包含促红细胞生成素和支化聚合物结构的缀合物的制作方法

本发明涉及生物技术、生物科学和制药工业领域，特别地涉及对分子进行修饰以便改善其药物代谢动力学，其中增加其在血液中的半衰期和其生物学活性。现有技术近年来，生物分子用于在人类中的治疗用途的使用有所增加，这主要是由于：(1)发现了新的蛋白质和肽分子，(2)对于体内作用机制有了更好的理解，(3)改善了蛋白质的表达系统和肽的合成，和(4)改善了制剂或分子修饰技术，其使得能够改善药效动力学和药物代谢动力学特性。在药物的修饰释放领域中的技术发展已经使得能够引入许多改变可注射药物的释放的系统，以便改善治疗剂的药效动力学和药物代谢动力学特性。新的药物释放系统可以通过制剂的变化(例如，持续释放产品或脂质体)或者通过向药物分子进行添加(例如，PEG化，其仅为将药物共价结合至一个或多个聚乙二醇(PEG)分子)来产生。新的释放形式导致半衰期的增加、副作用的减少、药物功效的提高以及患者的更好的生活质量。持续释放系统以受控的且预定的方式释放药物，并且尤其适合于其中避免在血浆中的浓度大幅波动是重要的那些药物。由于保护了对于降解敏感的蛋白质以及经延长或经修饰的释放，已经广泛地研究了通过使用生物可降解的微球来进行的分子的全身性释放(Sinha，V.R.和Trehan，A.(2003).Biodegradablemicrospheresasproteindelivery，J.ControlledRelease，90(3)：261-280)。PEG化提供了一种用于修饰治疗性蛋白质以使生物分子的许多药理学限制最小化的方法。例如，在血液中的半衰期由于数个原因而增加，其中包括：聚合物残基可以阻止蛋白酶的攻击以及该药物被免疫系统识别，以及所述缀合物的相对于天然蛋白质而言显著更大的流体动力学体积使得肾滤过明显地减少。虽然在许多情况下蛋白质的体外生物学活性受到PEG化影响，但是在血液中的寿命的重大增加使得其治疗作用是更有效的(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。PEG化的另一个益处为物理稳定性的增加，这是由于其在空间上阻断由疏水相互作用所诱导的降解途径，并且产生减少在所述蛋白质的热不稳定性中所牵涉的分子间相互作用的非特异性空间障碍。物理稳定性的增加使得能够获得更稳定的制剂(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。由于第二代经活化的PEG的出现，能够拥有允许更有选择性的PEG化的基团(例如：优先结合蛋白质的N-末端的醛基团)和支化结构(RobertsM.J.，BentleyM.D.，HarrisJ.M.(2002)ChemistryforpeptideandproteinPEGylation.Adv.DrugDeliv.Reviews.54：459-476)。所开发出的支化PEG包括具有两个分枝的单官能PEG(专利号US5,932,462)、具有四个分枝的四官能PEG和具有八个分枝的八官能PEG。关于治疗性蛋白质的缀合，更有用的经活化的PEG为单官能PEG，因为其避免该蛋白质与该PEG聚合物之间的交联。支化PEG还具有伞型效应，其允许更好的对于蛋白质表面的保护。具有两个分枝的单官能PEG使得能够获得与干扰素α-2a的缀合物，其显示出在临床上比天然蛋白质更好的结果(RajenderReddyK.，ModiM.W.，PedderS.(2002).Useofpeginterferonalfa-2a(40KD)(Pegasys)forthetreatmentofhepatitisC.Adv.DrugDeliv.Reviews.54：571-586)。存在有关于许多其中应用了不同的修饰释放技术的蛋白质的报道，其中包括重组的人促红细胞生成素(EPO)(rhEPO)。EPO为具有165个氨基酸的糖蛋白。取决于其糖基化程度，通过使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(缩写为SDS-PAGE)而估计的它的分子量在27kDa和39kDa之间变化(Mikaye，T.等人，(1977).PurificationofHumanerythropoietin.J.Biol.Chem.252：5558-5564)。在调查研究中已证明，通过撤除低氧刺激，在血液中EPO的信使核糖核酸(mRNA)快速减少，其中可能在3小时时无法检测，这表明其半衰期是短的(Lacombe，C.等人，(1988)Peritubularcellsarethesiteoferythropoietinsynthesisinthemurinehypoxickidney.J.Clin.Invest.81：620-623；Koury，S.T.等人，(1989)Quantitationoferythropoietinproducingcellsinkidneysofmicebyinsituhybridation：Correlationwithhematocrit，renalerythropoietinmRNAandserumerythropoietinconcentration.Blood74：645-651)。据估计，EPO在血浆中的半衰期在4小时和13小时之间变化；当与其他具有治疗用途的分子相比较时，该时间是非常短的。这使得需要有规律地使用该激素的患者必须频繁地注射以维持接近正常水平的红细胞水平(Spivak，J.L.1992.Themechanismofactionoferythropoietin：Erythroidcellresponse.J.W.Fisher(Ed.)BiochemicalPharmaeologyofBloodandBlood-FormingOrgans.Springer-VerlagBerlin.HandbookofExperimentalPharmacology.101：49-114；Jelkmann，W.(1986).RenalErythropoietin：PropertiesandProduction.Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.104：139-205)。为了增加rhEPO的半衰期，对该分子进行了突变以增加N-糖基化位点(Burke，Paul(2003).Deviceforthesustainedreleaseofaggregation-stabilized，biologicallyactiveagent.美国专利申请号20030133979)，它被包囊在微球(MorlockM.等人，(1998).ErythropoietinloadedmicrospherespreparedfrombiodegradableLPLG-PEO-LPLGtriblockcopolymers：proteinstabilizationandin-vitroreleaseproperties.JControlRelease4，56(1-3)：105-115)和脂质体(MoriyaH.等人，(1997).Pharmacokineticandpharmacologicalprofilesoffreeandliposomalrecombinanthumanerythropoietinafterintravenousandsubcutaneousadministrationsinrats.PharmRes.14(11)：1621-1628)中，并且已经报道获得了rhEPO的二聚体，这旨在增加其生物学活性(BrunoD.等人，(2001).Dimericerythropoietinfusionproteinwithenhancederythropoieticactivityinvitroandinvivo.Blood，Vol.97，No.12，3776-3782)。在临床中具有最多结果的修饰之一为rhEPO与聚合物的化学缀合(JollingK.等人，(2005).Mixed-EffectsModellingoftheInterspeciesPharmacokineticScalingofPegylatedHumanErythropoietin.EurJPharmSci；24：465-475)。在该经PEG化的rhEPO的开发中，所遇到的困难为缀合过程的低的产率，这是由于形成了单PEG化种类和二PEG化种类，其中后者是该过程的污染物。由于所有上面所陈述的内容，仍然令人感兴趣的是获得新的EPO与聚合物的缀合物，其提供相对于未修饰的分子而言的治疗优势。发明描述本发明通过提供这样的缀合物而解决了上面所提出的问题，所述缀合物包含促红细胞生成素(EPO)和含有两个单甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不对称支化聚合物结构，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之间，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之间。以这种方式，本发明提供了包含单官能支化PEG结构的缀合物，所述单官能支化PEG结构具有与由Papadimitriou所使用的(专利号US7,202,208)类似的分子大小，但其采用具有二条有着不同分子量的链的PEG结构。出人意料地，该备选方案给该药物提供了新的优势。在本发明的缀合物中，所述具有两个分枝的PEG的聚合物结构的总分子量在27kDa和37kDa之间。在本发明的一个实施方案中，mPEG1的分子量为12kDa，并且mPEG2的分子量为20kDa。使用具有所示分子量的不对称的支化PEG链(而非线性PEG链)使得能够减少二PEG化的污染物的形成，并且出人意料地，显著地增加该分子的半衰期以及其物理化学稳定性。另一个预料不到的结果是，所述具有该不对称支化单官能PEG的经PEG化的分子的生物学活性保持完整。在文献中已经广泛报道了具有PEG化的生物分子的生物学活性的丧失(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003).Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。具有两个不对称分枝的单官能PEG通过将两个具有不同分子大小的线性PEG链结合在核心上来获得。其他作者使用了类似的过程，其中取得良好的结果(专利号US5,932,462)。为了能够将两个线性PEG链结合至核心，需要它们具有活性基团。该基团可以从在现有技术中已知的各种基团中选择。例如，该活性基团尤其可以为：琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基碳酸酯、对-硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯。在本发明中优选的线性PEG为用琥珀酰亚胺基碳酸酯进行活化的那种。这是由于两个主要原因：a)它与氨基基团之间的反应的良好的产率，和b)获得该经官能化的PEG的工艺过程是容易的。获得该经官能化的PEG的工艺过程是在该
技术领域：
中工作的人员所已知的(MironT.，WilchekM.(1993).ASimplifiedMethodforthePreparationofSuceinimidylCarbonatePolyethyleneGlycolforCouplingtoProteins.BioconjugateChem.4：568-569)。一旦该线性PEG被活化，则随后使其与被选择作为核心的分子进行反应。在本发明的一个优选的实施方案中，所述核心为L-赖氨酸，因为它是生物相容性分子，其具有可以用于稍后进行活化的两个游离的氨基基团和一个羧基基团。因此，在本发明的一个实施方案中，将EPO缀合至如下所示的不对称支化聚合物结构：在一个特别的实施例中，在形成为该缀合物的一部分的所述聚合物结构中，mPEG1的分子量为12kDa且mPEG2的分子量为20kDa，或者mPEG1的分子量为20kDa且mPEG2的分子量为12kDa。该具有两个不对称分枝的衍生物可以通过使用色谱法来进行纯化，然后用不同的反应性基团来进行活化以用于与生物分子进行缀合。任何用于活化其他PEG结构的官能团均可以用于在本发明中所描述的不对称支化PEG。这些官能团的例子尤其为：N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基碳酸酯、不同类型的醛、马来酰亚胺。另一种类型的允许该结构结合至蛋白质的官能团为螯合基团，例如次氮基三乙酸酯，其可以借助于过渡金属而缀合至存在于肽主链中的组氨酸。待使用的反应性基团的选择取决于想要在其上结合PEG的蛋白质的残基。在由Huang所提交的专利申请(EP1479711A1)的实施例中，显示了支化的PEG结构，其在所述分枝的每一个中具有不同的分子量；但是所述分枝的分子大小比本发明的小。在专利申请号EP1479711A1中，发明人提出，相对于未修饰的药物的生物学活性而言，该缀合物的生物学活性降低。然而，在本发明中，出人意料地，EPO与总分子量在27kDa和37kDa之间的具有两个不对称分枝的单官能PEG的缀合物的生物学活性与未修饰的EPO的生物学活性类似。另一方面，在本发明中证明，根据由Huang所提交的专利申请的具有两个有着较低分子量的分枝的PEG结构的半衰期短于本发明的EPO与具有两个分别为12kDa和20kDa的分枝的PEG的缀合物的半衰期。在本发明中所获得的该结果是出人意料的。用该包含不对称聚合物结构(PEG2，32K)的缀合物，实现了不限制生物学活性的所述分子的空间分布，通过减少多PEG化产物的形成而改善了缀合反应，并且显著地改善了药物代谢动力学参数。这使得能够减少在需要治疗的人中的治疗剂量。在本发明中用于获得具有两个不对称分枝的PEG结构的基础原料为12kDa的mPEG(12KPEG)和20kDa的mPEG(20KPEG)。这些mPEG的分子量具有由制造商所确立的范围，因为PEG为多分散聚合物。例如，根据制造商之一的说明书，多分散性应当低于1.1％。在该情况下，由该制造商所报告的分子量范围对于12KPEG将为12.0±1.2kDa；20KPEG的分子量范围将为20.0±2.0kDa。为了测定每批PEG起始材料之间的分子量的该差异是否影响药物代谢动力学的结果，用具有相应于所述说明书的极值的分子量的PEG批次来进行实验(实施例11)。取分子量为11kDa的12KPEG和分子量为18kDa的20KPEG用于形成EPO与总分子量为29kDa的具有两个分枝的PEG结构的缀合物(PEG2，29K-EPO)。还取分子量为13kDa的12KPEG和分子量为22kDa的20KPEG用于形成EPO与总分子量为35kDa的具有两个分枝的PEG结构的缀合物(PEG2，35K-EPO)。结果显示，当使用不同起始批次的12KPEG和20KPEG时，药物代谢动力学参数是类似的。因此，由PEG2，29K-EPO和PEG2，35K-EPO的结构所形成的缀合物被认为与由具有由制造商所指明的理论重量的结构所形成的那些，即EPO与具有两个分枝(其中之一为12kDa，和另一为20kDa)的PEG的缀合物(PEG2，32K-EPO)，基本上相同。蛋白质与经活化的PEG的缀合在合适的缓冲液中进行。除了其他因素外，缓冲剂的特征尤其取决于该聚合物的官能团以及缀合的目的。例如，如果希望通过游离的氨基基团与被官能化为N-羟基琥珀酰亚胺酯的PEG进行缀合，那么可以根据缀合反应的pH在一定程度上预测缀合位点。在8.0和9.0之间的pH有利于通过赖氨酸的ε-氨基基团来进行缀合。一旦获得缀合物，就使用各种技术来对其进行表征。分析所述缀合物的化学、物理和生物学特性，以实现对于经纯化的缀合物的可能的最完全的表征。例如，所述缀合物的浓度通常可以通过紫外光谱学(在280nm处的吸光度)来测定，因为PEG残基实际上不影响该蛋白质的摩尔消光系数。经纯化的产物的纯度优选地通过SDS-PAGE来测定，因为色谱法例如凝胶过滤色谱法对于相应于目的缀合物的信号和相应于污染物的信号的区分很差。其他物理化学特性可以通过本领域技术人员已知的常用操作程序来进行研究。在本发明的背景下，术语“促红细胞生成素(EPO)”是指保持了其生物学活性的EPO分子的任何变体；例如，截短的分子。所述EPO可以通过重组脱氧核糖核酸(DNA)技术来获得，其中使用本领域技术人员已知的表达和纯化系统。因此，在本发明的一个实施方案中，所述缀合物包含rhEPO。本发明的目标缀合物还包含通过上面所描述的方法在经由现有技术的任何操作程序(例如，氨基酸置换)进行修饰后而获得的任何EPO变体。本发明的目标还为药物组合物，其包含任何在本文中所公开的PEG-EPO缀合物和药学上可接受的赋形剂。本发明的另一个方面为用于获得经PEG化的EPO的方法，其特征在于，将所述蛋白质缀合至含有两个mPEG分枝的不对称支化聚合物结构，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之间，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之间。通过本发明的方法，引起在施用了所述蛋白质的哺乳动物的血液中所述EPO的半衰期增加，如果与未与PEG进行缀合的EPO的半衰期相比较。因此，本发明提供了用于改善所述蛋白质的药物代谢动力学参数的方法，以便减少施用给有此需要的受试者的剂量。在本发明的背景下，EPO的药物代谢动力学参数的改善是指所述蛋白质的半衰期和/或平均停留时间的增加。以该方式，本发明公开了化学修饰EPO分子的方法，以便增加所述分子的半衰期，其特征在于，将所述蛋白质缀合至含有两个mPEG分枝的不对称支化聚合物结构，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之间，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之间。在本发明的一个实施方案中，在所述不对称支化聚合物结构中所述mPEG分枝之一的分子量为12kDa，和另一mPEG分枝的分子量为20kDa。在本发明的一个实施方案中，在本发明的方法中，缀合至EPO的不对称支化聚合物结构如下所示：在本发明方法的一个优选的实施方案中，在缀合至EPO的不对称支化聚合物结构中，mPEG1的分子量为12kDa且mPEG2的分子量为20kDa，或者mPEG1的分子量为20kDa且mPEG2的分子量为12kDa。在一个更优选的实施方案中，在本发明的方法中，所述EPO为rhEPO。附图简述图1.EPO与PEG2，32K的缀合反应产物的具有双重染色(考马斯亮蓝和碘)的SDS-PAGE的结果。样品1相应于EPO的阳性对照，和样品2相应于EPO与PEG2，32K的缀合反应产物。图2.EPO与PEG2，40K的缀合反应产物的具有双重染色(考马斯亮蓝和碘)的SDS-PAGE的结果。样品1相应于EPO的阳性对照，和样品2相应于EPO与PEG2，40K的缀合反应产物。图3.通过使用凝胶过滤色谱法而获得的用于评价不同PEG-EPO缀合物的色谱图。图4.通过红细胞正常的小鼠的方法测定的天然的EPO和单PEG化的EPO的体内生物学活性。图5.通过胰蛋白酶降解测定法而获得的关于PEG2，32K-EPO缀合物、PEG2，40K-EPO缀合物和未修饰的EPO的结果。呈现了通过SDS-PAGE进行追踪的降解动力学。图6.通过红细胞正常的小鼠的方法测定的不同PEG-EPO缀合物和未修饰的EPO的生物学活性。实施方式的详细描述/实施例实施例1.被活化为N-羟基琥珀酰亚胺酯的PEG的获得mPEG20K-OH的活化反应将50g未活化的分子量为20kDa的mPEG(mPEG20K-OH)在450mL甲苯中共沸干燥3小时。在该时间过后，抽取出200mL溶剂，并让溶液冷却直至达到环境温度。然后，添加60mL无水二氯甲烷(DCM)作为助溶剂。称取4.9g二琥珀酰亚胺基碳酸酯，并将其溶解在40mL二甲基甲酰胺中。将上述溶液加入到包含mPEG20K-OH的烧瓶中。称取2.5g二甲氨基吡啶，并将其溶解在20mLDCM中。将上述溶液加入到包含mPEG20K-OH的烧瓶中，并开始搅拌。让其在环境温度下反应过夜。通过使用玻璃纤维膜来对反应混合物进行过滤，以去除固体产物。用1.5L无水乙醚使滤液沉淀，并在真空中进行过滤。在真空中收集沉淀物，在高度真空中干燥4小时，并贮存于-20℃。实现以PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯(PEG20K-SC)的形式回收了初始的mPEG20K-OH质量的96％，其中活化度为96.0±0.8％。mPEG12K-OH的活化反应依照用于mPEG20K-OH的活化反应的相同操作程序，但在本情况下，使用未活化的分子量为12kDa的mPEG(mPEG12K-OH)作为起始原料。L-赖氨酸与PEG20K-SC和PEG12K-SC的反应称取9.1gL-赖氨酸，并将其溶解在30mL的0.1M硼酸溶液(pH8.0)中。添加20g的PEG20K-SC和15mL的L-赖氨酸在硼酸中的溶液。使溶液在搅拌下保持12小时。然后，用300mL蒸馏水稀释反应混合物，并且用盐酸溶液将混合物的pH调整至3.5。将混合物转移至其中加入了100mLDCM的分液漏斗中。手动搅拌，并抽取出下面的相(有机相)。共进行5次萃取。将20g硫酸钠加入到包含有机相的烧瓶中，并手动搅拌直至该相完全清澈。通过使用玻璃纤维膜，在真空中进行过滤。尽最大可能地，将滤液在旋转蒸发器中进行浓缩。添加500mL乙醚并手动搅拌，以使产物沉淀。在真空中进行过滤，并且在旋转蒸发器中将产物(20K的单PEG化的L-赖氨酸)在真空中干燥1小时。在第二个反应步骤中，将9gPEG12K-SC添加至15g20K的单PEG化的L-赖氨酸。将反应物溶解在215mLDCM中，并添加0.14mL三乙胺。通过使用玻璃纤维膜，将反应混合物在真空中进行过滤。尽最大可能地，将滤液在旋转蒸发器中进行浓缩。添加300mL乙醚并手动搅拌2分钟，以使产物沉淀。在真空中进行过滤，并且在旋转蒸发器中将所获得的产物(具有两个不对称分枝的PEG，所述不对称分枝之一为12kDa，和另一为20kDa(PEG2，32K-COOH))在真空中干燥1小时。该过程的总产率大于70％。PEG2，32K-COOH的纯化在高度为80cm的DEAE-Sepharose柱中进行PEG2，32K-COOH的纯化，并且采用40mL/分钟的体积流量。预先用4.5L的0.2M氢氧化钠溶液对凝胶进行卫生处理。将柱用50mM硼酸溶液(pH9.0)进行平衡。然后，将柱用5L蒸馏水进行洗涤。施加溶解在水中的PEG2，32K-COOH样品，直至达到40μS/cm的电导率，其大于水的电导率。在施加样品之后，将柱用3L纯化水进行洗涤。用5L的10mM氯化钠溶液来进行样品的洗脱。收集500mL的级分。然后，用3L的1M氯化钠溶液使柱再生。该过程的总回收率大于90％，其中纯度大于95％。被活化为N-羟基琥珀酰亚胺酯的支化PEG(PEG2，32K-NHS)的获得将1gPEG2，32K-COOH溶解在DCM中。添加0.01gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.02g二环己基碳二亚胺。使反应混合物在搅拌下保持12小时。然后，用5mLDCM进行稀释，并且通过玻璃纤维膜进行过滤。将滤液在旋转蒸发器中进行浓缩，并添加400mL乙醚以使产物沉淀。将混合物在真空中进行过滤，并收集固体产物(PEG2，32K-NHS)，在旋转蒸发器中将该固体产物在真空中干燥1小时。达到大于95％的活化度，以及大于90％的初始聚合物质量的回收。实施例2.与PEG2，32K-NHS相缀合的EPO的获得缀合反应将6克PEG2，32K-NHS添加到在50mM硼酸盐溶液(pH8.0)中以5mg/mL的初始浓度包含1grhEPO的溶液中。使反应物体系在4℃下保持2小时，其中缓慢地进行搅拌。通过用50mM硼酸(pH8.0)进行稀释直至0.9mg/mL的最终蛋白质浓度来终止反应。如在图1中所显示的，通过经SDS-PAGE而获得的凝胶的光密度分析法来测定反应产率。总回收率大于40％，其中多PEG化的产物小于3％。单PEG化的EPO的纯化为了将rhEPO与PEG的缀合反应的产物分开，即将单PEG化的EPO与游离的EPO和二PEG化的EPO分开，设计了通过阴离子交换色谱法的纯化方案。通过使用高度为12cm的装填有Q-Sepharose的柱来进行该分开过程。预先用22mL的0.2M氢氧化钠溶液对凝胶进行卫生处理。通过33mL纯化水，随后通过33mL的50mM硼酸(pH8.0)的平衡溶液。施加在该平衡溶液中进行稀释直至0.9mg/mL的浓度的、来自缀合反应的样品。通过使用氯化钠浓度从0.175M至0.5M渐增的相同的平衡缓冲液来顺次进行包含EPO与PEG2，32K-NHS的缀合物(PEG2，32K-EPO)的样品的洗脱。体积流量为1.2mL/分钟，和负载量为0.58mg蛋白质/mL凝胶。该过程的回收率为40％的单PEG化的EPO，和纯度为97％。实施例3.被活化为N-羟基琥珀酰亚胺酯的支化PEG(PEG2，40K-NHS)的获得为了获得PEG2，40K-NHS，依照在实施例1中所描述的操作程序，但在与赖氨酸的反应的第二个步骤中使用PEG20K-SC。实现大于50％的总产率，其中活化度大于90％。实施例4.与PEG2，40K-NHS相缀合的EPO的获得缀合反应将6克PEG2，40K-NHS添加到在50mM硼酸盐缓冲溶液(pH8.0)中以5mg/mL的初始浓度包含1grhEPO的溶液中。使反应物体系在4℃下保持2小时，其中缓慢地进行搅拌。通过用50mM硼酸(pH8.0)进行稀释直至0.9mg/mL的最终蛋白质浓度来终止反应。如在图2中所显示的，通过经SDS-PAGE而获得的凝胶的光密度分析法来测定反应产率。总回收率大于40％，其中多PEG化的产物小于1％。单PEG化的EPO的纯化为了将EPO与PEG的缀合反应的产物分开，即将单PEG化的EPO与游离的EPO和二PEG化的EPO分开，设计了通过阴离子交换色谱法的纯化方案。通过使用高度为12cm的装填有Q-Sepharose的柱来进行该分开过程。预先用22mL的0.2M氢氧化钠溶液对凝胶进行卫生处理。通过33mL蒸馏水，随后通过33mL的50mM硼酸(pH8.0)的平衡溶液。施加在该平衡溶液中进行稀释直至0.9mg/mL的浓度的、来自缀合反应的样品。通过使用氯化钠浓度从0.175M至0.5M渐增的相同的平衡缓冲液来顺次进行包含EPO与PEG2，40K-NHS的缀合物(PEG2，40K-EPO)的样品的洗脱。体积流量为1.2mL/分钟，和负载量为0.58mg蛋白质/mL凝胶。该过程的回收率为40％，并且获得97％的纯度。实施例5.经PEG化的EPO的物理化学表征缀合物浓度的测定通过在分光光度计中测量在280nm处的吸光度来进行测定。通过使用0.743的关于EPO的摩尔消光系数来进行蛋白质浓度的计算。通过凝胶过滤色谱法来进行表征通过使用高效液相色谱法(HPLC)的泵和具有226nm滤波器的紫外线检测器来进行色谱法分开。施加质量为100μg蛋白质。用Superdex-200基质来进行所述色谱法。分析经PEG化的EPO的两种变化形式(PEG2，32K-EPO和PEG2，40K-EPO)和未修饰的EPO。在图3中观察到在对于每种变化形式所估计的分子量和所得的保留时间之间存在的对应关系。以较短的保留时间洗脱出PEG2，40K-EPO缀合物，因为其具有较大的分子大小；随后洗脱出PEG2，32K-EPO缀合物；和最后洗脱出未修饰的EPO。实施例6.PEG2，32K-EPO缀合物的生物学表征通过红细胞正常的小鼠的方法来进行经PEG化的EPO的效力的测定。按照三只动物/组，用0.2mL的不同稀释度(300、450和600IU/mL，其相当于3、4.5和6μg/小鼠)的PEG2，40K-EPO和PEG2，32K-EPO样品、参考材料(作为阳性对照)以及阴性对照(仅稀释剂)通过皮下途径对处女雌性B6D2F1系小鼠(16-18g)进行接种。另外还使用两只动物，向其接种50mM硼酸盐缓冲溶液(pH8.0)，以便评价其毒性。在接种72小时后，通过眶后途径抽取每只动物的血液样品，并放置在包含4μL肝素钠(5000IU)的小瓶中。取40μL外周血，并将其与120μL由0.3mM亚甲蓝、1.29mM柠檬酸钠、5mL生理盐水和10mL蒸馏水构成的溶液相混合，并且将其在37℃的水浴中温育1小时。之后，通过用由0.08mMEDTA四钠、0.15mM氯化铵和9.98mM碳酸氢钠构成的裂解溶液进行处理来实施选择性溶血6分钟。通过用生理盐水进行过度稀释来终止红细胞裂解，并在Neubauer计数池中以目视方式对网织红细胞进行计数。通过使用模式的和未知形式的平行线的随机设计来进行数据处理和效力计算，以在α＝0.05的显著性水平下检测线性和平行性的有效性。所获得的值必须符合欧洲药典的规定，所述欧洲药典规定，基于该假设而计算出的效力的关联性值(以百分比表示)不应当低于80％，也不应当高于125％，并且所计算出的效力的置信界限应当位于在64％和156％之间的范围内。在图4中观察到从网织红细胞计数实验中直接获得的数据的图，在所述实验中施用渐增的量(以“IU的效力”测量的)的EPO。应用用于比较平均值的Tukey-Kramer统计学检验，以便分析体内活性值。所述数据的统计学分析证明，在所述值之间没有显著差异(P＜0.05)。在经PEG化的EPO和用作阳性对照的未修饰的EPO之间的生物学活性的差异位于该测定法的变化范围之内(±50％)。重要的是强调，用于实施该测定法的剂量为300、450和600IU的效力。这些是已被确立用于检测天然EPO的生物学活性的剂量，然而使用Amgen公司的产品(MirceraTM，其为缀合至分子量为30kDa的线性聚合物结构的EPO(PEG1，30K-EPO))来进行的测定法所需要的最小剂量为6000IU的效力。但是，在本发明中所进行的测定法之中，以低20倍的剂量，检测到了经PEG化的EPO的体内生物学活性。实施例7.对于蛋白酶降解的抗性为了验证不同PEG-EPO分子对于蛋白酶降解的抗性，进行了体外实验，在该体外实验中用胰蛋白酶消化经PEG化的EPO和天然蛋白质(作为对照)。EPO的所述两种经PEG化的变化形式均显示出比天然EPO更强的对于蛋白酶降解的抗性。在图5中显示了用作对照的EPO以及两种经PEG化的变化形式即PEG2，32K-EPO和PEG2，40K-EPO的降解动力学结果。可以观察到，经PEG化的EPO的所述两种变化形式呈现出比天然EPO更强的对于蛋白酶降解的抗性。实施例8.PEG2，32K-EPO缀合物的药物代谢动力学通过比较未修饰的EPO、PEG2，32K-EPO缀合物、PEG2，40K-EPO缀合物和PEG1，30K-EPO缀合物来进行药物代谢动力学研究。使用重2kg的新西兰品系的兔子。半衰期(t1/2)、曲线下面积(缩写为AUC)和平均停留时间(缩写为MRT)的结果显示在表1中。表1.EPO、PEG2，32K-EPO缀合物、PEG2，40K-EPO缀合物和PEG1，30K-EPO缀合物的比较药物代谢动力学。可以看出，所有经PEG化的EPO具有比未修饰的EPO更长的半衰期。PEG2，32K-EPO缀合物的半衰期比用PEG1，30K-EPO所获得的半衰期长得多(2.4倍)。考虑到这两种缀合物具有非常相似的分子大小，该结果是出人意料的。该不对称支化分子还具有比PEG2，40K-EPO缀合物(其也是支化的并且具有更大的分子量)更长的半衰期，这也未预料到。实施例9.不同EPO缀合物的药物代谢动力学结果的比较通过比较下列缀合物来进行药物代谢动力学研究：PEG2，32K-EPO缀合物，其具有一个分子量为12kDa的分枝和另一个分子量为20kDa的分枝；缀合至不对称PEG结构的EPO，所述不对称PEG结构具有一个分子量为5kDa的分枝和另一个分子量为7kDa的分枝(PEG2，12K-EPO)；EPO与对称结构的缀合物，所述对称结构具有两个各为7kDa的分枝(PEG2，14K-EPO)；以及EPO与分子量为12kDa的线性PEG的缀合物(PEG1，12K-EPO)。为了实施该研究，以与PEG2，32K-EPO缀合物类似的方式来获得PEG2，12K-EPO缀合物，但使用具有更低分子量的mPEG。以与PEG2，40K-EPO缀合物类似的方式来获得PEG2，14K-EPO缀合物，但使用具有更低分子量的mPEG。通过如下方式来获得PEG1.12K-EPO缀合物：如在实施例1的开始部分所描述的，活化分子量为12kDa的mPEG；随后，如在实施例2中所描述的，进行与rhEPO的缀合。为了进行比较，使用重2kg的新西兰品系的兔子。结果显示在表2中。本发明的缀合物(PEG2，32K-EPO)显示出具有比其余所分析的缀合物更长的半衰期。表2.不同EPO缀合物的药物代谢动力学参数。实施例10.不同EPO缀合物的生物学活性的比较以与在实施例6中所描述的类似的方式来测量所述缀合物的生物学活性。比较对于下列缀合物所获得的结果：(1)PEG2，32K-EPO；(2)PEG2，12K-EPO；(3)PEG2，14K-EPO；和(4)PEG1，12K-EPO。作为对照，使用未修饰的rhEPO。在图6中可以观察到，本发明的缀合物(PEG2，32K-EPO)保持了未修饰的蛋白质的生物学活性，这与其余所分析的缀合物不同，在其余所分析的缀合物中生物学活性在PEG化发生时降低。实施例11.药物代谢动力学研究，其中使用形成PEG2，32K-EPO缀合物的两个不对称分枝的mPEG的分子量极限由于PEG是多分散的并且用于形成不对称PEG结构即PEG2，32K的起始材料可能与12kDa和20kDa的分子量的理论值有变化，因而进行EPO与分子量为29kDa(PEG2，29K-EPO)和35kDa(PEG2，35K-EPO)的不对称PEG结构的缀合物的药物代谢动力学研究。这些是形成为本发明的EPO缀合物的一部分的PEG的总分子量的界限。以与PEG2，32K-EPO缀合物相同的方式来获得PEG2，29K-EPO缀合物和PEG2，35K-EPO缀合物。使用重2kg的新西兰品系的兔子。结果显示在表3中。正如可以看出的，在所研究的缀合物变化形式中，在药物代谢动力学参数方面没有差异。表3.有着具有不同分子量的PEG的缀合物的药物代谢动力学参数的结果。参数PEG2，32K-EPOPEG2，29K-EPOPEG2，35K-EPOt1/2(小时)165.93+/-74.41159.24+/-19.84174.01+/-25.66AUC(IU/mL·小时)83.59+/-44.6379.76+/-21.6785.55+/-34.75MRT(小时)238.94+/-12.05243.42+/-18.54235.34+/-12.43当前第1页1 2 3