本发明公开了一种负载氧氟沙星的胶原蛋白膜抗菌修复材料的制备方法，属于修复材料领域。
背景技术：
当皮肤组织因为外界伤害或疾病等原因遭受损伤时，会引起一系列的生理病理变化，如新陈代谢紊乱，水分、电解质、酸碱平衡失调，蛋白质过度损失、免疫系统失调等，严重的甚至会产生休克，危及到生命。因此，当皮肤损伤后，需要使用皮肤修复材料作为受损皮肤的临时替代物来保护伤口，防止伤口感染和重度脱水，为伤口愈合提供相对湿润的环境，促进组织再生和创面愈合。在众多皮肤修复材料中，自体皮是一种最佳的修复材料，因其不会产生免疫反应且含有各种促进修复愈合的组织细胞和活性生长因子。由于自体皮的来源有限，只能用作小范围的皮肤损伤，所以当大面积皮肤损伤时，需要借助其他皮肤修复材料，如医用伤口敷料、皮肤支架材料、人工皮肤等作为损伤皮肤的临时替代物来实现损伤修复，促进新生组织的再生和伤口的快速愈合。
作为皮肤组织的主要成分之一，胶原具有较好的力学韧性和生物学性能，可以参
与到皮肤细胞的粘附、迁移和增殖等过程，可以在一定程度上改善表皮细胞生存的微环境，同时还能促进皮肤组织中的细胞所需各种氨基酸合成，从而加速受损组织的再生。目前，胶原基材料已经被广泛应用于皮肤修复材料或相关生物敷料的研究中。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题：针对目前天然修复材料类虽然具有很好的生物相容性与生物可降解性，但其力学强度低，降解速度快，功能单一，而合成高分子类修复材料虽然具有很高的机械强度，但其生物相容性不如天然类修复材料好的问题，提供了一种负载氧氟沙星的胶原蛋白膜抗菌修复材料的制备方法，本发明从猪皮中提取高纯度的胶原蛋白，将胶原蛋白制成胶原膜材料，制成的材料类似于人体皮肤，不仅具有良好的生物相容性和保湿性能而且解决了天然修复材料类力学性能差的问题，在膜上负载氧氟沙星，可以降低免疫排斥和炎症发生的机率，移植在受损的皮肤组织，能有效促进创面的快速愈合的功能。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
（1）选取500～600g从猪肉上脱离的新鲜猪皮，用自来水清洗后去除表面杂毛和多余的肉，按质量体积比1:8向猪皮中加入质量分数3%氢氧化钠溶液，浸泡20～30h，浸泡后放入离心分离机中在1800～2200r/min下离心分离，去除上清液，重复浸泡、分离步骤2～4次，将最后得到沉淀物用蒸馏水冲洗至滤液为中性，将猪皮再按质量体积比1:8加入到质量分数15%正丁醇溶液中进行浸泡脱脂20～28h，浸泡后在2200～2400r/min转速下分离，得沉淀物，将沉淀物重复脱脂步骤2～4次，将最终得到的沉淀物用蒸馏水清洗无正丁醇除净，将脱脂后的猪皮放入绞肉机中绞碎，并冷冻干燥；
（2）称取10～20g干燥后的碎猪皮，按质量体积比1:15加入ph为7.2～7.8的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液浸泡3～5h，有悬浮物颗粒产生，去除上层清液，向下层的悬浊液中用1mol/l盐酸溶液调节ph值为6.0～6.5，继续浸泡1～3h，浸泡后向其中加入总质量1.5～2.0%胃蛋白酶，在15～20℃下搅拌10～20h进行酶硝化，搅拌后在7800～8200r/min转速下离心分离10～20min，取上清液，用质量分数15%氢氧化钠溶液调节ph值为7.0，再向上清液中缓慢加入1～3g硫酸铵固体，搅拌15～20min后静置12～14h，静置后离心分离得沉淀物，将沉淀物按固液比1：5加入0.1mol/l醋酸溶液，倒入入透析袋中，用质量分数0.01％乙酸溶液透析20～30h，将透析后的胶原蛋白水溶液低温冷冻干燥，得胶原蛋白固体；
（3）取4～6g干燥后的胶原蛋白，溶于1000～1200ml浓度为0.01mol/l的盐酸溶液中，保持在0～5℃下以10s/滴速度滴加5～8ml浓度1mol/l氯化钠溶液，同时进行搅拌，取清洗后的玻璃载玻片浸泡其中1～2h，取出放入空气风干2～3h，再将载玻片浸泡在质量分数1.5%京尼平交联液中1～2h，取出，自然风干4～5h，用蒸馏水清洗3～5次，再次风干至完全，将干燥后的膜从载玻片上轻轻撕下；
（4）取1～3g氧氟沙星固体溶解在1000～1500ml的纯水中，将上述得到的膜放入溶液中浸泡，并用盐酸调节浸泡液ph值为4.6～5.2，调节后向溶液中加入氧氟沙星质量10～12%的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和氧氟沙星质量10～12%n-羟基琥珀酰亚胺，在0～5℃搅拌反应2～3h，反应后将膜取出，用去离子水冲洗3～5次，自然风干即可。
本发明制得修复材料拉伸强度为85～100mpa，断裂生产率为80～105%；持水率高达93～95%，经过48～72h，持水率仍能达到88～92%，保湿效果好；膜材料的透湿量达到650～810g·m-2·d-1，在温度为35℃和相对湿度为70～75%，膜的水蒸气透过率559.8～698.2g·m-2·d·-1；测1～7天的抗菌性，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为92～99%，对大肠杆菌的抗菌率为90～98%。
本发明的有益效果是：
（1）从猪皮中提取高纯度的胶原蛋白，将胶原蛋白制成胶原膜材料，制成的材料类似于人体皮肤，具有良好的生物相容性和较好光学性能、力学性能和保湿性能；
（2）本发明将膜上负载氧氟沙星，不仅很少引起免疫排斥和降低炎症发生，移植于受损的皮肤组织，能有效促进创面的快速愈合的功能。
具体实施方式
首先选取500～600g从猪肉上脱离的新鲜猪皮，用自来水清洗后去除表面杂毛和多余的肉，按质量体积比1:8向猪皮中加入质量分数3%氢氧化钠溶液，浸泡20～30h，浸泡后放入离心分离机中在1800～2200r/min下离心分离，去除上清液，重复浸泡、分离步骤2～4次，将最后得到沉淀物用蒸馏水冲洗至滤液为中性，将猪皮再按质量体积比1:8加入到质量分数15%正丁醇溶液中进行浸泡脱脂20～28h，浸泡后在2200～2400r/min转速下分离，得沉淀物，将沉淀物重复脱脂步骤2～4次，将最终得到的沉淀物用蒸馏水清洗无正丁醇除净，将脱脂后的猪皮放入绞肉机中绞碎，并冷冻干燥；称取10～20g干燥后的碎猪皮，按质量体积比1:15加入ph为7.2～7.8的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液浸泡3～5h，有悬浮物颗粒产生，去除上层清液，向下层的悬浊液中用1mol/l盐酸溶液调节ph值为6.0～6.5，继续浸泡1～3h，浸泡后向其中加入总质量1.5～2.0%胃蛋白酶，在15～20℃下搅拌10～20h进行酶硝化，搅拌后在7800～8200r/min转速下离心分离10～20min，取上清液，用质量分数15%氢氧化钠溶液调节ph值为7.0，再向上清液中缓慢加入1～3g硫酸铵固体，搅拌15～20min后静置12～14h，静置后离心分离得沉淀物，将沉淀物按固液比1：5加入0.1mol/l醋酸溶液，倒入入透析袋中，用质量分数0.01％乙酸溶液透析20～30h，将透析后的胶原蛋白水溶液低温冷冻干燥，得胶原蛋白固体；取4～6g干燥后的胶原蛋白，溶于1000～1200ml浓度为0.01mol/l的盐酸溶液中，保持在0～5℃下以10s/滴速度滴加5～8ml浓度1mol/l氯化钠溶液，同时进行搅拌，取清洗后的玻璃载玻片浸泡其中1～2h，取出放入空气风干2～3h，再将载玻片浸泡在质量分数1.5%京尼平交联液中1～2h，取出，自然风干4～5h，用蒸馏水清洗3～5次，再次风干至完全，将干燥后的膜从载玻片上轻轻撕下；取1～3g氧氟沙星固体溶解在1000～1500ml的纯水中，将上述得到的膜放入溶液中浸泡，并用盐酸调节浸泡液ph值为4.6～5.2，调节后向溶液中加入氧氟沙星质量10～12%的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和氧氟沙星质量10～12%n-羟基琥珀酰亚胺，在0～5℃搅拌反应2～3h，反应后将膜取出，用去离子水冲洗3～5次，自然风干即可。
实例1
首先选取500g从猪肉上脱离的新鲜猪皮，用自来水清洗后去除表面杂毛和多余的肉，按质量体积比1:8向猪皮中加入质量分数3%氢氧化钠溶液，浸泡20h，浸泡后放入离心分离机中在1800r/min下离心分离，去除上清液，重复浸泡、分离步骤2次，将最后得到沉淀物用蒸馏水冲洗至滤液为中性，将猪皮再按质量体积比1:8加入到质量分数15%正丁醇溶液中进行浸泡脱脂20h，浸泡后在2200r/min转速下分离，得沉淀物，将沉淀物重复脱脂步骤2次，将最终得到的沉淀物用蒸馏水清洗无正丁醇除净，将脱脂后的猪皮放入绞肉机中绞碎，并冷冻干燥；称取10g干燥后的碎猪皮，按质量体积比1:15加入ph为7.2的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液浸泡3h，有悬浮物颗粒产生，去除上层清液，向下层的悬浊液中用1mol/l盐酸溶液调节ph值为6.0，继续浸泡1h，浸泡后向其中加入总质量1.5%胃蛋白酶，在15℃下搅拌10h进行酶硝化，搅拌后在7800r/min转速下离心分离10min，取上清液，用质量分数15%氢氧化钠溶液调节ph值为7.0，再向上清液中缓慢加入1g硫酸铵固体，搅拌15min后静置12h，静置后离心分离得沉淀物，将沉淀物按固液比1：5加入0.1mol/l醋酸溶液，倒入入透析袋中，用质量分数0.01％乙酸溶液透析20h，将透析后的胶原蛋白水溶液低温冷冻干燥，得胶原蛋白固体；取4g干燥后的胶原蛋白，溶于1000ml浓度为0.01mol/l的盐酸溶液中，保持在0℃下以10s/滴速度滴加5ml浓度1mol/l氯化钠溶液，同时进行搅拌，取清洗后的玻璃载玻片浸泡其中1h，取出放入空气风干2h，再将载玻片浸泡在质量分数1.5%京尼平交联液中1h，取出，自然风干4h，用蒸馏水清洗3次，再次风干至完全，将干燥后的膜从载玻片上轻轻撕下；取1g氧氟沙星固体溶解在1000ml的纯水中，将上述得到的膜放入溶液中浸泡，并用盐酸调节浸泡液ph值为4.6，调节后向溶液中加入氧氟沙星质量10%的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和氧氟沙星质量10%n-羟基琥珀酰亚胺，在0℃搅拌反应2h，反应后将膜取出，用去离子水冲洗3次，自然风干即可。
本发明制得修复材料拉伸强度为85mpa，断裂生产率为80%；持水率高达93%，经过48h，持水率仍能达到88%，保湿效果好；膜材料的透湿量达到650g·m-2·d-1，在温度为35℃和相对湿度为70%，膜的水蒸气透过率559.8g·m-2·d-1；测1天的抗菌性，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为999%，对大肠杆菌的抗菌率为98%。
实例2
首先选取550g从猪肉上脱离的新鲜猪皮，用自来水清洗后去除表面杂毛和多余的肉，按质量体积比1:8向猪皮中加入质量分数3%氢氧化钠溶液，浸泡25h，浸泡后放入离心分离机中在2000r/min下离心分离，去除上清液，重复浸泡、分离步骤3次，将最后得到沉淀物用蒸馏水冲洗至滤液为中性，将猪皮再按质量体积比1:8加入到质量分数15%正丁醇溶液中进行浸泡脱脂24h，浸泡后在2300r/min转速下分离，得沉淀物，将沉淀物重复脱脂步骤3次，将最终得到的沉淀物用蒸馏水清洗无正丁醇除净，将脱脂后的猪皮放入绞肉机中绞碎，并冷冻干燥；称取15g干燥后的碎猪皮，按质量体积比1:15加入ph为7.6的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液浸泡4h，有悬浮物颗粒产生，去除上层清液，向下层的悬浊液中用1mol/l盐酸溶液调节ph值为6.3，继续浸泡2h，浸泡后向其中加入总质量1.8%胃蛋白酶，在18℃下搅拌15h进行酶硝化，搅拌后在8000r/min转速下离心分离15min，取上清液，用质量分数15%氢氧化钠溶液调节ph值为7.0，再向上清液中缓慢加入2g硫酸铵固体，搅拌18min后静置13h，静置后离心分离得沉淀物，将沉淀物按固液比1：5加入0.1mol/l醋酸溶液，倒入入透析袋中，用质量分数0.01％乙酸溶液透析25h，将透析后的胶原蛋白水溶液低温冷冻干燥，得胶原蛋白固体；取5g干燥后的胶原蛋白，溶于1100ml浓度为0.01mol/l的盐酸溶液中，保持在3℃下以10s/滴速度滴加7ml浓度1mol/l氯化钠溶液，同时进行搅拌，取清洗后的玻璃载玻片浸泡其中1.5h，取出放入空气风干2.5h，再将载玻片浸泡在质量分数1.5%京尼平交联液中1.5h，取出，自然风干4.5h，用蒸馏水清洗4次，再次风干至完全，将干燥后的膜从载玻片上轻轻撕下；取2g氧氟沙星固体溶解在1250ml的纯水中，将上述得到的膜放入溶液中浸泡，并用盐酸调节浸泡液ph值为5.0，调节后向溶液中加入氧氟沙星质量11%的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和氧氟沙星质量11%n-羟基琥珀酰亚胺，在3℃搅拌反应2.5h，反应后将膜取出，用去离子水冲洗4次，自然风干即可。
本发明制得修复材料拉伸强度为94mpa，断裂生产率为95%；持水率高达94%，经过60h，持水率仍能达到90%，保湿效果好；膜材料的透湿量达到687g·m-2·d-1，在温度为35℃和相对湿度为73%，膜的水蒸气透过率635.8g·m-2·d·-1；测5天的抗菌性，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为96%，对大肠杆菌的抗菌率为94%。
实例3
首先选取600g从猪肉上脱离的新鲜猪皮，用自来水清洗后去除表面杂毛和多余的肉，按质量体积比1:8向猪皮中加入质量分数3%氢氧化钠溶液，浸泡30h，浸泡后放入离心分离机中在2200r/min下离心分离，去除上清液，重复浸泡、分离步骤4次，将最后得到沉淀物用蒸馏水冲洗至滤液为中性，将猪皮再按质量体积比1:8加入到质量分数15%正丁醇溶液中进行浸泡脱脂28h，浸泡后在2400r/min转速下分离，得沉淀物，将沉淀物重复脱脂步骤4次，将最终得到的沉淀物用蒸馏水清洗无正丁醇除净，将脱脂后的猪皮放入绞肉机中绞碎，并冷冻干燥；称取20g干燥后的碎猪皮，按质量体积比1:15加入ph为7.8的三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液浸泡5h，有悬浮物颗粒产生，去除上层清液，向下层的悬浊液中用1mol/l盐酸溶液调节ph值为6.5，继续浸泡3h，浸泡后向其中加入总质量2.0%胃蛋白酶，在20℃下搅拌20h进行酶硝化，搅拌后在8200r/min转速下离心分离20min，取上清液，用质量分数15%氢氧化钠溶液调节ph值为7.0，再向上清液中缓慢加入3g硫酸铵固体，搅拌20min后静置14h，静置后离心分离得沉淀物，将沉淀物按固液比1：5加入0.1mol/l醋酸溶液，倒入入透析袋中，用质量分数0.01％乙酸溶液透析30h，将透析后的胶原蛋白水溶液低温冷冻干燥，得胶原蛋白固体；取6g干燥后的胶原蛋白，溶于1200ml浓度为0.01mol/l的盐酸溶液中，保持在5℃下以10s/滴速度滴加8ml浓度1mol/l氯化钠溶液，同时进行搅拌，取清洗后的玻璃载玻片浸泡其中2h，取出放入空气风干3h，再将载玻片浸泡在质量分数1.5%京尼平交联液中2h，取出，自然风干5h，用蒸馏水清洗5次，再次风干至完全，将干燥后的膜从载玻片上轻轻撕下；取3g氧氟沙星固体溶解在1500ml的纯水中，将上述得到的膜放入溶液中浸泡，并用盐酸调节浸泡液ph值为5.2，调节后向溶液中加入氧氟沙星质量12%的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和氧氟沙星质量12%n-羟基琥珀酰亚胺，在5℃搅拌反应3h，反应后将膜取出，用去离子水冲洗5次，自然风干即可。
本发明制得修复材料拉伸强度为100mpa，断裂生产率为105%；持水率高达95%，经过72h，持水率仍能达到92%，保湿效果好；膜材料的透湿量达到810g·m-2·d-1，在温度为35℃和相对湿度为75%，膜的水蒸气透过率698.2g·m-2·d·-1；测7天的抗菌性，对金黄色葡萄球菌的抗菌率为92%，对大肠杆菌的抗菌率为90%。