3’。具体地，在本发明的一个实施方案中，检测待测样品的步骤包括：1)提取不同分子亚型乳腺癌细胞株中的microRNA，2)基因芯片检测不同亚型乳腺癌细胞，筛选与三阴性乳腺癌相关的基因：microRNA-4306，3)芯片数据处理：单因素分析所得有统计学差异的microRNA，4)芯片数据验证：利用根据microRNA-4306基因序列设计的引物qRT-PCR扩增，5)PCR数据收集及处理：采用U6RNA作为内标，进行归一化处理。利用芯片所得模型评价乳腺癌的分子分型。附图说明图1：显示了在非三阴性乳腺癌细胞株(ZR-75-1、MCF-7)和三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、CAL-51)中的microRNA芯片分析结果。从芯片结果可以看出microRNA-4306在三阴性乳腺癌细胞中的表达相对于非三阴性乳腺癌细胞中的表达更低。图2：显示了根据前述的microRNA芯片分析结果，添加细胞系，非三阴性乳腺癌细胞株(ZR-75-1、SK-BR-3、MCF-7、T47D)和三阴性乳腺癌细胞株(HCC1937、MDA-MB-468、MDA-MB-231、CAL-51)，qRT-PCR验证三阴性乳腺癌细胞株中相对于非三阴性乳腺癌细胞株中miR-4306表达情况。从qPCR结果可以看出microRNA-4306在三阴性乳腺癌细胞中的表达相对于非三阴性乳腺癌细胞中更低。图3：显示了microRNA-4306在乳腺癌患者配对的癌和癌旁中的表达情况。图4：显示了microRNA-4306在不同分型乳腺癌患者的组织标本中的表达情况。图5A至图5C：显示了microRNA-4306在不同分型乳腺癌患者的组织标本中与淋巴结转移的关系。图5A，Luminal型乳腺癌；图5B，H型乳腺癌；图5C，三阴性乳腺癌。从qPCR结果看出，microRNA-4306只在三阴性乳腺癌中与淋巴结转移有关，在luminal型乳腺癌和H型乳腺癌中均与淋巴结转移无关。图6A至6D：显示了microRNA-4306抑制细胞的体外侵袭和迁移能力。图6A：MDA-MB-231细胞系分别加入miR对照，miR-4306后，抑制细胞的体外侵袭和迁移能力细胞染色示意图；图6B：CAL-51细胞系分别加入miR对照，miR-4306后，抑制细胞的体外侵袭和迁移能力细胞染色示意图；图6C:MDA-MB-231细胞系分别加入miR对照，miR-4306后，抑制细胞的体外侵袭和迁移能力柱状示意图；图6D:CAL-51细胞系分别加入miR对照，miR-4306后，抑制细胞的体外侵袭和迁移能力柱状示意图。图7A和图7B：显示了microRNA-4306抑制细胞的体外增殖能力。图7A：MDA-MB-231细胞系分别加入miR对照，miR-4306后，抑制细胞的体外增殖能力示意图；图7B：CAL-51细胞系分别加入miR对照，miR-4306后，抑制细胞的体外增殖能力示意图。图8A至8D：显示了microRNA-4306在裸鼠体内抑制三阴性乳腺癌细胞的生长和肺转移。图8A-8B：构建病毒载体的microRNA-4306感染CAL-51细胞，在雌性裸鼠双侧脂肪垫分别注射稳转细胞系CAL-51-microRNA-4306，CAL-51-对照，成瘤4周后，肿瘤大小的示意图。图8C-8D:构建病毒载体的microRNA-4306感染CAL-51细胞，在雌性裸鼠尾静脉分别注射稳转细胞系CAL-51-microRNA-4306，CAL-51-对照，一个月后，裸鼠发生肺转移的情况。图9A和9F：显示了microRNA-4306促进铂类药物(顺铂)诱导的三阴性乳腺癌细胞凋亡。图9A-9B：在MDA-MB-231或CAL-51细胞系中加入miR对照，miR-4306后，顺铂处理细胞，细胞凋亡的流式示意图。9C-9F：在MDA-MB-231或CAL-51细胞系中加入miR对照，miR-4306后，顺铂处理细胞，细胞凋亡的蛋白变化示意图。图9G-9H表明在MDA-MB-231或CAL-51细胞系中加入miR对照，miR-4306后，顺铂处理细胞，细胞凋亡的蛋白变化示意图。图10A和10B：显示了microRNA-4306在裸鼠体内促进铂类药物(顺铂)诱导的三阴性乳腺癌细胞凋亡。图10A：在雌性裸鼠脂肪垫注射CAL-51成瘤后，瘤内分别注射miR对照，microRNA-4306，腹腔注射铂类药物(顺铂)，肿瘤大小的示意图。图10B:在雌性裸鼠脂肪垫注射CAL-51成瘤后，瘤内分别注射miR对照，microRNA-4306，腹 腔注射铂类药物(顺铂)，肿瘤生长曲线的示意图。图10C:在雌性裸鼠脂肪垫注射CAL-51成瘤后，瘤内分别注射miR对照，microRNA-4306，腹腔注射铂类药物(顺铂)，肿瘤细胞凋亡的蛋白变化示意图。具体实施方式本发明人运用microRNA基因芯片及qRT-PCR技术对乳腺癌特别是三阴性乳腺癌进行了研究。本发明人出人意料的发现，microRNA-4306在乳腺癌细胞中的表达水平显著低于正常乳腺组织组织(参见图3)，且在不同亚型的乳腺癌细胞中，其表达水平也不同。在患者的组织标本中再次予以检测，得到了相似的结果。并且，在三阴性乳腺癌患者的组织标本中发现，大部分发生淋巴结转移的三阴性乳腺癌患者，microRNA-4306呈现低表达。因此，该基因可以作为一个很好的乳腺癌分子分型特别是区分非三阴性乳腺癌和三阴性乳腺癌的模型，并且可以作为区分三阴性乳腺癌是否淋巴结转移的模型。通过该模型，可以将乳腺癌分为非三阴性乳腺癌和三阴性乳腺癌两种类型，可以将三阴性乳腺癌分为非淋巴结转移和淋巴结转移两种类型，不同类型采用不同治疗方案，非三阴性乳腺癌可以采用内分泌治疗、抗HER2靶向治疗和化疗，三阴性乳腺癌可以采用其特异的敏感药物进行化疗，用microRNA-4306靶向治疗或者用microRNA-4306联合顺铂治疗。在将该基因应用于相应的基因芯片或试剂盒后，可快速地对哺乳动物包括人的乳腺癌进行非三阴性乳腺癌和三阴性乳腺癌的区分，可快速的判断三阴性乳腺癌患者是否有淋巴结转移的风险，可对三阴性乳腺癌患者进行microRNA-4306的靶向治疗或者microRNA-4306联合顺铂的治疗，从而对乳腺癌特别是三阴性乳腺癌治疗模式的改变具有划时代意义。在本发明的一个实施方案中，使用能够特异性地检测microRNA-4306分子表达水平的引物和/或探针，可快速地诊断哺乳动物包括人的乳腺癌，并对所述乳腺癌进行非三阴性乳腺癌和三阴性乳腺癌的区分，从而对乳腺癌特别是三阴性乳腺癌治疗模式的改变具有划时代意义。在本发明的另一个具体实施方案中描述了本发明涉及的检测方法，其主要包括microRNA提取、基因芯片制作、杂交及qRT-PCR验证等步骤。基因芯片检测主要用于筛选与三阴性乳腺癌相关的基因，筛选出的基因通过qRT-PCR进行结果验证。鉴于发明人已经找到和三阴性乳腺癌相关的基因，在今后临床应用中，仅运用microRNA提取及qRT-PCR两种技术即可。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作。因此，该模型在临床中容易被推广。具体地，本发明涉及的microRNA-4306分子检测方法主要包括microRNA提取、基因芯片制作、杂交及qRT-PCR验证等步骤。基因芯片检测主要用于筛选与三阴性乳腺癌相关的基因，筛选出的基因通过qRT-PCR进行结果验证。鉴于发明人已经找到和三阴性乳腺癌相关的基因，在今后临床应用中，仅运用microRNA提取及qRT-PCR两种技术即可。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作。因此，该模型在临床中容易被推广。在本发明的另一个具体实施方案中还描述了检测待测样品中microRNA-4306表达情况的方法，其包括如下步骤：1)提取不同分子亚型乳腺癌细胞株中的microRNA，2)基因芯片检测乳腺癌细胞，筛选与三阴性乳腺癌相关的基因：microRNA-4306，3)芯片数据处理：单因素分析所得有统计学差异的microRNA4)芯片验证：利用根据microRNA-4306基因序列设计的引物行PCR扩增，5)PCR数据收集及处理：采用U6RNA作为内标，进行归一化处理。利用芯片所得模型评价乳腺癌的分子分型。在本发明的另一个具体实施方案中，本发明人研究了microRNA-4306对三阴性乳腺癌细胞系体外侵袭迁移和增殖能力的影响。结果表明microRNA-4306抑制乳腺癌细胞的体外侵袭、迁移和生长能力，尤其是，microRNA-4306显著减弱三阴性乳腺癌细胞体外侵袭迁移和生长，抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭转移和增殖。因此，本发明所述的microRNA-4306可用于治疗患有乳腺癌的患者，特别地，本发明的microRNA-4306可用于治疗患有三阴性乳腺癌的患者。本发明将利用下述实施例进行进一步的描述，但本发明并不局限于这些实施例。在下述实施例中，若非特别说明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。除非另外指明，本发明实施例中涉及的RT-PCR、PCR等操作均按照“分子克隆实验指南(第三版)”(科学出版社，2002[美]J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著，黄培堂等译)及厂商说明书进行，细胞培养、细胞传代、细胞复苏及冻存、细胞转染及免疫荧光测定等操作均按照“动物细胞培养--基本技术指南(第四版)”(科学出版社，2000，[英]弗雷谢尼(R.I.)著，章静波等译)及厂商说明书进行操作。实施例1：检测microRNA-4306基因表达情况的方法1、Trizol法提取细胞、组织总RNA(1)样本来源乳腺癌样本来源于中国医学科学院肿瘤医院和齐齐哈尔医学院，有足够的福尔马林石蜡包埋组织或冰冻新鲜组织，以便获得充足的miRNA，有完备的医学书写记录。选择乳腺癌细胞系ZR-75-1、MCF-7、MDA-MB-231、CAL-51，进行microRNA芯片检测，筛选和三阴性乳腺癌相关的microRNA。选择乳腺癌细胞系ZR-75-1、SK-BR-3、MCF-7、T47D、HCC1937、MDA-MB-468、MDA-MB-231、CAL-51，验证芯片结果。选择200例福尔马林固定石蜡包埋组织和冰冻新鲜组织标本，验证芯片结果。(2)样本处理(细菌、细胞不用研磨)在铝箔中将1cm2大小左右的组织样本敲碎，移至已加入钢珠的Eppendorf管中，使用研磨仪(301/s，8min)进行研磨，注：此步操作应尽可能在低温液氮环境下操作，细菌、细胞样本不用研磨；(3)在研磨后的Eppendorf管中加入1mlTrizol，振荡混匀；(4)将混匀后溶液移至一新Eppendorf管中，加入200μl氯仿，振荡混匀；(5)离心：4℃，12000rpm，15min；(6)将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500μl异丙 醇，轻轻混匀，室温静置15min；(7)离心：4℃，12000rpm，15min；(8)倒掉上清液，加入1ml75％乙醇，振荡混匀；(9)离心：4℃，7500rpm，5min；(10)倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；(11)加入40～60μlDEPCH2O，65℃5min助溶；(12)-20℃冷冻保存。2、总RNA质量检测(1)NanoDrop测定总RNA浓度(2μl总RNA上样)，(2)1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量总RNA500ng5×LoadingBuffer2μlDEPCH2Oto8～9μl65℃变性5min，冰浴5minEB(500倍稀释)1μl总体积约为6～8μl。甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml1×TBEBuffer中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中(7.5×5.5cm)，室温静置30min左右即可使用。电泳条件：120～130V，15～20min。3、microRNA逆转录：(1)逆转录反应体系总RNA100ngmicroRNA反转录引物SEQIDNO.21μl(1μM)DEPCH2Oto12.3μl65℃变性5min，冰浴5min共20μl体系。(2)逆转录程序：16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃冷藏待用。4、microRNA实时PCR反应(1)microRNA实时PCR反应体系模版(cDNA)一般是逆转录反应体系20μl中的1μlMgCl21.6μl引物microRNA通用正义引物0.6μl(10μM)对于microRNA-4306:SEQIDNO.3特异反义引物0.6μl(10μM)对于microRNA-4306:SEQIDNO.4DNAMasterSYBRGreenIMIX2μl加无核酸酶H2O到20μl(2)microRNA实时PCR程序共40个循环，熔解曲线75～95℃。(3)microRNA实时PCR产物1.5％非变性(不加甲醛)琼脂糖凝胶电泳检测microRNA实时PCR产物2～4μl2×LoadingBuffer4μl总体积约为6～8μl。非变性琼脂糖凝胶：80ml1×TBEBuffer中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入2μlEB(原液)混匀，倒入制胶器中(15×15cm)，室温静置30min左右即可使用。电泳条件：100V，25～30min。5、数据收集及处理：采用U6RNA作为内标，进行归一化处理。实施例2：MicroRNA-4306抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭迁移和增殖的生物学作用研究1、实验步骤(1)细胞培养人三阴性乳腺癌细胞系：MDA-MB-231,DMEM培养基，含10％胎牛血清，37℃、5％CO2培养。人三阴性乳腺癌细胞系：CAL-51，DMEM培养基，含10％胎牛血清，37℃、5％CO2培养。(2)miRNA瞬时转染a.miRNA母液配制：在5nmol的miRNA中加入250μL1×通用缓冲液，得到浓度为20μmol/L的miRNA母液，b.取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于6孔板中(不加抗生素)，细胞密度达到70％左右时转染，c.准备以下复合体:A液：将适当浓度的miRNA稀释于250μL无血清培养基中，轻轻混匀。B液：Lipofectamine2000用前混匀，取6μL稀释于250μL无血清培养基，混匀，室温孵育5分钟，d.将稀释的脂质体与稀释的miRNA混合，轻轻混匀，室温孵育20分钟，e.将混合后的复合物500μL加入6孔板内，加无血清培养基2mL，轻轻混匀。6小时弃去原培养基，换含10％血清的DMEM培养基。(3)miRNA实时RT-PCRa.样本总RNA提取–Trizol法提取细胞总RNA(I)取生长状态良好的细胞，待细胞密度达到80％-90％时，倾出瓶中的培养液，用PBS洗2次；(II)加入1mLTrizol，轻轻晃动，置于冰上15分钟；(III)将混匀后溶液移至经DEPC处理的Eppendorf管中，加入200μl氯仿，振荡混匀；(IV)离心：4℃，12000rpm，15min；(V)将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min；(VI)离心：4℃，12000rpm，15min；(VII)倒掉上清液，加入1ml75％乙醇，振荡混匀；(VIII)离心：4℃，7500rpm，5min；(IX)倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；(X)加入40～60μlDEPCH2O，65℃5min助溶；(XI)-20℃冷冻保存。b.总RNA质量检测(I)NanoDrop测定总RNA浓度(2μl总RNA上样)，(II)1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，总RNA500ng5×加样缓冲液2μlDEPCH2Oto8～9μl65℃变性5min，冰浴5minEB(500倍稀释)1μl总体积约为6～8μl甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml1×TBEBuffer中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中(7.5×5.5cm)，室温静置30min左右即可使用。电泳条件：120～130V，15～20min。c.miRNA逆转录：表1：逆转录反应体系总RNA100ngmiRNA反转录引物1μl(1μM)DEPCH2O至12.3μl65℃变性5min，冰浴5min5×1st缓冲液4μl0.1MDTT2μldNTPs0.5μl(各10mM)RNase抑制剂0.2μl(40U/μl)M-MLV1μl(200U/μl)共20μl体系逆转录程序：16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃d.miRNA实时PCR反应表2：miRNA实时PCR反应体系表3：miRNA实时PCR程序酶激活95℃，10min扩增反应95℃，15s变性60℃，30s退火、延伸74℃，3s荧光检测共40个循环溶解曲线75～95℃miRNA实时PCR产物1.5％非变性(不加甲醛)琼脂糖凝胶电泳检测。miRNA实时PCR产物2～4μl。2×LoadingBuffer4μl总体积约为6～8μl非变性琼脂糖凝胶：80ml1×TBEBuffer中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀(肉眼观察无颗粒状悬浮物)，冷却至60℃左右时加入2μlEB(原液)混匀，倒入制胶器中(15×15cm)，室温静置30min左右即可使用。电泳条件：100V，25～30min。(4)细胞侵袭能力分析原理是根据肿瘤细胞侵袭时具有运动性和方向性的特点。肿瘤细胞接触基质面后会通过一系列机制向某一个方向运动。a.对于MDA-MB-231和CAL-51细胞，分别稀释Matrigel至500μg/mL，将100μL加在8μm孔聚碳酯膜的transwell小室上室，37℃5％CO2培养箱中孵育1h，吸去水相备用，b.取转染后48小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬，c.分别将200μL含有5×104或者10×104个细胞的MDA-MB-231或者CAL-51细胞悬液种植于每个transwell小室上室，向下室中加入800μL含10％血清的培养液，于37℃5％CO2培养箱中培养8小时，d.取出小室，刮去上层未发生迁移的细胞，e.以70％的甲醇固定膜上的细胞，15分钟，f.以0.5％结晶紫(甲醇配制)染色20分钟，蒸馏水清洗，g.显微镜下计数小室下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。(5)肿瘤细胞迁移分析原理是根据肿瘤细胞迁移时具有运动性和方向性的特点。肿瘤细胞会通过一系列机制向某一个方向运动。a.取转染后48小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬，b.分别将200μL含有5×104或者10×104个细胞的MDA-MB-231或者CAL-51细胞悬液种植于每个transwell小室上室，向下室中加入800μL含10％血清的培养液，于37℃5％CO2培养箱中培养12小时，c.取出小室，刮去上层未发生迁移的细胞，d.以70％的甲醇固定膜上的细胞，15分钟，e.以0.5％结晶紫(甲醇配制)染色20分钟，蒸馏水清洗，f.显微镜下计数小室下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。(6)细胞增殖能力分析实时无标记动态细胞分析技术(RTCA，RealTimeCellularAnalysis)原理是将微电极阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底 部，当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时功能状态改变呈相关性，通过实时动态的电极阻抗检测可以获得细胞生理功能相关的生物学信息，包括细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁等。a.转染后24小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬b.以每孔1000个细胞接种于xCELLigenceRTCAMPE-plate96孔板，以4h为细胞贴壁时间，对得到的生长曲线用RTCASoftware1.2.1进行细胞指数标准化分析细胞的增殖情况。(7)统计学分析实验数据采用SPSS10.0软件包(SPSS,Chicago,IL)进行双侧Student’st检验，p<0.05为差异具有显著性。实施例3：MicroRNA-4306体内抑制三阴性乳腺癌细胞生长和肺转移(1)裸鼠成瘤实验原理是雌性裸鼠脂肪垫种植人类三阴性乳腺癌细胞，观察不同细胞的成瘤能力。在吉凯公司构建病毒载体的microRNA-4306，感染细胞CAL-51，获得稳转细胞系CAL-51-microRNA-4306和CAL-51-对照；雌性裸鼠脂肪垫双侧分别注射稳转细胞系CAL-51-microRNA-4306和CAL-51-对照细胞200万，每隔三天观察测量肿瘤生长情况。(2)裸鼠尾静脉实验原理是裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞，肿瘤细胞进入血液循环，根据裸鼠发生肺转移的情况，判断肿瘤细胞的转移能力。在吉凯公司构建病毒载体的microRNA-4306，感染细胞CAL-51，获得稳转细胞系CAL-51-microRNA-4306和CAL-51-对照；雌性裸鼠尾静脉分别注射稳转细胞系CAL-51-microRNA-4306和CAL-51-对照细胞100万，两个月后处死裸鼠，观察裸鼠肺部是否有转移灶。实施例4：MicroRNA-4306促进顺铂诱导的三阴性乳腺癌细胞凋亡(1)细胞凋亡分析原理是在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的 内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此，将AnnexinV与PI联合使用时，PI则被排除在活细胞(AnnexinV-/PI-)和早期凋亡细胞(AnnexinV+/PI-)之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性(AnnexinV+/PI+)，通过流式细胞仪检测，可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。a.转染后24小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬后，接种于六孔板，细胞贴壁后用铂类药物(顺铂)处理24h。b.24h后，贴壁细胞需用0.25％的胰酶消化。细胞收集。悬浮细胞收集：离心5分钟；细胞洗涤：用预冷1×PBS(4℃)重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；c.加入300μL的1×BindingBuffer悬浮细胞；d.AnnexinV-FITC标记：加入5μL的AnnexinV-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；e.PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。f.上机前，补加200μL的1×BindingBuffer。g.流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(2)细胞凋亡相关蛋白变化分析原理是细胞凋亡时，细胞凋亡核心成员胱天蛋白酶(caspase)家族的Caspase3，Caspase8，Caspase9以及caspase的切割底物PARP会被激活，将细胞内的蛋白降解，使细胞走向不可逆的死亡。a.转染后24小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬后，接种于六孔板，细胞贴壁后用铂类药物(顺铂)处理24h。b.24h后，收集细胞，离心，3000rpm,5min。裂解细胞：在收集的细胞中加入裂解液(1％NP40+蛋白酶体抑制剂)，提取细胞总蛋白。c.蛋白质印迹检测Caspase3，Caspase8，Caspase9以及的切割底物PARP。配置浓度为10％聚丙烯酰胺凝胶，将细胞的总蛋白以40μg每孔上样，120V，电泳。电泳结束后，湿法转膜，将蛋白转到PVDF膜上。5％脱脂牛奶封闭后，孵育一抗。一抗过夜后，孵育二抗。使用ImageReaderLAS-4000曝光。(3)裸鼠治疗实验原理是裸鼠体内成瘤后，瘤内注射microRNA-4306，同时腹腔注射顺铂，可以模拟体内环境，检测microRNA-4306联合铂类药物(顺铂)治疗三阴性乳腺癌的效果。Balb/c裸鼠，雌性，五周龄，皮下脂肪垫注射三阴性乳腺癌细胞CAL-51,200万。21天后，成瘤约5mm×5mm×5mm，开始瘤内注射microRNA-4306，同时腹腔注射铂类药物(顺铂)。瘤内注射microRNA-4306，同时腹腔注射铂类药物(顺铂)每三天给药一次，每周测量肿瘤大小。六周后，处死裸鼠，取肿瘤组织，提取肿瘤组织蛋白，进行蛋白免疫印迹检测凋亡相关蛋白Caspase3，Caspase8，Caspase9以及PARP，观察肿瘤组织中，细胞凋亡情况。结果(1)用化学合成成熟miRNA转染三阴性乳腺癌细胞系高表达目的miRNA采用lipofectamine2000，单独转染时以终浓度为50nM的microRNA-4306或miR-NC对MDA-MB-231或者CAL-51细胞进行瞬时转染；转染后48小时收集细胞。通过实时PCR检测microRNA-4306表达水平。转染之后microRNA-4306的表达在MDA-MB-231细胞系中分别相对对照提高了152.5倍、146.01倍，在CAL-51细胞系中分别提高了6222.7倍、7033.3倍。结果表明转染之后microRNA-4306在MDA-MB-231和CAL-51细胞系中表达水平显著提高，表明转染程序及体系适合进行miRNA高表达的相应研究。(2)microRNA-4306高表达对MDA-MB-231和CAL-51细胞系的体外侵袭能力的影响采用Transwell侵袭实验进行肿瘤细胞体外侵袭能力的研究。转染后24小时，将MDA-MB-231或者CAL-51细胞消化，用无血清的 DMEM重悬，分别以1×104和5×104的数量种植于Transwell小室上室，将800μl含有10％血清的DMEM加入小室下室，37℃培养12小时，细胞进入8μm孔聚碳酯膜的下层。0.5％结晶紫染色，在显微镜下可见膜上被染成紫色的细胞(图6A,图6B)，计数聚碳酯膜下表面的细胞数，经过计算microRNA-4306转染后的MDA-MB-231细胞穿过膜的细胞数分别为对照的50.0％±2.5％，CAL-51细胞穿过膜的细胞数分别为对照的56.2％±0.1％.结果表明，与对照细胞相比，microRNA-4306高表达的MDA-MB-231和CAL-51细胞体外侵袭能力明显减弱(图6A，6B)，经统计学分析，差异具有显著性。(3)microRNA-4306高表达对MDA-MB-231和CAL-51细胞系迁移能力的影响采用Transwell侵袭实验进行肿瘤细胞体外侵袭能力的研究。转染后24小时，将MDA-MB-231或者CAL-51细胞消化，用无血清的DMEM重悬，分别以1×104和5×104的数量种植于Transwell小室上室，将800μl含有10％血清的DMEM加入小室下室，37℃培养8小时，细胞进入8μm孔聚碳酯膜的下层。0.5％结晶紫染色，在显微镜下可见膜上被染成紫色的细胞(图6C,图6D)，计数聚碳酯膜下表面的细胞数，经过计算microRNA-4306转染后的MDA-MB-231细胞穿过膜的细胞数分别为对照的46.2±0.1％，CAL-51细胞穿过膜的细胞数分别为对照的55.6％±0.2％。结果表明，与对照细胞相比，microRNA-4306高表达的MDA-MB-231和CAL-51细胞体外迁移能力明显减弱(图6C，6D)，经统计学分析，差异具有显著性。(4)microRNA-4306高表达对MDA-MB-231和CAL-51细胞系增殖能力的影响采用xCELLigenceRTCAMP系统进行肿瘤细胞增殖能力的研究。转染后24小时，将MDA-MB-231或者CAL-51细胞消化，用10％血清的DMEM重悬，以每孔1000个细胞接种于xCELLigenceRTCAMPE-plate96孔板，以4h为细胞贴壁时间，对得到的生长曲线用RTCASoftware1.2.1进行细胞指数标准化分析细胞的增殖情况。结果表明，与对照细胞相比，microRNA-4306高表达的MDA-MB-231和CAL-51细胞体外增殖能力明显减弱(图7)，经统计学分析，差异具有显著 性。(5)MicroRNA-4306体内抑制三阴性乳腺癌细胞生长和肺转移采用裸鼠脂肪垫成瘤的方法，观察microRNA-4306在体内对三阴性乳腺癌细胞生长的影响。构建病毒载体的microRNA-4306，感染细胞CAL-51后，将CAL-51-microRNA-4306和CAL-51-对照细胞各200万，分别注射在雌性裸鼠脂肪垫。结果表明，microRNA-4306抑制三阴性乳腺癌细胞在体内的生长。采用裸鼠尾静脉注射的方法，观察microRNA-4306在体内对三阴性乳腺癌细胞转移的影响。构建病毒载体的microRNA-4306，感染细胞CAL-51后，将CAL-51-microRNA-4306和CAL-51-对照细胞各100万，分别注射在雌性裸鼠的尾静脉。结果表明，microRNA-4306抑制三阴性乳腺癌在体内的转移。(6)microRNA-4306对铂类药物(顺铂)诱导的MDA-MB-231和CAL-51细胞凋亡的影响采用AnexinV/PI试剂盒，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。转染24h，将将MDA-MB-231或者CAL-51细胞消化，以一定浓度接种于六孔板中，待细胞贴壁后，用顺铂处理细胞24h，收集细胞，进行AnexinV/PI染色，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。结果表明，与对照细胞相比，microRNA-4306促进铂类药物(顺铂)诱导的MDA-MB-231和CAL-51细胞凋亡。采用蛋白质免疫印迹，检测细胞凋亡相关蛋白的变化。转染24h，将将MDA-MB-231或者CAL-51细胞消化，以一定浓度接种于六孔板中，待细胞贴壁后，用顺铂处理细胞24h，收集细胞，进行蛋白质免疫印迹。结果表明，与对照细胞相比，microRNA-4306促进顺铂诱导的MDA-MB-231和CAL-51细胞凋亡，细胞凋亡相关蛋白表达升高。采用裸鼠治疗的实验，检测microRNA-4306在体内对三阴性乳腺癌的治疗作用。将CAL-51细胞接种于雌性裸鼠的脂肪垫，待成瘤后，瘤内注射microRNA-4306，腹腔注射铂类药物(顺铂)。结果表明，与对照组相比，microRNA-4306联合铂类药物(顺铂)治疗组的肿瘤更小，有更好的治疗效果，而且肿瘤组织中的凋亡相关蛋白表达更高，microRNA-4306在体内促进铂类药物(顺铂)诱导的细胞凋亡。当前第1页1 2 3