治疗哮喘的中药组合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种治疗哮喘的中药组合物，此外，本发明还涉及该中药组合物的制备方法和医药用途。
背景技术：
：支气管哮喘简称哮喘，是一种常见病、多发病，是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，这种慢性炎症与气道高反应性相关，通常出现广泛而多变的可逆性气流受限，导致反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状，多在夜间和(或)清晨发作、加剧。哮喘对人们的身心健康有很大的危害，控制不佳的哮喘会影响患者的日常工作及日常生活，可导致误工、误学，甚至引起活动、运动受限，使生命质量下降，并带来经济上的负担及对家人的生活负面影响，患者若出现严重急性发作，救治不及时可能致命。目前治疗哮喘的方法主要是服用控制药物和缓解药物。控制药物主要通过抗炎作用使哮喘维持临床控制，缓解药物主要是通过迅速解除支气管痉挛从而缓解哮喘症状。这些药物主要是控制哮喘临床症状，不能根治哮喘，副作用大，且控制哮喘的花费很高。中国专利CN101549015A于2009-10-07公开了一种治疗哮喘病的药物，由炙麻黄、穿山龙、地龙、五味子、甘草组成,其中:原料药炙麻黄5～10G,穿山龙5～15G,地龙5～15G,五味子5～9G,甘草5～15G。本发明提供的治疗哮喘病的药物属于中药制剂,经药效实验和临床实验证明,具有标本兼治、起效快、疗效好、无毒副作用的特点,服用、携带方便。中国专利CN102580020A于2012-07-18公开了一种治疗哮喘的中药组合物，解决现有治疗哮喘的中药药物配伍不合理，疗效差、疗程长等问题，白芥子10-25份、延胡索12-25份、细辛10-15份、甘遂8-12份、蝉蜕6-10份、法半夏8-13份、丹参10-20份、生姜30-50份组成，将上述各药物分别研磨成粉末状后混合，得到药粉，然后将生姜洗净、刮去皮，绞汁过滤制成生姜汁，再将药粉加入生姜汁调制成糊状膏剂。本发明药物对皮肤无刺激、无副作用、穴位用药、温肺化痰、止咳平喘、补气养阴，治疗慢性支气管炎，肺气肿，支气管哮喘等呼吸道疾病，疗效显著，见效快，治愈率高。中国专利CN101985031A于2011-03-16公开了一种治疗哮喘的中药组合物。该中药组合物由以下重量配比的原料按常规方法制成的药剂:柴胡5-15、白芍10-20、天麻15-25、菊花15-25、代赭石25-35、生龙牡各25-35、旋复花10-20、莱菔子15-25、川牛膝25-35、瓜蒌45-55、牛蒡子10-20、三棱15-25、莪术15-25、枳实80-120、佛手25-35、厚朴70-90、干姜6-10、鱼腥草25-35、石膏40-60、麻黄8-12。本发明按照中医学说对哮喘疾病的认识机理对组成成分进行严格挑选，制成的中药疗效好、疗程短,所选药材取材方便，价格便宜，对患者而言具有极高的性价比。原配方中还有部分具有抗过敏、平喘功效的虫类中药，为避免吸入引发哮喘的可能而不用，可能会影响到疗效。现选择的配方以补肺平喘为主要功效，标本兼顾，能够较好地缓解哮喘的发作和减少复发， 但从中医角度看在补肾方面略显不足，所以临床应用时应该在平时嘱患者自行服用补肾中成药。技术实现要素：针对现有技术存在的上述不足，根据本发明的实施例，希望提出一种疗效好、疗程短,所选药材取材方便，价格便宜，对患者而言具有极高性价比的治疗哮喘的中药组合物。本发明还将提出前述治疗哮喘的中药组合物的制备方法以及医药用途。根据实施例，本发明提供的一种治疗哮喘的中药组合物，其创新点在于，其组成和重量份分别为：炙黄芪15-20、姜半夏9-12、黄芩9-12、生甘草9-12、炙麻黄9-12、乌梅9-12。根据一个实施例，本发明前述治疗哮喘的中药组合物为任何一种药学上可接受的剂型。根据一个实施例，本发明前述治疗哮喘的中药组合物为提取液或脂质体雾化吸入剂。根据实施例，本发明提供的一种治疗哮喘的中药组合物提取液的制备方法，包括如下工艺步骤：●按重量份称取原料药；●除黄芩外其他药材加6-10倍量水，浸泡，加热至沸腾，加入黄芩，保持微沸煎煮1-3小时，滤过，收集滤液；药渣加4-8倍量水，加热至沸腾，保持微沸煎煮0.5-2小时，滤过收集滤液；●合并滤液，浓缩；在浓缩液中加入乙醇，使含醇量达70％，冷藏；●将醇沉后所得药液抽滤，滤液回收乙醇，浓缩；浓缩液中加入乙醇，使含醇量达85％，冷藏；将醇沉液抽滤，旋转蒸发回收乙醇，浓缩。根据实施例，本发明提供的一种治疗哮喘的中药组合物脂质体雾化吸入剂的制备方法，包括如下工艺步骤：取处方量的大豆磷脂(sbPC)、胆固醇(CH)、维生素E(VE)置于茄型瓶中，加入体积浓度为5:2的二氯甲烷-甲醇混合溶剂使溶解，在45℃、转速为40r/min的条件下减压旋转蒸发，除去溶剂，制得干膜，用氮气吹膜除去残留溶剂，将前述方法制得的提取液用蒸馏水稀释后倒入茄形瓶中，振摇水化干膜，待水化完全后挤压通过合适孔径的聚碳酸酯膜。随后的实施例和试验例将证明，本发明治疗哮喘的中药组合物(亦称固本平喘方)具有宣肺益气、平喘脱敏、补肾固本的作用，药效学上具有消炎、平喘的功效，临床上主要用于哮喘的慢性持续期和缓解期的治疗。附图说明图1是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(A组：肺动脉壁增厚×200)；图2是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(A组：肺动脉壁轻度增厚，轻度间质性肺炎×200)；图3是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(B组：肺动脉壁增厚，细支气管腔内充满炎性分泌物×200)；图4是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(B组：肺动脉壁增厚，肺间质纤维组织增生，细支气管腔内充满炎性分泌物)；图5是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(C组：肺内细支气管壁及管周见少量炎细胞浸润，腔内少量分泌物×100)；图6是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(C组：小灶性肺组织结构破坏，伴部分肉芽组织增生×200)；图7是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(D组：肺动脉壁增厚，细支气管腔内少量分泌物×200)；图8是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(D组：肺动脉壁增厚，细支气管腔内少量分泌物，局部间质性肺炎×200)；图9是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(E组：肺动脉壁增厚，轻度间质性肺炎×200)；图10是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(E组：大片肺组织结构破坏，伴部分肉芽组织增生，肺动脉壁增厚×200)；图11是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(F组：肺动脉壁增厚，轻度间质性肺炎×200)；图12是本发明试验例4之肺组织病理学观察变化情况图(F组：多发小灶性肺组织结构破坏，伴炎细胞浸润，肺动脉壁增厚×200)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。本发明以下实施例和试验例中涉及的试剂、材料与仪器有(具体实施例和试验例中不再一一列明试剂、材料与仪器的生产厂家、型号、批号、系列)：LC-2130高效液相色谱仪(上海天美公司)；LC-2030紫外检测器(上海天美公司)；激光散射粒度测定仪(英国Malvern公司)；Agilent-1100series高效液相色谱仪(Agilent公司)；ALLTECH3300E-ELSD(ALLTECH公司)；旋转蒸发器(R系列，上海申生科技有限公司)；电热恒温水浴锅(XMTF-6000,上海申生科技有限公司)；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；冷冻离心机(5417R，德国EPPENDORF公司)；Homoex-25高压膜挤出器(赫默仕机电科技有限公司)；BK1301生物显微镜(重庆光学仪器厂)；BS124S电子天平(德国萨多利斯公司)；pH计(型号：PHS-3C,上海精密科学仪器有限公司)；SILC18柱(4.5mm×250mm,5μm填料，CNW公司)；胆固醇(CH,批号：F20041228，国药集团化学试剂有限公司)；维生素E(VE,批号：082K1382，Sigma公司)；大豆磷脂(sbPC，注射级，PC含量大于70％，批号：050602，上海太伟药业有限公司)；竖式膜超滤离心管(Vivaspin500，MWCO：100k,德国萨多利斯公司)；聚碳酸酯径迹蚀刻膜(NucleporeTrack-EtchedPolycarbonateMembranes，英国whatman公司)；二氯甲烷(分析纯，批号：T20100913,国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(分析纯，批号：T20101029,国药集团化学试剂有限公司)；HPLC用甲醇(色谱纯，批号：K3LG2H,HoneywellBurdick&Jackson公司)；HPLC用水为超纯水。乙醇(合成级，批号：20100927,国药集团化学试剂有限公司)磷酸(分析纯，批号：T20100903,国药集团化学试剂有限公司)黄芩苷(Baicalin)对照品(批号：110715-201016中国药品生物制品检定所)黄芪甲苷(AstragalasideⅣ)对照品(批号：110781-200613中国药品生物制品检定所)炙黄芪：批号：110725与110808，上海康桥中药饮片有限公司；姜半夏：批号：110304，上海康桥中药饮片有限公司；黄芩：批号：110715，上海康桥中药饮片有限公司；生甘草：批号：110805，上海康桥中药饮片有限公司；炙麻黄：批号：110622，上海康桥中药饮片有限公司；乌梅：批号：101028，上海康桥中药饮片有限公司。实施例1(固本平喘方提取液的提取工艺)经文献调研，固本平喘方中药味的挥发性成分与水溶性高分子量成分(如淀粉、多糖、蛋白质)不是治疗有效成分，故采用中药传统复方的一般提取纯化工艺水提醇沉法，并采用常规工艺参数。1.1固本平喘方药材的煎煮和醇沉操作步骤：药材称重：按照处方比例分别秤取炙黄芪25g、姜半夏15g、黄芩15g、生甘草15g、炙麻黄15g、乌梅15g(总计100g)药材第一次煎煮：除黄芩外其他药材加8倍量水(800ml)，浸泡30min，加热至沸腾，加入黄芩，保持微沸煎煮1.5h，滤过，收集滤液。药材第二次煎煮：药渣加6倍水(600ml)加热至煮沸，保持微沸煎煮1h，滤过收集滤液。浓缩：合并第一二次煎煮所得滤液，并浓缩至100ml(旋转蒸发)。(条件：水浴温度70℃，转速40转/min)醇沉：于100ml浓缩液中加入乙醇280ml，使含醇量达70％，冷藏24h。1.2固本平喘方药材煎煮液纯化操作步骤：回收乙醇：将上步醇沉后所得药液抽滤，滤液回收乙醇，水浴浓缩至60ml(条件：水浴温度60℃，转速40转/min)醇沉：将上述60ml浓缩液中加入乙醇510ml，使含醇量达85％，冷藏24h。浓缩：将醇沉液抽滤，旋转蒸发回收乙醇(条件：60℃，40r/min)，水浴液浓缩至50ml(2g/mL)备用。备注：经检测，在上述提取纯化过程中黄芩苷的转移率为31.2％，黄芪甲苷的转移率为48.3％，基本符合要求。实施例2(固本平喘方脂质体雾化吸入剂的制备)2.1工艺的选择)根据本课题组以往脂质体制剂的研究，暂定如下处方：sbPC0.3g，CH0.05g，VE0.005g，固本平喘方提取液7.5mL，蒸馏水7.5mL。制备工艺暂定如下：取处方量的sbPC、CH、VE，置于茄型瓶中，加二氯甲烷-甲醇(5:2)混合溶剂使溶解，减压旋转蒸发(45℃，40r/min)，除去溶剂，制得干膜，氮气吹膜数分钟以除去残留溶剂，将固本平喘方提取液用蒸馏水稀释后倒入茄形瓶中，振摇水化干膜，待水化完全后挤压通过合适孔径的聚碳酸酯膜，即得。显微镜下观察成品，可以看到大量囊泡状结构，说明脂质体制备成型，囊泡粒径较均一，近似圆形，但聚集成团。2.2工艺影响因素的考察以包封率为指标，考察因素脂质用量、粒径对脂质体成品质量的影响。2.2.1脂质用量根据“2.1”项下暂定处方，固本平喘方提取液处方量为7.5mL、蒸馏水处方量为7.5mL，规定sbPC0.3g、CH0.05g、VE0.005g为1个单位的脂质用量，设定1、2、3、4、5五个脂质用量水平，得到五个不同脂质用量的处方，分别按“2.1”项下工艺制备脂质体，均通过0.2μm孔径的聚碳酸酯膜，分别测定包封率，结果见下表2-1，可见，在不同脂质用量下，2个单位脂质用量的处方在脂质用量少的情况下，包封率优于其他脂质用量的处方，故2个单位是脂质用量的最佳水平。表2-1.不同脂质用量样品包封率测定结果2.2.2粒径根据表1，2、4、5三个脂质用量水平下脂质体的包封率较高，按“2.1”项下工艺重新制备以上三个水平的脂质体各两份，分别通过0.2μm、0.4μm孔径的聚碳酸酯膜，分别测定包封率，结果见下表2-2，可见，不同粒径对于药物包封率影响较小。故从碳酸脂膜滤过的方便性上考虑拟定脂质体粒径控制在0.4μm。表2-2.不同脂质用量样品包封率测定结果2.3最佳工艺确定根据以上处方工艺选择与影响因素试验结果，确定最适处方如下sbPC0.6g，CH0.1g，VE0.01g，固本平喘方提取液7.5mL，蒸馏水7.5mL。制备工艺：取处方量的sbPC、CH、VE，置于茄型瓶中，加二氯甲烷-甲醇(5:2)混合溶剂使溶解，减压旋转蒸发(45℃，40r/min)，除去溶剂，制得干膜，氮气吹膜数分钟以除去残留溶剂，将固本平喘方提取液用蒸馏水稀释后倒入茄形瓶中，振摇水化干膜，待水化完全后挤压通过0.4μm的聚碳酸酯膜，即得。2.4工艺验证与放大2.4.1样品制备按“2.3”项下处方工艺进行样品制备，按1倍处方量制备如下三批样品：批号分别为110908、110910、110918；按133倍处方量制备样品批号为110928。2.4.2样品包封率测定取固本平喘方脂质体样品(批号分别为110908、110910、110918、110928)，以离心超滤法(测定过程：取待测脂质体混悬液样品，摇匀，精密量取200μL，置于超滤离心管内，进行冷冻离心(相对离心力：15000g，温度：5℃),收集全部外水相，转移至25mL量瓶中，以甲醇定容，摇匀，在指定色谱条件(色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(CNW，250mm×4.6mm，5μm)；甲醇－磷酸水溶液[水 －磷酸(53:0.2)](58:42)为流动相；检测波长为280nm。此条件下，黄芩苷能与其它组分实现完全分离(R≥1.5)，理论板数按黄芩苷峰计均不低于2500)下进样10μL进行测定，按标准曲线计算外水相中药物含量，按下式计算包封率：EE＝(WS-WEA)/WS×100％，式中EE为包封率；WS为取样量中黄芩苷的含量(mg)；WEA为外水相中黄芩苷的含量(mg)。每个样品平行测定三份，取平均值。)进行测定，结果见表2-3。表2-3.样品包封率测定结果2.4.3样品粒径的测定取固本平喘方脂质体样品(批号分别为110908、110910、110918、110928)，以水化液稀释适当倍数，以激光散射粒度测定仪进行测定，结果见表2-4。表2-4.样品粒径测定结果2.4.4样品Zeta电位的测定取固本平喘方脂质体样品(批号分别为110908、110910、110918、110928)，以激光散射粒度测定仪进行测定，结果见表2-5。表2-5.样品Zeta电位测定结果2.4.5样品含量测定结果取固本平喘方脂质体样品(批号分别为110908、110910、110918、110928)，以HPLC法(测定过程：取待测样品1mL，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解、稀释并定容，摇匀；取所得溶液2mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，即得供试品溶液，进样10μL进行HPLC测定，以标准曲线法定量 并计算样品含量，每个样品平行测定三份，计算平均值。)进行测定，结果见表2-6。表2-6.样品的含量测定结果试验例1-6中药复方固本平喘方(包括炙黄芪、姜半夏、黄芩、生甘草、炙麻黄、乌梅)是在经验方基础上结合现代研究进展优化配伍而成，具有益气平喘、脱敏解毒的功效。中药雾化吸入剂治疗哮喘有较好效果，但方式多为简单的雾化吸入，多数临床观察仅停留在经验层面，实验研究的机理不明确，缺乏深入的机理研究。将药物制成合适的纳米载体可使之在雾化吸入时，让药物选择性的粘附在气管、支气管粘膜上，直接缓解呼吸道粘膜局部的炎症，并在局部形成药物储库，延长作用时间，因此可以大大提高生物利用度，提高药效。故我们将固本平喘方采用提取纯化工艺水提醇沉法制成固本平喘方提取液，再以薄膜水化法制成固本平喘方纳米脂质体，稀释成为固本平喘方脂质体雾化吸入剂，通过雾化吸入器让豚鼠吸入，来客观地观察和评价其治疗效果，探讨在细胞和基因水平的作用机理，研究其药效学和毒理学，为在临床的推广和应用打下基础。试验例1(固本平喘方脂质体雾化吸入剂对哮喘豚鼠症状和血常规的影响)1.实验材料1.1药物1.1.1治疗用药：固本平喘方脂质体雾化吸入剂：每毫升含1g生药量，由上海中医药大学中药学院提供。1.1.2阳性对照药：小青龙合剂，湖北福广制药有限公司生产，国药准字Z42021495。功能主治是解表化饮，止咳平喘,用于风寒水饮，恶寒发热，无汗，喘咳痰稀。每支装10ml。醋酸地塞米松片，山西亨瑞达制药有限公司生产，国药准字H14022127，规格：0.75mg/片。1.2实验动物英国种普通级健康豚鼠39只，体重250～300g,均由上海中医药大学实验动物中心提供，普通级，实验动物合格证号[上海中医药大学实验动物中心SYXK(沪)2004-0005]1.3设备和试剂1.3.1设备贝尔思超声雾化器(BSW-2A型)由鞍山市贝尔思电子有限公司生产。希森美康(XE-2100)全自动血球分析装置，由日本SYSMEXCORPORATIION公司生产。1.3.2试剂卵蛋白粉(OVA)，国药集团化学试剂有限公司生产(批号：F20110811)2方法2.1造模方法:将豚鼠正常饲养1周后开始进行致敏。第1天，先用75％乙醇溶液消毒局部皮肤后,给哮喘模型组、高剂量组、低剂量组及中药对照组、西药对照组每只豚鼠腹腔注射10％卵蛋白生理盐水溶液1.6ml(6ml/Kg，另有0.1ml损耗)致敏。空白对照组用0.9％生理盐水。第8天，再次注射致敏，各组剂量和方法同前。第14天开始激发引喘，将豚鼠置于4L的玻璃钟罩内用1％卵蛋白雾化吸入15-30S，观察20-30S，诱发哮喘发作(说明模型成功)。如豚鼠出现抽搐,马上将其取出。以后隔天进行1次引喘，至实验结束。同时，从第14天起，引喘后1小时各组进行相应治疗。至第28天，各组动物处死，提取样本。2.2分组和治疗方法：A正常对照组：致敏、激发以及治疗均以0.9％生理盐水代替。B哮喘模型组：造模成功后每天吸入1％OVA溶液激发1次。C中药对照组：雾化吸入小青龙合剂1克/次。D固本平喘方脂质体雾化吸入剂小剂量组：雾化吸入剂1克/次。E固本平喘方脂质体雾化吸入剂大剂量组：雾化吸入剂3克/次。F西药对照组：雾化吸入地塞米松1g/次。2.3检测方法:采用全自动血球分析装置自动分析血常规全套。2.4统计方法所有计量数据均以均数±标准差方式表示，多组之间均数比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。应用spss12.0统计软件进行统计分析。3结果3.1一般情况变化：各组在被激发后症状表现不同，正常对照A组豚鼠表现精神活跃，反应灵敏、呼吸平稳无明显呼吸急促、困难和喘鸣音，模型组和各用药组豚鼠在吸入OVA后不久出现躁动、搔抓颜面等情况，部分豚鼠出现呼吸急促、腹式呼吸，甚至哮鸣音等。在末次激发时，小剂量治疗D组豚鼠未出现哮鸣音和呼吸困难，其他各治疗组均有2-3只豚鼠出现轻度呼吸急促、喘鸣等情况。3.2血常规变化：模型组与其他组比较WBC、EO水平明显升高，差异有统计学意义。正常组较其他各组的EO水平均低，差异有统计学意义。D、E、F组的BA水平与模型组比较显著增高，D、F组与C组比较也有差异。A组与B组的PMN差别有统计意义，其余各组无差别。B组与A组比较，Ly有显著差别，D、E、F组与B组的差别也有统计学意义。详见表1表1.固本平喘方脂质体雾化吸入剂对哮喘豚鼠血常规的影响(×109/L)注：与A组比较*P<0.05，**P<0.01；与B组比较△P<0.05，△△P<0.01；与C组比较#P<0.05，△##P<0.014讨论支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，反复接触过敏原导致变态反应性炎症是多数哮喘发作的基本机制。白细胞(WBC)升高是细菌性炎症的主要表现，但是在哮喘动物实验中也发现存在外周血WBC增高的情况，有研究表明中药复方能显著降低大鼠外周血WBC，较模型组有显著差异[向希雄，畅肺防喘方对哮喘大鼠气道重建和炎症介质的影响的试验研究[J]，湖北中医学院，2009，5，30：10.]。哮喘炎症的特征性标志是嗜酸性细胞(EOS)的浸润，EOS细胞浆中含有嗜酸性细胞阳离子蛋白(ECP)、碱性蛋白(MBP)，嗜酸细胞衍生的神经毒素(EDN),嗜酸细胞过氧化物酶(EPO)等特殊蛋白质颗粒以及多种炎症介质、细胞因子和氧自由基，EOS释放组胺，产生气道高反应性(AHR)，因此EOS是引起迟发相变态反应和气道高反应性的关键细胞，在介导气道变应性炎症参与支气管哮喘发病的调节中起重要作用[陈强，朱绿猜，刘建梅，等.哮喘儿童嗜酸细胞阳离子蛋白、肿瘤坏死因子-α最大呼气流速测定及其临床意义[J].实用儿科临床杂志，2000,15(6):320-321.]。同时，EOS在气道的缓解期也处于高水平，与晚期哮喘反应和气道高反应性关系密切。中性粒细胞NEUT(PMN)参与哮喘的发生过程,通过释放弹性蛋白酶、氧自由基、TNF-a等在持续性、致命性哮喘中发挥了重要作用[MouldAW,MatthaeiKI,YongIG,etal.Relationshipbetweeninterleukin-5andeotaxininregulatingbloodandtissueeosinophiliainmice[J].JClinInvest,1997,99(5):1064-1071]。近年来很多研究表明,PMN润引起的气道炎症与突发性致死性哮喘和重度哮喘的关系密切，与慢性持续期和缓解期哮喘关系密[季蓉，阿权瀛.对中性粒细胞在哮喘发病机制中的新认识[J]，国外医学：呼吸系统分册，2005，4：314-316]。有报道发现，哮喘急性发作期患者嗜碱性粒细胞(BA)计数,与发病频率有正相关，认为嗜碱性粒细胞计数是判断支气管哮喘患者病情的重要指标[薛旗山，禹冬梅，索朝霞，等.支气管哮喘患者嗜碱性粒细胞水平及临床研究[J]，实用心脑肺血管病杂志，2009，01：22-23]。淋巴细胞(LY)包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，EOS分化、成熟、聚集又依赖于淋巴细胞的活化及其产生的细胞因子来调节，因此淋巴细胞在哮喘发病中也起了关键作用，它影响哮喘的发生和哮喘气道炎症及气道高反应性其中T淋巴细胞具有“中枢性”调节作用[[LarcheM，RobinsonDS，KayAB，eta1.TheroleofTlymphocytesinthepathogenesisofasthma[J].JAllergyClinImmtmol，2003，111(3)：450]。我们的研究发现，模型组与其他组比较WBC、EO水平明显升高，差异有统计学意义，说明模型组的血液中EO增多，处于一种致敏状态。正常 组较其他各组的EO水平均低，差异有统计学意义。D、E、F组的BA水平与模型组比较显著增高，D、F组与C组比较有差异，提示D、E、F这三组的血液中BA增多，而D、F与C存在不同，说明大剂量和西药对于降低BA的疗效更好。A组与B组的PMN差别有统计意义，其余各组无差别，说明各组对于PMN的降低影响不大。B组与A组比较，Ly有显著差别，D、E、F组与B组的差别也有统计学意义，提示造模后的豚鼠Ly明显升高，而2个治疗组和西药组对于豚鼠外周血的Ly有降低作用。试验例2(固本平喘方脂质体雾化吸入剂对哮喘豚鼠免疫学的影响)1.实验材料1.1药物1.1.1治疗用药：固本平喘方脂质体雾化吸入剂：每毫升含1g生药量，由上海中医药大学中药学院提供。1.1.2阳性对照药：小青龙合剂，湖北福广制药有限公司生产，国药准字Z42021495。功能主治是解表化饮，止咳平喘,用于风寒水饮，恶寒发热，无汗，喘咳痰稀。每支装10ml。醋酸地塞米松片山西亨瑞达制药有限公司生产，国药准字H14022127，规格：0.75mg/片。1.2实验动物英国种普通级健康豚鼠39只，体重250～300g,均由上海中医药大学实验动物中心提供，普通级，实验动物合格证号[上海中医药大学实验动物中心SYXK(沪)2004-0005]1.3设备和试剂1.3.1设备贝尔思超声雾化器(BSW-2A型)由鞍山市贝尔思电子有限公司生产。通用酶标仪(ELX800型)美国Bio-Tek生产。洗板机(ELX50型)美国Bio-Tek生产。可调多道移液器(200ul)法国GILSON生产。移液器(P20\P200\P1000)法国GILSON生产。隔水式恒温箱(PYX-DHS型)上海跃进医疗器械一厂生产。1.3.2试剂卵蛋白粉(OVA)，国药集团化学试剂有限公司生产(批号：F20110811)、豚鼠白介素-4(GuineaPigIL-4)ELISA试剂盒、豚鼠白介素-5(GuineaPigIL-5)ELISA试剂盒、豚鼠白介素-12(GuineaPigIL-12)ELISA试剂盒、豚鼠白介素-25(GuineaPigIL-25)ELISA试剂盒豚、豚鼠干扰素-γ(GuineaPigIFN-γ)ELISA试剂盒均由上海卡努生物科技有限公司提供。2方法2.1造模方法:将豚鼠正常饲养1周后开始进行致敏。第1天，先用75％乙醇溶液消毒局部皮肤后,给哮喘模型组、高剂量组、低剂量组及中药对照组、西药对照组每只豚鼠腹腔注射10％卵蛋白生理盐水溶液1.6ml(6ml/Kg，另有0.1ml损耗)致敏。空白对照组用0.9％生理盐水。第8天，再次注射致敏，各组剂量和方法同前。第14天开始激发引喘，将豚鼠置于4L的玻璃钟罩内用1％卵蛋白雾化吸入15-30S， 观察20-30S，诱发哮喘发作(说明模型成功)。如豚鼠出现抽搐,马上将其取出。以后隔天进行1次引喘，至实验结束。同时，从第14天起，引喘后1小时各组进行相应治疗。至第28天，各组动物处死，提取样本。2.2分组和治疗方法：A正常对照组：致敏、激发以及治疗均以0.9％生理盐水代替。B哮喘模型组：造模成功后每天吸入1％OVA溶液激发1次。C中药对照组：雾化吸入小青龙合剂1克/次。D固本平喘方脂质体雾化吸入剂小剂量组：雾化吸入剂1克/次。E固本平喘方脂质体雾化吸入剂大剂量组：雾化吸入剂3克/次。F西药对照组：雾化吸入地塞米松1g/次。2.3ELISA试剂检测方法:2.3.1样品收集、处理及保存方法(1)血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。(2)血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。(3)细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。(4)组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。(5)保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。2.3.2试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。2.3.3操作步骤(1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。(2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；(3)样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。(4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。(6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。(7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。2.3.4结果判断绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。2.4统计方法所有计量数据均以均数±标准差(Χ±S)方式表示，多组之间均数比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。应用spss12.0统计软件进行统计分析。3结果研究结果发现，IL-4、IL-5、IL-12模型组和各药物治疗组的与对照组比较均有差异，各治疗组与模型组比较也同样有显著差异；IL-25、IFN-γ各药物治疗组与模型组比较均有差异，而B组、E组、F组的IL-25与对照组A比较均有差异，B组的IFN-γ与A组比较有显著差异。具体如下：表1.固本平喘方脂质体雾化吸入剂方对哮喘豚鼠免疫学的影响浓度(pg/mL)注：与A组比较*P<0.05，**P<0.01；与B组比较△P<0.05，△△P<0.01；与C组比较#P<0.05，△##P<0.014讨论支气管哮喘是炎性细胞及细胞因子共同参与的免疫失衡性变应性疾病，是由嗜酸粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的气道慢性炎症。在发病过程中，有多种细胞因子参与，其中最重要的有IL-1、2、4、5、12、25及IFN－γ等，对气道慢性炎症的启动、维持起着重要作用。根据细胞表面表达的标志物不同,大部分成熟T细胞可以划分为两种独特的表型,即分化群(CD)CD4+和CD8+T细胞。这种划分与其基本功能相关。CD4+和CD8+T细胞的功能主要是通过其产生的细胞因子进行综合调节而实现的。根据分泌细胞因子的种类可将CD4+T细胞分成Th0和Th3两类细胞,Th0细胞又可分化成Th1和Th2。正常情况下,Th0细胞按一定比例分别向Th1和Th2分化,两者处于相对平衡状态,维持着机体正常的细胞免疫和体液免疫。Th1类细胞分泌IL-2、γ干拢素(IFN-γ)等,主要介导与细胞内致病原有关的细胞免疫；Th2亚群产生IL-4、IL-5和IL-10等,Th1/Th2比例失衡可引起异常的免疫应答。在哮喘的炎症过程中,Th2型细胞反应占优势是其重要特征。IL一5主要是由Th2类淋巴细胞产生的细胞因子，可促进B淋巴细胞分化、增殖来协同IL-4合成IgE，是EOS分化、发育和功能调节最重要的细胞因子，通过促进嗜酸细胞分化、成熟、脱颗粒，阻止EOS发生凋亡而延长其存活[施焕中，林江涛.肺脏免疫学及免疫相关性疾病[M].北京：人民卫生出版社，2006：245—248.]。有报道发现，中药具有显著调节IL-5的作用[范欣生，俞晶华，方泰惠,等.辛夷复方提取液对哮喘豚鼠血清IL一5水平的影响[J]，安徽中医学院学报，2008，l2(27)，6：40-41.]。IL-4是由活化的Th2细胞亚群、B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞等产生的多效性细胞因子，但主要以Th2细胞为主[CorryDB,KheradmandF.InductionandregulationoftheIgEresponse[J].Mature.1999，402(6760Suppl):B18-23.]。IL-4在IgE的合成中至关重要，可以诱导高水平的IgE合成。IL-4能促使Th0细胞向Th2型分化，Maggi发现在T细胞克隆培养液中加入IL-4可使细胞从Th1转化成Th0，甚至Th2细胞[王立波.人类TH1细胞亚群与支气管 哮喘[J].国外医学·免疫学分册.1995，18(1)：21-23.]，此作用可被IL-4抗体阻断。IL-4还能刺激B细胞的增殖和分化；促进肥大细胞的生长；促进内皮细胞粘附因子表达；诱导淋巴细胞的粘附和嗜酸粒细胞的趋化；促进粘蛋白的基因表达和杯状细胞化生等，在哮喘发病中具有重要意义。IL-12主要由巨噬细胞、单核细胞产生,树突状细胞及表皮内朗格汉斯细胞亦可产生[金伯泉.细胞与分子免疫学[M].第2版.北京:科学出版社,2001.151-153.]。IL-12通过作用于Th2细胞减少IL-4和IL-5的生成,减少Eos气道感觉神经末梢的浸润,从而间接抑制BHR；另一方面增加的IFN-γ可起到协同作用,而且IL-12可选择性抑制骨髓干细胞向Eos分化,减少气道Eos的浸润[RaisM,WildJS,ChoudhuryBK,etal.Interleukin-12inhibitseosinophildifferentiationfrombonemarrowstemcellsinaninterferon-gamma-dependentmannerinamousemodelofasthma[J].ClinExpAllergy,2002,32(4):627-632.],显示了IL-12可多途径抑制哮喘的免疫炎性反应和气道高反应。Hogan等[HoganSP,FosterPS,TanX,etal.MucosalIL-12genedeliveryinhibitsallergicairwaysdiseaseandrestoreslocalantiviralimmunity[J].EurJImmunol,1998,28(2):413-423.]发现:IL-12可使小鼠血清中特异性IgE和IgG1水平显著降低,特异性IgG2水平明显增高,说明IL-12可有效抑制机体对变应原的超敏状态。IL-25是Th2细胞产生的细胞因子，其受体选择性表达于有Th2细胞，且IL-25可以促进Th2细胞的分化，与哮喘密切相关。报道发现，哮喘成人血清IL-25水平能反应哮喘气道炎症活动情况及严重程度,且两者在哮喘急性发作期存在正相关性[阎昱升，胡成平.支气管哮喘患者血清IL-25、ECP的表达及意义[J],医学临床研究,20122905:887-888,892.]。INF-γ对巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞具有高效活化作用，它能增强巨噬细胞杀伤能力，并诱导其分泌各种细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12，抑制肥大细胞和EOS，抑制TH2细胞产生IL-4，促进IgG的产生，阻断B细胞合成抗体分子向IgE类别转换。IFN-γ有利于Th1细胞的分化,而抑制Th2的分化。Pernis等[PernisA,GuptaS,GollobKL,etal.LackofinterferongammareceptorbetachainandthepreventionoginterferongammasignalinginTh1cells[J].Science,1995,269(5221):245-24]研究发现:在Th1和Th2细胞中,IFN-γ可诱导的信号传导因子(STF-IFN-γ)的活性状态不同，关键在于IFN-γ同其受体亚单位结合的不同。IFN-γ受体由α、β两条链组成,IFN-γ与α、β两条链的结合都是活化STF-IFNγ和诱导干扰素调节因子-1(IRF-1)的表达所必需的。哮喘的炎症反应是以Th2细胞反应为主。在Th2细胞亚群中,IFN-γ可以作用表面IFN-γ受体,引起Jak1和Jak2自身磷酸化,诱导STF-IFN-γ,而抑制Th2细胞的增殖，达到Th1和Th2两个细胞亚群的平衡状态,从而使哮喘患者的呼吸道炎症得到控制。我们的研究结果发现，IL-4、IL-5在模型组比其他各组明显升高，差异有统计学意义，提示造模效果较好，且中西药治疗均有一定降低IL-4、IL-5水平的疗效，但各治疗组与正常对照组尚有差距，说明治疗后尚未能恢复正常水平。IL-12在豚鼠造模后显著减低，经中西药治疗后均有所提高，与模型组比较差异有统计意义，但与空白对照组比较也有差异。C、D、F组IL-25水平与模型组比较均有明显减低，差异有统计学意义，而B组、E组、F组的IL-25与对照组A比较均有差异，而C组没有差异，说明C组了对于IL-25的调节能力更强。各治疗组的IFN-γ与B组比较有显著差异,提示模型组明显降低，而 治疗后各治疗组与空白对照组无差异，提示各组能较好地提高血清IFN-γ水平。改善哮喘变应性炎症状态。试验例3(固本平喘方脂质体雾化吸入剂对哮喘豚鼠相关基因的影响)1.实验材料1.1药物1.1.1治疗用药：固本平喘方脂质体雾化吸入剂：每毫升含1g生药量，由上海中医药大学中药学院提供。1.1.2阳性对照药：小青龙合剂，湖北福广制药有限公司生产，国药准字Z42021495。功能主治是解表化饮，止咳平喘,用于风寒水饮，恶寒发热，无汗，喘咳痰稀。每支装10ml。醋酸地塞米松片山西亨瑞达制药有限公司生产，国药准字H14022127，规格：0.75mg/片。1.2实验动物英国种普通级健康豚鼠39只，体重250～300g,均由上海中医药大学实验动物中心提供，普通级，实验动物合格证号[上海中医药大学实验动物中心SYXK(沪)2004-0005]1.3设备和试剂1.3.1设备贝尔思超声雾化器(BSW-2A型)由鞍山市贝尔思电子有限公司生产；Rotorgene3000实时荧光定量PCR仪由澳大利亚Rotorgene生产；高速冷冻离心机(centrifuge-5417R)德国EPPENDORF公司生产低温冰箱(MDF-292)由SANYOCO.生产；高压蒸气消毒器(YXQ.SGH.280)上海医用核子仪器厂生产；制冰机(SIM-F124)SANYOCO.生产；752紫外分光光度计由上海第三分析仪器厂生产。1.3.2试剂卵蛋白粉(OVA)，国药集团化学试剂有限公司生产(批号：F20110811)Sybrgreen,TAKARA公司生产；DEPC,博彩生物技术公司生产；Trizol、M-MuLV(200U/ul)、RNAsin(40U/ul)invitrogen公司生产；dNTP(each10mM)博彩生物技术公司；随机引物100uM,博彩生物技术公司；引物由上海英俊生物技术有限公司合成。2方法2.1造模方法:将豚鼠正常饲养1周后开始进行致敏。第1天，先用75％乙醇溶液消毒局部皮肤后,给哮喘模型组、高剂量组、低剂量组及中药对照组、西药对照组每只豚鼠腹腔注射10％卵蛋白生理盐水溶液1.6ml(6ml/Kg，另有0.1ml损耗)致敏。空白对照组用0.9％生理盐水。第8天，再次注射致敏，各组剂量和方法同前。第14天开始激发引喘，将豚鼠置于4L的玻璃钟罩内用1％卵蛋白雾化吸入15-30S，观察20-30S，诱发哮喘发作(说明模型成功)。如豚鼠出现抽搐,马上将其取出。以后隔天进行1次引喘，至实验结束。同时，从第14天起，引喘后1小时各组进行相应治疗。至第28天，各组动物处死，提取样本。2.2分组和治疗方法：A正常对照组：致敏、激发以及治疗均以0.9％生理盐水代替。B哮喘模型组：造模成功后每天吸入1％OVA溶液激发1次。C中药对照组：雾化吸入小青龙合剂1克/次。D固本平喘方脂质体雾化吸入剂小剂量组：雾化吸入剂1克/次。E固本平喘方脂质体雾化吸入剂大剂量组：雾化吸入剂3克/次。F西药对照组：雾化吸入地塞米松1g/次。2.3RT-PCR检测方法:2.3.1RNA抽提实验步骤(invitrogen公司Trizol试剂盒)(1)取50mg左右组织，加入1mlTrizol液，充分匀浆。(2)22℃，静置5min；(3)加入氯仿0.2ml，颠倒15s；(4)22℃，静置3min；(5)离心：4℃×14000转/分×15min；(6)取上清液0.5ml；(7)加入0.5ml异丙醇，混匀；(8)22℃，静置10min；(9)离心：4℃×14000转/分×10min；(10)弃上液；(11)加入1ml4℃75％乙醇；(12)离心：4℃×10000转/分×5min；(13)弃上液，真空干燥5min；(14)用40ulDEPC处理水溶解，-80℃保存。2.3.2RT-PCR实验步骤(1)分光光度计检测RNA的浓度取样本5ul加入石英比色杯内，加入双蒸水1ml，充分混匀。与双蒸水对照。读260nm和280nm测得值，当260nm与280nm的比值在1.8与2.0之间时，表示样本RNA纯度较高。记录。计算：OD260为1时，为40ugRNA，所以计算如下：样品总RNA含量(ug/ul)＝OD260×稀释倍数×40/1000样本RNA含量(ug/ul)＝OD260nm×200×40/1000＝OD260×8(2)反转录65℃5min，快速插入冰水中，离心，冰上加入：37℃50min，70℃15min(灭活逆转录酶)。-20℃保存。(3)PCR扩增PCR反应条件为95℃10秒；95℃5s，60℃20s，40个循环；2.3.3数据处理方法：目的基因的相对表达量可以采用ΔΔCT法加以分析。通常以正常或阴性作为对照样本。CT值——n：扩增循环ΔCT＝目的基因CT－内参CT(注：同一反转录产物扩增后)ΔΔCT＝观察样本ΔCT－对照样本ΔCT＝(观察样本目的基因CT－观察样本内参CT)－(对照样本目的基因CT－对照样本内参CT)样本的相对表达量：＝2－ΔΔCT2.3.4引物序列：名称引物序列产物长度actin-Fgatctggcaccacacctttt138actin-Rggggtgttgaaagtctcgaastat6-Fttggcttcatcagcaaacag117stat6-RggatgacatgagcaatggtgTNFa-Fatcaagagtccctgccagaa180TNFa-Rggcaatgaccccaaagtaga2.4统计方法所有计量数据均以均数±标准差(Χ±S)方式表示，多组之间均数比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。应用spss12.0统计软件进行统计分析。3结果实验结果发现，STAT6、TNF-α两基因在A组的表达均低于其他组，且差异有显著意义。STAT6在治疗组E、D的表达较模型组低，且较C组低，均有统计学差异，D组与F组比较也显示有统计学差异。TNF-α治疗组E、D的表达较模型组B和C组低，均有统计学差异，D、E组与F组比较也显示有统计学差异。见下表1。表1.固本平喘方脂质体雾化吸入剂对哮喘豚鼠STAT6、TNF-α基因表达的影响注：与A组比较*P<0.05，**P<0.01；与B组比较△P<0.05，△△P<0.01；与C组比较#P<0.05，##P<0.01；与F组比较▲P<0.05，▲▲P<0.014讨论哮喘气道炎症发生的同时往往存在多种炎症基因(包括相关细胞因子，趋化因子等)表达的增加或异常表达。信号转导子和转录激活子(STATS)是一种新型的能与靶基因调控区DNA结合的转录因子家族，在介导多种细胞因子及趋化因子的信号转导过程中起关键作用,信号转导子和转录激活子6(STAT6)作为一种新型的细胞内信号转导和基因表达调控的转录因子家族成员之一,近年来在哮喘气道炎症和气道高反应形成中的关键调控作用越来越受到重视[叶乐平,李昌崇.信号转导子和转录激活子6与支气管哮喘[J]，国外医学：儿科学分册，2003，5]。STAT6在Th2分化中起关键作用，是Th2分化的特异性转录因子，可促进Th2增殖和产生IL-4、IL-13等Th2型细胞因子[曹庆松，张涛，王丽华，等.STAT6在鼻息肉组织中的表达及其与嗜酸粒细胞浸润的关系[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2009，23(20)：917－922.],能调节Th2优势应答，促进B细胞分化和IgE的类型转换，介导支气管哮喘的气道炎症和气道高反应性。而中药对于STAT6表达有一定影响，有报道显示，STAT6对哮喘气道炎症形成具有调控作用，而中药提取物牛膝多糖(ABPS)可以降低其水平，可能在防治哮喘气道炎症方面比较有前途[李昌崇,叶乐平,苏苗赏,等，牛膝多糖对哮喘大鼠信号转导子和转录激活子6表达的影响[J],ChinJApplPhysiol,2006；22(2):210-212]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种主要由单核巨噬细胞产生的、具有广泛生物学活性的细胞因子，是主要的前炎症细胞因子，是气道强有力的刺激剂。Noguchi等[NoguchiE,YokonchiY,ShibasakiM,etal.AssociationbetweenTNFApolymorphismandthedevelopmentofasthmaintheJapansepopulation[J].AmJRespirCritCareMed,2002,166(1):43-46]报道，TNF-α诱发哮喘发作与遗传过敏性哮喘有关。在遗传过敏性哮喘患儿家族中用聚合酶链反应实验研究揭示，TNF-α基因染色体侧链片段长度的多态性决定家族遗传基因，从而影响哮喘的发生和发展。TNF-α是哮喘过程中重要的启动因子，可诱导一系列与炎症有关的细胞因子，如白介素1、白介素4、白介素5、白介素8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粘附分子[WilsonSJ,WallinA,Della-CioppaG,etal.EffectsofbudesonideandformoterolonNF-kappaB,adhesionmolecules,andcytokinesinasthma[J].AmJRespirCritCareMed,2001,164(6):1047-1052.]等的生成以及与炎症有关的酶及受体的合成与表达。TNF-α在哮喘气道慢性炎症发生发展过程中起重要作用,也参与炎症反应主要通过作用于呼吸道血管内皮细胞，增加某些粘附分子的表达，诱发血小板活 化因子、白介素1及白介素8等的释放，而促进炎症细胞粘附、游走、浸润及中性粒细胞脱颗粒，同时也通过自分泌的方式作用于单核巨噬细胞本身而释放炎症介质，加剧炎症反应，导致组织损伤。进一步研究TNF-α在哮喘的发病机制中作用对于完善哮喘的发病机制及防治均有重要的意义。通过豚鼠的动物实验发现，STAT6、TNF-α两基因在哮喘豚鼠中呈现高表达状态，与正常组比较有显著差异。经过固本平喘方脂质体雾化吸入剂药物治疗后，两基因的的表达均较模型组有所降低，且与小青龙汤对照组有差异，提示治疗组药物有一定的功效，小青龙汤主要以驱邪为主，与治疗组固本补肾的立方基础不同，对于基因表达的影响不大。D组的STAT6、TNF-α两基因水平较西药F组有差异，而E组TNF-α的水平较西药F组有差异，考虑可能是因为西药组主要环节症状为主，无中医扶正固本之功效和作用。试验例4(固本平喘方脂质体雾化吸入剂对哮喘豚鼠组织病理变化情况)1.实验材料1.1药物1.1.1治疗用药：固本平喘方脂质体雾化吸入剂：每毫升含1g生药量，由上海中医药大学中药学院提供。1.1.2阳性对照药：小青龙合剂，湖北福广制药有限公司生产，国药准字Z42021495。功能主治是解表化饮，止咳平喘,用于风寒水饮，恶寒发热，无汗，喘咳痰稀。每支装10ml。醋酸地塞米松片山西亨瑞达制药有限公司生产，国药准字H14022127，规格：0.75mg/片。1.2实验动物英国种普通级健康豚鼠39只，体重250～300g,均由上海中医药大学实验动物中心提供，普通级，实验动物合格证号[上海中医药大学实验动物中心SYXK(沪)2004-0005]1.3设备和试剂1.3.1设备1.3.1设备贝尔思超声雾化器(BSW-2A型)由鞍山市贝尔思电子有限公司生产。莱卡SP1600切片机由上海莱卡仪器有限公司生产。奥林巴斯CX31显微镜。1.3.2试剂卵蛋白粉(OVA)，国药集团化学试剂有限公司生产(批号：F20110811)2方法2.1造模方法:将豚鼠正常饲养1周后开始进行致敏。第1天，先用75％乙醇溶液消毒局部皮肤后,给哮喘模型组、高剂量组、低剂量组及中药对照组、西药对照组每只豚鼠腹腔注射10％卵蛋白生理盐水溶液1.6ml(6ml/Kg，另有0.1ml损耗)致敏。空白对照组用0.9％生理盐水。第8天，再次注射致敏，各组剂量和方法同前。第14天开始激发引喘，将豚鼠置于4L的玻璃钟罩内用1％卵蛋白雾化吸入15-30S，观察20-30S，诱发哮喘发作(说明模型成功)。如豚鼠出现抽搐,马上将其取出。以后隔天进行1次引 喘，至实验结束。同时，从第14天起，引喘后1小时各组进行相应治疗。至第28天，各组动物处死，提取样本。2.2分组和治疗方法：A正常对照组：致敏、激发以及治疗均以0.9％生理盐水代替。B哮喘模型组：造模成功后每天吸入1％OVA溶液激发1次。C中药对照组：雾化吸入小青龙合剂1克/次。D固本平喘方脂质体雾化吸入剂小剂量组：雾化吸入剂1克/次。E固本平喘方脂质体雾化吸入剂大剂量组：雾化吸入剂3克/次。F西药对照组：雾化吸入地塞米松1g/次。2.3肺组织病理学检查各组豚鼠分别于末次激发后24h内用2％戊巴比妥钠腹腔麻醉下开胸。取右肺下叶组织，置4％甲醛固定，24h后酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片行HE染色，光镜下观察支气管周围炎性病变。2.3.1.肺组织切片制备①切取标本同一部位组织，大小约2×1×lmm.。②以乙醇进行梯度脱水(80％乙醇1次、95％乙醇2次、100％乙醇3次)。③浸二甲苯2次，以透明。④用58℃低熔点石蜡浸蜡2次。⑤包埋蜡块。⑥5um常规切片，裱于防脱片剂处理过的干净载玻片上。⑦置60℃恒温箱中烤片3h，备用。2.3.2肺组织HE染色①切片以二甲苯脱蜡2次。②以乙醇进行梯度脱水(100％乙醇3次、95％乙醇2次、80％乙醇l次)。③在蒸馏水中停留2min后，以苏木素溶液染细胞核。④自来水冲洗，去掉浮色。⑤1％盐酸酒精分化。⑥蒸馏水漂洗后，以1％伊红酒精溶液染细胞质。⑦以乙醇进行梯度脱水(80％乙醇1次、95％乙醇2次、100％乙醇3次)。⑧以二甲苯透明，树脂胶封片。光镜下观察(如图1-12所示)。3结果与讨论肺组织病理学观察变化情况，A正常对照组(图1、2)：支气管及周围肺组织结构清晰，肺动脉壁轻度增厚,有2例伴有轻度间质性肺炎。B哮喘模型组(图3、4)：肺动脉壁增厚，细支气管腔内充满炎性分泌物,有2例伴有肺间质纤维组织增生。C中药对照组(图5、6)：肺内细支气管壁及管周见少量炎细胞浸润，腔内少量分泌物。小灶性肺组织结构破坏，伴部分肉芽组织增生。D固本平喘方脂质体雾化吸入剂小(图7、8)：肺动脉壁增厚，细支气管腔内少量分泌物，3例出现轻度间质性肺炎和局部间质性肺炎。E固本平喘方脂质体雾化吸入剂大(图9、10)：1肺动脉壁增厚，轻度间质性肺炎。2例出现局部肺组织破坏，伴肉芽组织增生。F西药对照组(图11、12)：肺动脉壁增厚，轻度间质性肺炎。2例出现肺组织结构破坏，另有1例局部肺出血。由以上病理结果可以看出，正常组由于雾化等因素影响，存在肺动脉壁增厚和轻微炎症的情况。哮喘模型组的炎症情况最为严重，动脉壁增厚。中药对照组炎症情况减轻，伴有肉芽组织增生。两组治疗 组同样有肺动脉增厚，并有轻度炎症存在。西药组存在肺组织结构受到破坏的情况，以上不排除外界感染的可能。试验例5(固本平喘方脂质体雾化吸入剂的皮肤刺激试验研究)1.试验材料1.1药物:固本平喘方脂质体雾化吸入剂：每毫升含1g生药量，由上海中医药大学中药学院提供。1.2实验动物:取8只新西兰纯种白色家兔，雄雌各半，3月龄,体重2～3kg。均购自上海中医药大学实验动物中心，普通级，实验动物合格证号为”上海中医药大学实验动物中心SYXK(沪)2004-0005”。形体健康，无病理体征，经检查两眼均属正常，结膜无充血，角膜透明无上皮脱落及损伤，符合动物实验要求。1.3饲养环境及条件:实验动物房屏障系统小鼠室。温度20—25℃，湿度40—70％，以灭菌全价颗粒饲料饲养。单笼,常规饲料喂养,自由饮水。2.实验方法：2.1皮肤一次刺激试验2.1.1用健康新西兰种白色家兔4只，于试验前24h将兔背脊柱两侧毛去掉，去毛范围各为3cm×3cm大小毛(不可损伤表皮)。2.1.2去毛24h后将固本平喘方脂质体雾化吸入剂(约0.5-1m1)喷洒于一侧皮肤，面积为2.5cm×2.5cm，用2层纱布(2.5Cm×2.5cm)和l层玻璃纸覆盖,用无刺激性胶布固定6h,移去敷贴物,用温水清除残留受试样品2.1.3另一侧喷洒蒸馏水作对照；2.1.44-6h后用清水洗涂药处，单次给药皮肤刺激性试验，在去除药物后45分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。2.1.5打分。2.2皮肤多次刺激试验2.2.1用健康新西兰种白色家兔4只，于试验前24h将兔背部脊柱两侧毛去掉，去毛范围各为3cm×3cm上。2.2.2将固本平喘方脂质体雾化吸入剂(约1m1)喷洒于一侧皮肤，另一侧喷洒蒸馏水，每天喷洒1次，连续涂抹7d.每天观察皮肤反应，进行刺激反应评分，按皮肤刺激指数评定刺激强度的级别。2.2.3多次给药皮肤刺激性试验，在每次去除药物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后45分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。2.2.4打分3.观察结果与评估3.1观察方法在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评估。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查。3.2评价标准[中药天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则课题研究组.中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则[S].北京:国家食品药品监督管理局药品审评中心.2005:11-20.]表1.皮肤刺激反应评分标准刺激反应表2.皮肤刺激强度评价标准分值评价0-0.49无刺激性0.5-2.99轻度刺激性3.0-5.99中度刺激性6.0-8.0强刺激性4.结果4.1单次给药皮肤刺激性试验计算每一观察时间点各组受试物皮肤反应积分的平均分值，统计各时段治疗侧和对照侧分值，按表2进行刺激强度评价。根据皮肤刺激强度评价标准，结果属于0-0.49系列，提示该药物一次刺激对皮肤无刺激性。具体结果见表3：表3.皮肤一次刺激试验平均分值4.2多次给药皮肤刺激性试验首先计算每一观察时间点各组积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物积分均值，按表2进行刺激强度评价。统计各时段治疗侧和对照侧分值，根据皮肤刺激强度评价标准，结果属于0-0.49系列，提示该药物多次给药对皮肤无刺激性。详见表4表4.多次给药皮肤刺激性试验平均分试验例6(平喘方脂质体雾化吸入剂的眼刺激试验研究)1.试验材料1.1药物固本平喘方脂质体雾化吸入剂：每毫升含1g生药量，由上海中医药大学中药学院提供。1.2实验动物：取4只新西兰纯种白色家兔，雄雌各半，3月龄,体重2～3kg。均购自上海中医药大学实验动物中心，普通级，实验动物合格证号为”上海中医药大学实验动物中心SYXK(沪)2004-0005”。形体健康，无病理体征，经检查两眼均属正常，结膜无充血，角膜透明无上皮脱落及损伤，符合动物实验要求。1.3饲养环境及条件:实验动物房屏障系统小鼠室。温度20—25℃，湿度40—70％，以灭菌全价颗粒饲料饲养。单笼,常规饲料喂养,自由饮水。2.实验方法：采用同体左右侧自身对比法。试验前24小时内对每只动物的双眼进行检查(包括使用荧光素钠检查)。固本平喘方脂质体雾化吸入剂0.1ml滴入左侧结膜囊内，接触约5～8s后，右侧眼睛滴入蒸馏水作对照。然后轻合眼睑约10秒。不需冲洗眼睛。单次给药眼刺激试验，在给药后0.5、1、2、4、24、48和72小时对眼部进行检查3.观察结果与评估3.1观察方法采用放大镜进行眼刺激反应检查。每次检查，都应记录眼部反应的分值(。除了观察所列出的结膜、角膜和虹膜损伤外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。3.2评估标准按表5的要求，将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜等的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值。按表6判断其刺激程度。表5.眼刺激反应分值标准表6.眼刺激性评价标准分值评价0-3无刺激性4-8轻度刺激性9-12中度刺激性13-16重度刺激性4.结果给药后0.5、1、2、4、24、48和72小时对眼部进行检查，计算每一观察时间点各组受试物反应积分的平均分值，统计各时段治疗侧和对照侧分值，根据眼刺激强度评价标准，属于0-3系列，提示该药物单次給眼对眼无刺激性。结果见表7如下：表7.两组眼刺激反应积分平均值n0.5h1h2h4h24h48h72h治疗侧40.25000000对照侧40.25000000当前第1页1 2 3