本发明涉及医药领域，特别是一种对FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统的制备方法及其应用。
背景技术：
近年来恶性肿瘤的发病率呈现上升趋势，恶性肿瘤是目前全世界的主要死亡原因之一，已经成为严重危害人类生命健康的一大类疾病，因此各种新型的抗肿瘤药物和纳米给药系统应运而生。然而，很多抗癌药物和给药系统的治疗效率总是达不到预期效果，这主要是由于肿瘤微环境的生物屏障作用，使得抗癌药物不能够高效率的到达肿瘤部位发挥作用。其中，屏障作用最为明显的就是包围在肿瘤细胞外周的癌相关成纤维细胞。
癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAF)在形态上是一种细胞核不规则的大梭形细胞，与正常成纤维细胞相比处于持续活化状态，增殖旺盛，常分泌一些生长因子促进肿瘤的生长和迁移，还特异性表达一些蛋白，如成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activation proteinα，FAP-α)等，并在肿瘤细胞外周形成一层致密的纤维化明显的保护屏障，因此癌相关成纤维细胞(CAF)有望成为肿瘤微环境中最有价值的作用靶点之一。
多肽链Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln、AC-Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala、Ala-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln和Thr-Gly-Pro-Ala等作为多肽连接臂，是对癌相关成纤维细胞特异性表达的蛋白FAP-α特异性敏感的，在接触到癌相关成纤维细胞表面的FAP-α时能够特异性的迅速断裂，显现出较强的酶敏感活性，有望实现对CAF的靶向作用，为克服CAF这一生物屏障提供了好的条件。
聚酰胺胺(polyamidoamine，PAMAM)作为高度分散剂和稳定剂，用于纳米粒子的合成，在纳米复合物方面有很好的应用价值。PAMAM还具有大量的端基基团，可以进行不同的功能性改性修饰，进而很好的作为药物、基因、疫苗的载体，用于药物缓释、靶向释药、体外诊断、体外基因转移以及基因治疗等。其作为医药载体与无机载体相比毒副作用小、生物相容性好、安全性更高。PAMAM树枝状分子由于其特殊的结构还可用于核磁成像，如PAMAM包藏钆(Gd)可作为一种非常有前景的顺磁共振成像(MRI)造影剂。
阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，如乳腺癌、肺癌、软组织肿瘤、骨肉瘤、膀胱癌等，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。目前已上市的盐酸阿霉素注射剂在临床上使用时由于缺乏靶向性产生许多毒性反应，如心脏毒性、抑制骨髓造血功能以及胃肠道反应等。
到目前为止，临床上应用的给药系统仍具有缺乏靶向性、毒副作用大、功能单一、难以克服肿瘤微环境生物屏障等的缺点。因此发明一种具有靶向性强、毒副作用小、多功能的能够有效克服生物屏障提高抗癌效率的给药系统是亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
针对上述情况，为了克服现有技术的缺陷，本发明之目的就是提供一种对FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统的制备方法及其应用，可有效解决现有抗肿瘤药物用于肿瘤治疗的靶向性差、毒副作用大、功能单一、难以克服生物屏障等问题。
本发明解决的技术方案是，阿霉素(DOX)通过二硫键作为连接臂与聚酰胺胺(PAMAM)相连形成还原敏感型纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)，然后将此纳米粒通过对FAP-α敏感的多肽连接臂相连形成对FAP-α、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统(即纳米制剂DOX-S-S-PAMAM-peptide-DOX-S-S-PAMAM，简称DSP-pep-DSP)，所述的二硫键为3，3’-二硫代二丙酸或2，2’-二硫代二乙酸，多肽连接臂为苏氨酸-丝氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺(Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln)或AC-天冬氨酸-丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸(AC-Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala)或丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺(Ala-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln)或苏氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸(Thr-Gly-Pro-Ala)等，具体步骤是：
(1)合成还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)：
①称取作为连接臂的二硫键3，3’-二硫代二丙酸或2，2’-二硫代二乙酸10mg-2g，分别加入2.0～15.0ml乙酰氯，置于烧瓶中，在65℃油浴下回流2～6h，将反应物进行浓缩后加入3～4倍预冷的乙醚，冷却析晶，真空干燥，得3，3’-二硫代二丙酸酐或2，2’-二硫代二乙酸酐；
②称取0.01～1.0mmolDOX、0.01～1.0mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.01～1.0mmol步骤①中制得的酸酐分别溶解于0.5～15.0ml反应溶剂中，将DOX和DMAP溶液混合，加入20～200μl三乙胺(TEA)，向上述溶液中加入酸酐溶液，在25～45℃下避光反应8～24h，反应停止后加入3～4倍预冷的乙醚，冷却析晶，真空干燥，得羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)；
③称取羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)20～100mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)100～250mg和羟基琥珀酰亚胺(NHS)60～180mg分别溶解于5～25mL反应溶剂中，先将DOX-S-S-COOH和EDC溶液混合，反应0.5～3h，再加入NHS溶液，反应0.5～4h，得活化的羧基化阿霉素(DOX-S-S-COO-NHS)，取聚酰胺胺(PAMAM)10～150mg溶解于3～12mL反应溶剂中，加10～200μlTEA，再将DOX-S-S-COO-NHS和PAMAM溶液混合，在20～45℃下氮气保护反应6～26h，反应结束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每3～6小时换一次水，冷冻干燥，得还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)；
所述的反应溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的一种或两种的混合物，或甲酰胺等类似溶剂以及类似溶剂的混合物；
(2)合成对FAP-α、还原环境双敏感的纳米粒(DSP-pep-DSP)：
称取作为连接臂的多肽链2～100mg、EDC 20～200mg和NHS 15～180mg分别溶解于2～20mL反应溶剂中，然后将多肽连接臂和EDC溶液混合，反应0.5～2.5h，再加入NHS溶液，反应0.5～3.5h，得活化的多肽连接臂，取负载了阿霉素的还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)10～200mg溶解于5～25mL反应溶剂中，再将活化的多肽连接臂和上述纳米粒溶液混合，在20～40℃下氮气保护8～25h，反应结束后用截留分子量3500～8000的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每3～6h换一次水，冷冻干燥，得FAP-α、还原环境双敏感的纳米粒(DSP-pep-DSP)；即对FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统；
所述的多肽连接臂为Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln或AC-Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala或Ala-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln或Thr-Gly-Pro-Ala，反应溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的一种或两种的混合物，或甲酰胺等类似溶剂以及类似溶剂的混合物。
本发明制备的对FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统可有效克服肿瘤微环境的生物屏障，进而对肿瘤细胞发挥疗效，实现在制备新型抗肿瘤药物中的应用。
本发明合成工艺简单方便，具有良好的生物相容性、高靶向性、还原敏感型、酶敏感性、低毒性和能够有效克服肿瘤微环境生物屏障等优点，是治疗肿瘤中药物制剂上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
(1)合成还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)：
①称取作为连接臂的2，2’-二硫代二乙酸109mg和乙酰氯3ml置于烧瓶中，在65℃油浴下回流2h，将反应物进行浓缩后加入3倍预冷的乙醚，冷却析晶，真空干燥，得2，2’-二硫代二乙酸酐；
②称取0.3mmolDOX、0.3mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.3mmol2，2’-二硫代二乙酸酐分别溶解于5mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；将DOX和DMAP溶液混合，加入20μl三乙胺(TEA)，向上述溶液中加入2，2’-二硫代二乙酸酐溶液，在35℃下避光反应8h，反应停止后加入3倍预冷的乙醚，冷却析晶，真空干燥，得羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)；
③称取羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)20mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)100mg和羟基琥珀酰亚胺(NHS)80mg分别溶解于6mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后将DOX-S-S-COOH溶液和EDC溶液反应0.5h，再加入NHS溶液反应1h，得活化的羧基化阿霉素(DOX-S-S-COO-NHS)，取聚酰胺胺(PAMAM)30mg溶解于3mL DMSO中，加20μlTEA，再将DOX-S-S-COO-NHS和PAMAM溶液混合，在25℃下避光反应8h，反应结束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每4小时换一次水，冷冻干燥，得还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)；
(2)合成对FAP-α、还原环境双敏感的纳米粒(DSP-pep-DSP)：
称取作为连接臂的多肽链Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln5mg、EDC 30mg和NHS 25mg分别溶解于4mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将多肽连接臂溶液和EDC溶液反应0.5h，再加入NHS溶液反应1h，得活化的多肽连接臂，取还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)30mg溶解于7mL DMF中，再将活化的多肽连接臂和上述纳米粒溶液混合，在20℃下避光反应12h，反应结束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每4小时换一次水，冷冻干燥，得FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统(DSP-pep-DSP)。
实施例2
本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：
(1)合成还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)：
①称取作为连接臂的3，3’-二硫代二丙酸252mg和乙酰氯6.0ml置于烧瓶中，在65℃油浴下回流4h，将反应物进行浓缩后加入3.5倍预冷的乙醚，冷却析晶，真空干燥，得3，3’-二硫代二丙酸酐；
②称取0.6mmolDOX、0.6mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.6mmol3，3’-二硫代二丙酸酐分别溶解于9mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；然后将DOX溶液和DMAP溶液混合，再加入60μl三乙胺(TEA)溶液，最后加入3，3’-二硫代二丙酸酐溶液，在40℃下避光反应12h，反应停止后加入3.5倍预冷的乙醚，冷却析晶，真空干燥，得羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)；
③称取羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)40mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)180mg和羟基琥珀酰亚胺(NHS)120mg分别溶解于12mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将DOX-S-S-COOH溶液和EDC溶液反应1h，再加入NHS溶液反应2h，得活化的羧基化阿霉素(DOX-S-S-COO-NHS)；取聚酰胺胺(PAMAM)60mg溶解于6mL DMF中，加60μlTEA，再将DOX-S-S-COO-NHS和PAMAM溶液混合，在30℃下氮气保护反应12h，反应结束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每5小时换一次水，冷冻干燥，得还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)；
(2)合成对FAP-α、还原环境双敏感的纳米粒(DSP-pep-DSP)：
称取作为连接臂的多肽链AC-Asp-Ala-Thr-Gly-Pro-Ala20mg、EDC 100mg和NHS 80mg分别溶解于6mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后将多肽连接臂溶液和EDC溶液反应1h，再加入NHS溶液反应2h，得活化的多肽连接臂；取还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)100mg溶解于15mL DMSO中，再将活化的多肽连接臂和上述纳米粒溶液混合，在25℃下反应24h，反应结束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每5小时换一次水，冷冻干燥，得FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统(DSP-pep-DSP)。
实施例3
本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：
(1)合成还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)：
①称取作为连接臂的3，3’-二硫代二丙酸420mg和乙酰氯9ml置于烧瓶中，在65℃油浴下回流5h，将反应物进行浓缩后加入4倍预冷的乙醚，冷却析晶，真空干燥，得3，3’-二硫代二丙酸酐；
②称取0.9mmolDOX、0.9mmol4-二甲氨基吡啶(DMAP)和0.9mmol3，3’-二硫代二丙酸酐分别溶解于14ml二甲基亚砜(DMSO)中；将DOX溶液和DMAP溶液混合，加入80μl三乙胺(TEA)，向上述溶液中加入3，3’-二硫代二丙酸酐溶液，在45℃下避光反应24h，反应停止后加入4倍预冷的乙醚，冷却析晶，真空干燥，得羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)；
③称取羧基化的阿霉素(DOX-S-S-COOH)70mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)250mg和羟基琥珀酰亚胺(NHS)180mg分别溶解于18mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后将DOX-S-S-COOH溶液和EDC溶液反应2h，再加入NHS溶液反应1.5h，得活化的羧基化阿霉素(DOX-S-S-COO-NHS)，取聚酰胺胺(PAMAM)80mg溶解于9mL DMSO中，加80μlTEA，再将DOX-S-S-COO-NHS和PAMAM溶液混合，在35℃下避光反应24h，反应结束后用截留分子量3500的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每6小时换一次水，冷冻干燥，得还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)；
(2)合成对FAP-α、还原环境双敏感的纳米粒(DSP-pep-DSP)：
称取作为连接臂的多肽链Thr-Gly-Pro-Ala30mg、EDC 180mg和NHS 150mg分别溶解于9mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将多肽连接臂溶液和EDC溶液反应1.5h，再加入NHS溶液反应3h，得活化的多肽连接臂，取还原敏感型的纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)160mg溶解于20mL DMF中，再将活化的多肽连接臂和上述纳米粒溶液混合，在30℃下避光反应24h，反应结束后用截留分子量7000的透析袋透析2天，透析液为超纯水，每6小时换一次水，冷冻干燥，得FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统(DSP-pep-DSP)。
由上述可知，本发明选用3，3’-二硫代二丙酸(或2，2’-二硫代二乙酸等类似物)为连接臂，连接含有氨基的阿霉素(DOX)和聚酰胺胺(PAMAM)，形成还原敏感型纳米粒(DOX-S-S-PAMAM)，粒径在25～40nm之间。再用对癌相关成纤维细胞(CAF)表面的FAP-α敏感的多肽连接臂将这些小粒径的还原敏感型纳米粒交联起来，形成了粒径在100～200nm之间的纳米粒(DSP-pep-DSP)。多肽连接臂具有对CAF表面的FAP-α敏感的酶敏感性，在遇到肿瘤细胞外周的CAF时能够特异性断裂，使大粒径的纳米粒DSP-pep-DSP裂解为很多负载药物的小粒径的还原敏感型纳米粒DOX-S-S-PAMAM，进而能够破坏或穿过生物屏障，进入肿瘤细胞内部发挥作用，有效的克服了生物屏障、提高了抗癌效率；DOX-S-S-PAMAM进入肿瘤内部后，二硫键为还原响应型化学键，通过肿瘤细胞中高表达的谷胱甘肽的作用，迅速断裂，使得抗肿瘤药物阿霉素高效释放。本发明是一种兼具还原敏感型、酶敏感性、癌相关成纤维细胞靶向优点的能够有效克服肿瘤微环境生物屏障，提高抗癌效率的新型药物体系。并经试验取得了非常满意的有益技术效果，有关试验资料如下：
1、对FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统(对FAP-α酶、还原环境双敏感的粒径收缩型的肿瘤渗透性纳米系统又称为DSP-pep-DSP纳米制剂)中DOX的含量测定：
采用紫外分析法测定DOX的含量，以公式(1)计算样品的载药量，载药量达到32.5％以上。
(1)
2、DSP-pep-DSP纳米制剂的粒径和电位表征：
取适量制剂用水稀释至适宜浓度后，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为156.2nm和-21.3±0.30mv。
3、DSP-pep-DSP纳米制剂对细胞的增殖抑制试验：
细胞培养方法：试验采用2种细胞共培养的方法，是将癌相关成纤维细胞(CAF)和MCF-7细胞在细胞培养瓶中共同培养(以下简称CAF-MCF7)并用做以下细胞实验。
按照细胞传代的步骤将CAF-MCF7细胞处理到单细胞悬液，计数后每孔接种5×103个细胞于96孔板上，培养箱培养(37℃，5％CO2)24h，待细胞贴壁完全后弃去原培养基后加药，DSP-pep-DSP组，DOX-S-S-PAMAM组，以及DOX组，所加药物浓度以阿霉素(DOX)浓度呈一系列梯度用不含血清的培养基配制而成，DOX的浓度梯度依次为0,0.039,0.078,0.156,0.313,0.625,1.25,2.5,5,10μg/ml，并于加药后继续培养48h后取出培养板，每孔加入50μl预冷的50％三氯乙酸，终浓度为10％，静置5min；移至4℃冰箱中静置1h，取出，用超纯水洗5遍，室温空气中干燥完全后，每孔中加入1％乙酸配制的SRB50μl，室温下染色20min，倒掉染液，用1％乙酸洗5遍，除去孔中未结合的染料，室温空气干燥后用pH10.5的10mmol/lTris碱液150μl溶解，在空气加热摇床中震荡10min，于酶联免疫检测仪上测定各孔在515nm处的光吸收度值。计算抑制率(％)＝(1-实验组A/对照组A)×100％，由此得出上述样品的半数抑制浓度(IC50)依次为：0.5158,1.0016,1.5108μg/ml。
4、DSP-pep-DSP纳米制剂对细胞流式摄取试验：
细胞培养方法：试验采用2种细胞共培养的方法，是将癌相关成纤维细胞(CAF)和MCF-7细胞在细胞培养瓶中共同培养(以下简称CAF-MCF7)并用做以下细胞实验。
将实验分为DSP-pep-DSP组，DOX-S-S-PAMAM组，DOX组，另设有空白细胞组。取对数生长期的CAF-MCF7细胞按照细胞传代的步骤处理成单细胞悬液，计数之后铺上六孔板，每孔细胞数为3×105个/孔，培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h，贴壁完全后，弃去培养基，加入用不含血清的培养基配制的药物，分别设置0.5h，1h，2h，4h，6h的时间段进行后期处理，药液吸入对应EP管中，用PBS洗2遍，然后用0.5ml的不含EDTA的胰酶消化处理1min，加入培养基1ml，吸入对应的EP管，1000rpm/10min离心后，弃去上清，在沉淀中加入2mlPBS吹打均匀，1000rpm/10min离心后，弃去上清，在沉淀中，加入0.5mlPBS吹打均匀后转移到1.5mlEP管中置于冰盒，等待流式上机检测，测得时间点6h的流式摄取量依次为：90.1％,73.8％,57.6％。
5、DSP-pep-DSP纳米制剂的药效学试验：
准备10只雌性小鼠进行S-180肉瘤腹水培养，两周后抽取腹水，用于小鼠实体瘤的种植，当肿瘤的体积达到100mm3以上时，肿瘤模型接种成功，将荷瘤小鼠随机分为四组，每组八只，分组情况如下：(1)空白组；(2)DOX组；(3)DOX-S-S-PAMAM组；(4)DSP-pep-DSP组。然后进行隔日给药，给药剂量按人鼠剂量换算为4mg/kg，尾静脉注射给药。每天观察小鼠的生存状况并且称体重量瘤体积(肿瘤体积V＝A×B2/2)，然后通过相对瘤体积R＝V/V0的变化(V0为给药前一天瘤体积的大小)评价药物抗肿瘤活性。记录的数据表明，给药结束时和给药前相比，各组瘤体积抑制率依次为0.03％、46.58％、67.86％、85.38％，具有显著抑制肿瘤体积之效果，可用于制备抗肿瘤药物。
实验表明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益效果：
1、本发明基于肿瘤微环境中生物屏障作用较强的癌相关成纤维细胞CAF，选择了对其表面特异性表达的FAP-α敏感的多肽链作为连接臂，将小粒径的还原性纳米粒DOX-S-S-PAMAM交联起来形成纳米制剂DSP-pep-DSP。纳米制剂在遇到CAF上的FAP-α时能够特异性断裂，使大粒径纳米粒裂解为负载药物的小粒径还原敏感型纳米粒，进而能够破坏或穿过生物屏障，进入肿瘤细胞内部发挥还原敏感作用释放药物，提高了抗癌效率；
2、本发明基于高浓度的生物还原性谷胱甘肽提供了肿瘤组织还原性微环境，选择含有二硫键的连接臂连接抗肿瘤药阿霉素和聚酰胺胺，利用此触发机制可以实现抗肿瘤药物在生物体内快速、靶向释放药物，减少了抗肿瘤药物的毒副作用；
3、聚酰胺胺PAMAM作为自身可成纳米粒的树枝状分子，是一种生物相容性很好的药物载体，与传统无机载体相比大大降低了毒副作用，还具有长循环、肿瘤靶向性好、载药形式多样等优点，十分有利于肿瘤的治疗，有效率可提高到80％以上，是治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。