本发明涉及医药领域，特别是一种基于透明质酸修饰的能够递送一氧化氮的胶束的制备方法与应用。
背景技术：
在中国，癌症已成为疾病死因之首。有关数据显示，仅2015年，我国共有429.2万新发肿瘤病例和281.4万癌症死亡病例，其高发病率和高死亡率，严重威胁着人类的健康，因此对癌症的预防、诊断和治疗刻不容缓。
一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体内一种生物调节性介质，参与多种疾病的病理和生理过程，并且与肿瘤的发生和发展密切相关。现有资料显示，低浓度的NO可以通过抑制P-糖蛋白(P-gP)和多药耐药相关蛋白(MRPs)的活性来克服肿瘤细胞的多药耐药性(MDR)；当NO浓度升高至μmol/L级水平时，则不利于肿瘤生长而具有抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制包括：(1)与细胞内的超氧阴离子结合生成氮/氧自由基，损伤DNA，从而产生细胞毒性；(2)通过激活p53等表达而诱导肿瘤细胞发生凋亡；(3)影响细胞的能量代谢，肿瘤细胞因能量代谢障碍而死亡；(4)通过抑制血小板聚集，抑制肿瘤转移；(5)增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。另外，大量研究发现NO也广泛参与了肿瘤的化学治疗和免疫治疗过程，与化疗药物和细胞因子等相互作用，影响药物对肿瘤的杀伤作用。
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是脊椎动物细胞间基质的重要组成成分，它是一种线性生物多聚糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒、无免疫原性等特点。CD44受体是一类跨膜糖蛋白，是细胞表面最重要的HA受体，在大部分肿瘤细胞表面过量表达。HA与肿瘤细胞表面的CD44受体相互作用，促进肿瘤细胞对HA的内吞。
谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases，GSTs)是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一，是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。GSTs主要包括α、μ、π、θ等亚型，其中π亚型(GST-π)分布最广泛、含量最丰富。GST-π的生理功能主要是催化机体内有害极性化合物与谷胱甘肽结合，或由非酶结合方式将机体内各种潜在毒性化学物质及致癌剂及亲脂性化合物等从体内排出，从而达到清除毒性物质、致癌物质、保护DNA遗传物质稳定性的目的。研究表明GST-π不仅存在于正常组织中，在很多人恶性肿瘤中如大肠癌、乳腺癌、肝癌、头颈部肿瘤、卵巢癌等也会过表达，并且明显高于相应正常组织。
传统抗肿瘤药物最大的治疗缺陷是药物作用多是非选择性的，在杀伤癌细胞的同时，对正常组织也有较强的杀伤作用。而且，目前现有的给药系统具有靶向性差、体内循环时间短、毒副作用大等缺点，因此，发明一种能够主动靶向到癌细胞、体内长循环、毒副作用小的给药系统势在必行。
技术实现要素：
针对以上问题，为克服现有技术之缺陷，本发明提供一种HA修饰的能够递送NO的胶束的制备方法，该胶束对肿瘤细胞中大量存在的GST-π较敏感，在GST-π存在的条件下，胶束会释放大量的NO，用于杀伤肿瘤细胞。该系统不仅能在体内实现长循环、具有肿瘤靶向性，释放出的NO能与胶束中载入的抗癌药物协同产生抗肿瘤作用。
本发明解决的技术方案是，通过1,5-二氟-2,4-二硝基苯(FFDNB)上的两个氟原子分别被HA和2-(N,N-二乙基氨基)-二氮烯-2-氧钠盐(DEA/NO)亲核取代，形成基于透明质酸修饰的能够递送一氧化氮的聚合物(HA-DNB-DEA/NO)，该聚合物在水中自发形成胶束，所述的HA的分子量为1～100kDa(即1000～100000道尔顿)，具体制备方法如下：
(1)HA-FDNB的制备
取HA 10mg～1g、FFDNB 50mg～1g置于研钵中，再加10mg～1g的碱性试剂，研磨1～20min；然后转入50mL烧瓶中，78℃油浴加热搅拌12h，反应完成后，用二氯甲烷洗去游离的FFDNB，离心，沉淀自然干燥，即得HA单氟取代产物(HA-FDNB)；
所述的碱性试剂为无水碳酸钠或碳酸氢钠、或其它类似碱性试剂以及其它类似碱性试剂的混合物；
(2)HA-DNB-DEA/NO胶束的制备
①取HA-FDNB 10mg～1g置三口烧瓶中，用500ul～10mL的反应溶剂溶解，再加500ul～10mL的叔丁醇，氮气保护下冷却到0℃；
②取2-(N,N-二乙基氨基)-二氮烯-2-氧钠盐水合物(DEA/NO)10～500mg溶于500ul～10mL的甲醇中；
③将步骤①、②溶液混合，23-27℃下搅拌48h，反应结束后用3～5倍预冷丙酮沉，2000rpm离心，沉淀再用丙酮洗两遍；水复溶，置透析袋中透析8h，透析液为超纯水，冻干，即得HA-DNB-DEA/NO胶束，备用；
所述的反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、或二甲基亚砜、或其它类似溶剂以及其它类似溶剂的混合物。
所述的抗肿瘤药物组合物，是将基于透明质酸修饰的能够递送一氧化氮的胶束和抗肿瘤药物制成载药纳米胶束，所述的抗肿瘤药物为紫杉醇、阿霉素、长春新碱、羟基喜树碱。
本发明基于透明质酸修饰的能够递送一氧化氮的胶束和抗肿瘤药物制备成载药纳米胶束的方法操作步骤如下：
胶束中负载抗肿瘤药物的制备：取冻干后的HA-DNB-DEA/NO与水按1～20:1000溶于水中，形成胶束溶液；抗肿瘤药物溶解在适当溶剂中后滴加到胶束溶液中，23-27℃搅拌30min，冰浴下探头超声30min，透析除去游离药物，透析液离心，0.45μm滤膜过滤，冻干，即得载药纳米胶束；所述的适当溶剂是指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。
胶束中负载抗肿瘤药物含量的测定：
胶束的载药量以公式(1)计算：
本发明制备的负载抗肿瘤药物的HA修饰的能够递送NO的纳米胶束对肿瘤具有很强的杀伤作用，通过载入到胶束内核中的抗肿瘤药物可达到对肿瘤的靶向治疗，该给药系统具有高靶向性、良好的生物相容性、酶敏感性、低毒性等优点，是肿瘤治疗用药制剂上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：
(1)HA-FDNB的制备
取HA 100mg、FFDNB 150.27mg置于研钵中，再加104.1mg的无水碳酸钠，研磨5min；然后转入50mL烧瓶中，78℃油浴加热搅拌12h；反应完成后，用30mL的二氯甲烷洗去游离的FFDNB，离心，沉淀自然干燥，即得HA-FDNB；
(2)HA-DNB-DEA/NO胶束的制备
①取HA-FDNB 17.6mg置25mL的三口烧瓶中，加700ul N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加700ul的叔丁醇，氮气保护下冷却到0℃；
②取DEA/NO 10mg溶于500ul的甲醇中，然后滴加到①中；
③逐渐升至23-27℃，23-27℃下搅拌48h，反应结束后用3倍预冷丙酮沉提，2000rpm离心，沉淀再用丙酮洗两遍；水复溶，置透析袋中透析8h，透析液为超纯水，冻干，得HA-DNB-DEA/NO胶束，备用；
(3)胶束中负载阿霉素的制备
①称取12mg的HA-DNB-DEA/NO胶束溶于3mL水中，形成胶束溶液；
②称取6mg盐酸阿霉素脱盐后溶于700ul N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将阿霉素溶液滴加到胶束中；
③23-27℃搅拌30min，冰浴下探头超声30min，透析除去游离的阿霉素，3500rpm离心，0.45μm滤膜过滤，冻干即得载阿霉素的纳米胶束。
(4)胶束中载入阿霉素含量的测定
采用紫外分光光度法，于481nm处测定阿霉素的含量，按上述公式(1)计算胶束的载药量，载药量达28.4％。
实施例2
(1)HA-FDNB的制备
取HA 100mg、FFDNB 150.27mg置于研钵中，再加123.68mg的碳酸氢钠，研磨5min；然后转入50mL烧瓶中，78℃油浴加热搅拌12h；反应完成后，用30mL的二氯甲烷洗去游离的FFDNB，离心，沉淀自然干燥，即得HA-FDNB；
(2)HA-DNB-DEA/NO胶束的制备
①取HA-FDNB 35.2mg置25mL的三口烧瓶中，加1.4mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加1.4mL的叔丁醇，氮气保护下冷却到0℃；
②取DEA/NO 20mg溶于1mL的甲醇中，然后滴加到①中；
③逐渐升至23-27℃，23-27℃下搅拌48h，反应结束后用4倍预冷丙酮沉提，2000rpm离心，沉淀再用丙酮洗两遍；水复溶，置透析袋中透析8h，透析液为超纯水，冻干备用；
(3)胶束中负载紫杉醇的制备
①称取18mg的HA-DNB-DEA/NO溶于3mL水中，形成胶束溶液；
②称取10mg的紫杉醇溶于330ul乙醇中，形成紫杉醇乙醇溶液；
③两者混合，23-27℃搅拌30min，冰浴下探头超声30min，透析除去游离的紫杉醇，3500rpm离心，0.45μm滤膜过滤，冻干即得载紫杉醇的纳米胶束。
(4)胶束中载入紫杉醇含量的测定
采用高效液相色谱法(HPLC)测定紫杉醇的含量，按上述公式(1)计算胶束的载药量，载药量达到31.4％，
实施例3
(1)HA-FDNB的制备
取HA 60mg、FFDNB 90.16mg置于研钵中，再加62.46mg的无水碳酸钠，研磨5min；然后转入50mL烧瓶中，78℃油浴加热搅拌12h；反应完成后，用30mL的二氯甲烷洗去游离的FFDNB，离心，沉淀自然干燥，即得HA-FDNB；
(2)HA-DNB-DEA/NO胶束的制备
①取HA-FDNB 44mg置25mL的三口烧瓶中，加1.5mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加1.5mL的叔丁醇，氮气保护下冷却到0℃；
②取DEA/NO 25mg溶于1mL的甲醇中，然后滴加到①中；
③逐渐升至23-27℃，23-27℃下搅拌48h，反应结束后用5倍预冷丙酮沉提，2000rpm离心，沉淀再用丙酮洗两遍；水复溶，置透析袋中透析8h，透析液为超纯水，冻干备用；
(3)胶束中负载长春新碱的制备
①称取10mg的HA-DNB-DEA/NO溶于2mL水中，形成胶束溶液；
②称取长春新碱5mg溶于200ul乙醇中，然后与胶束溶液混合；
③23-27℃搅拌30min，冰浴下探头超声30min，透析除去游离的长春新碱，3500rpm离心，0.45μm滤膜过滤，冻干即得载长春新碱的纳米胶束。
(4)胶束中载入长春新碱含量的测定
采用HPLC法测定长春新碱的含量，按上述公式(1)计算胶束的载药量，载药量达26.7％
实施例4
(1)HA-FDNB的制备
取HA 50mg、FFDNB 75.29mg置于研钵中，再加61.84mg的碳酸氢钠，研磨5min；然后转入50mL烧瓶中，78℃油浴加热搅拌12h；反应完成后，用30mL的二氯甲烷洗去游离的FFDNB，离心，沉淀自然干燥，即得HA-FDNB；
(2)HA-DNB-DEA/NO胶束的制备
①取HA-FDNB 52.8mg置25mL的三口烧瓶中，加2.1mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加2.1mL的叔丁醇，氮气保护下冷却到0℃；
②取DEA/NO 30mg溶于1.5mL的甲醇中，然后滴加到①中；
③逐渐升至23-27℃，23-27℃下搅拌48h，反应结束后用3倍预冷丙酮沉提，2000rpm离心，沉淀再用丙酮洗两遍；水复溶，置透析袋中透析8h，透析液为超纯水，冻干备用；
(3)胶束中负载羟基喜树碱的制备
①称取12mg的HA-DNB-DEA/NO溶于3mL水中，形成胶束溶液；
②称取6mg的羟基喜树碱溶于50ul二甲基亚砜中，然后与胶束溶液混合；
③23-27℃搅拌30min，冰浴下探头超声30min，透析过夜，3500rpm离心，0.45μm滤膜过滤，冻干即得载羟基喜树碱的纳米胶束。
(4)胶束中载入羟基喜树碱含量的测定
采用紫外分光光度法，于369nm波长处测定羟基喜树碱的含量，按上述公式(1)计算胶束的载药量，载药量达27.9％。
由上述可知，本发明是以FFDNB上的一个氟原子被HA亲核取代，另一个氟原子再被DEA/NO亲核取代，形成HA-DNB-DEA/NO聚合物，在水中该聚合物自发形成胶束，粒径在100～200nm。其中，HA作为胶束的亲水端，不仅能使胶束在体内实现长循环，而且能与肿瘤细胞表面高表达的CD44受体结合，实现肿瘤主动靶向；DNB-DEA/NO作为胶束的疏水端，DEA/NO被包裹在胶束的疏水内核中，稳定性增强。在肿瘤细胞中高表达的GST-π作用下，会释放出大量的NO，与胶束中载有的抗癌药物协同产生抗肿瘤作用。本发明是一种兼具肿瘤主动靶向、肿瘤细胞定点释放NO、NO与药物产生协同抗肿瘤作用的新型药物体系。并经试验取得了非常满意的有益技术效果，有关试验资料如下：
1、HA-DNB-DEA/NO胶束的粒径和电位表征：
取适量HA-DNB-DEA/NO聚合物用水稀释至适宜浓度后，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为157.3nm和-39.5±0.30mv。
2、负载阿霉素胶束(DOX/HA-DNB-DEA/NO)对MCF-7细胞的增殖抑制试验：
按照细胞传代的步骤将MCF-7细胞处理到单细胞悬液，计数后每孔接种5×103个细胞于96孔板上，培养箱培养(37℃，5％CO2)24h，待细胞贴壁完全后弃去原培养基后加药，实验分为DOX/HA-DNB-DEA/NO组，HA-DNB-DEA/NO组，以及DOX组；所加药物浓度以DOX浓度呈一系列梯度，用不含血清的培养基配制而成，DOX的浓度梯度依次为0,0.039,0.078,0.156,0.313,0.625,1.25,2.5,5,10μg/ml，继续培养48h后取出培养板，每孔加入50μl预冷的50％三氯乙酸，终浓度为10％，静置5min；移至4℃冰箱中静置1h，取出，用超纯水洗5遍，23-27℃空气中干燥完全后，每孔中加入1％乙酸配制的SRB50μl，23-27℃下染色20min，倒掉染液，用1％乙酸洗5遍，除去孔中未结合的染料，23-27℃空气干燥后用pH10.5的10mmol/lTris碱液150μl溶解，在空气加热摇床中震荡10min，于酶联免疫检测仪上测定各孔在515nm处的光吸收度值。计算抑制率(％)＝(1-实验组A/对照组A)×100％，由此得出上述样品的半数抑制浓度(IC50)依次为：DOX/HA-DNB-DEA/NO组，HA-DNB-DEA/NO组，DOX组分别为0.5376，2.3428，1.538μg/ml。
4、MCF-7细胞对DOX/HA-DNB-DEA/NO，HA-DNB-DEA/NO纳米胶束的摄取实验
将实验分为DOX/HA-DNB-DEA/NO组，HA-DNB-DEA/NO组，DOX组，另设有空白细胞组。取对数生长期的MCF-7细胞按照细胞传代的步骤处理成单细胞悬液，计数之后铺上六孔板，每孔细胞数为3×105个/孔，培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h，贴壁完全后，弃去培养基，加入用不含血清的培养基配制的药物，分别设置0.5h，1h，2h，4h，6h的时间段进行后期处理，药液吸入对应EP管中，用PBS洗2遍，然后用0.5ml的不含EDTA的胰酶消化处理1min，加入培养基1ml，吸入对应的EP管，1000rpm/10min离心后，弃去上清，在沉淀中加入2mlPBS吹打均匀，1000rpm/10min离心后，弃去上清，在沉淀中，加入0.5mlPBS吹打均匀后转移到1.5mlEP管中置于冰盒，用流式细胞仪测定，测得时间点6h，MCF-7细胞对DOX的摄取量为90.2％，对DOX/HA-DNB-DEA/NO的摄取量为79.6％，对HA-DNB-DEA/NO的摄取量为82.7％。
5、DOX/HA-DNB-DEA/NO纳米胶束的药效学试验：
购买裸鼠35只(雌性，3～4周龄)，接种处于对数生长期的MCF-7细胞，当肿瘤的体积达到100mm3以上时，肿瘤模型接种成功，取24只肿瘤体积和体重相似的荷瘤裸鼠，将其随机分为4组，每组8只，分组情况如下：空白组、DOX组、HA-DNB-DEA/NO组和DOX/HA-DNB-DEA/NO组。然后进行隔日给药，给药剂量按人鼠剂量换算为4mg/kg，尾静脉注射给药。每天观察小鼠的生存状况并且称体重、量瘤体积(通过肿瘤体积(V)＝A×B2/2)，然后通过相对瘤体积R＝V/V0的变化(V0为给药前一天瘤体积的大小)评价药物抗肿瘤活性。记录的数据表明，给药结束时与给药前相比，空白组裸鼠的瘤体积增长70％，DOX组裸鼠的瘤体积增加11％，DOX/HA-DNB-DEA/NO组裸鼠的瘤体积减小了78％，HA-DNB-DEA/NO组裸鼠的瘤体积减小了54％，具有显著抑制肿瘤体积之效果，可用于制备抗肿瘤药物。
实验表明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益效果：
(1)本发明基于肿瘤细胞中过量表达的GST-π，在该酶的作用下，胶束中的DEA/NO快速释放出大量的NO，利用此触发机制可以实现NO在肿瘤细胞内定点、快速释放，与抗癌药物产生协同作用；此外，HA为亲水性物质，不仅可以延长胶束体内循环时间，而且通过识别肿瘤表面的CD44受体还具有主动靶向到肿瘤细胞的作用，以减少在正常组织中的毒副作用。
(2)本发明所形成的纳米胶束具有生物相容性好、肿瘤靶向性高、长循环、毒副作用小、载药形式多样等优点，对肿瘤具有很强的杀伤作用，是治疗肿瘤药物制剂上的一大创新，具有很大的经济和社会效益。