用于治疗或预防核纤层蛋白病、老化和癌症的NAT10调节剂的制作方法

本发明涉及治疗或预防与核纤层蛋白A和/或核纤层蛋白C耗减或LMNA突变有关的病症的化合物，所述病症例如核纤层蛋白病(laminopathy)、早衰症、正常老化和癌症。发明背景由A和B型核纤层蛋白组成的核纤层保持核形态，并起牵系染色质的锚泊平台的作用(T.Dechat等(2008)GenesDev.22，832)。核纤层蛋白与多种染色质结合的蛋白质相互作用，并且还通过包括Nesprin和SUN蛋白在内的跨膜蛋白质与细胞骨架间接连接(M.Crisp等(2006)J.CellBio.172,41)。编码核纤层蛋白A和C的LMNA的突变引起称为核纤层蛋白病的多种人类疾病(H.J.Worman,G.Bonne(2007)Exp.CellRes.313,2121)。这些包括埃-德肌营养不良(Emery-Dreifussmusculardystrophy，AD-EDMD)(G.Bonne等(1999)Nat.Genet.21,285)和严重的老化加速疾病HutchinsonGilford早老综合征(HGPS)(A.DeSandre-Giovannoli等(2003)Science300,2055；M.Eriksson等(2003)Nature423,293)。在不同的人类癌症中还观察到A型核纤层蛋白失调，所述A型核纤层蛋白在人类癌症中异常表达或定位(J.L.Broers等(1993)Am.J.Pathol.143,211；S.F.Moss等(1999)Gut45,723；R.S.Venables等(2001)Br.J.Cancer84,512)。核纤层蛋白A/C耗减或LMNA突变引起与总染色质组织丢失有关的扩大的畸形核(G.Galiova等(2008)Eur.J.CellBiol.87,291)。然而，与核纤层蛋白病有关的一系列临床表型的确切分子原因有待确定。虽然这些病理的一些可能反映引起细胞脆性的核纤层蛋白结构破坏中的主要分子缺陷(“结构假设”)，但是许多似乎可能产生于对染色质结构、基因表达或其它核过程(例如复制、转录和DNA修复)的下游作用(K.L.Wilson等(2001)Cell104,647)。引人关注的是，最新研究表明改进核纤层蛋白病理性细胞的核结构也可改善染色质结构和其它细胞过程中的某些下游缺陷，因此改善某些疾病相关表型(C.Y.Chen等(2012)Cell149,565；J.I.Toth等(2005)PNAS102,12873；M.Columbaro等(2005)CellMol.LifeSci.62,2669)。因此存在提供纠正核结构缺陷和改进核纤层蛋白病理性人细胞的细胞适合度，从而治疗核纤层蛋白病和早衰症的治疗的需要。发明概述按照本发明的第一个方面，提供下式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症：其中：W、Y和Z各自表示CH或W、Y和Z之一表示氮，而其它两个基团表示CH；环A表示：X表示S、O或NRa；Ra表示氢、羟基、=O、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤代C1-6烷氧基；R5表示氢、羟基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、COH、COOH、COOC1-6烷基、氰基、NH2或NO2；n表示选自0-5的整数；各R1独立表示C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、氰基、羟基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2；R2表示氢、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；R3选自氢或–N=R4基团，使得当环A表示式(i)或(iii)时，R3表示–N=R4，而当环A表示式(ii)时，R3表示氢；R4表示–C(R4a)(R4b)、C3-8环烷基、C3-8环烯基或苄基，其中所述环烷基或苄基被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、氰基、羟基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2任选取代；R4a和R4b独立选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、氰基、羟基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2、NO2、C3-8环烷基或苄基，其中所述环烷基或苄基被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、氰基、羟基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2任选取代。附图简述图1：恢复核纤层蛋白A/C耗减细胞的核形状和染色质致密度的KAT抑制剂的鉴定。A)与阴性对照(siCT)相比U2OS细胞中的核纤层蛋白A/C耗减(siLMNA)的分析。B)通过DAPI染色观察到的核形状。C)来自3个独立实验的代表性MNase消化概况(左)和相应的定量测定(右)。D)亚环戊基-[4-(4'-氯苯基)噻唑-2-基)腙(化合物2)的分子结构。E)在用化合物2处理后通过DAPI染色观察到的核形状拯救。F)非处理(NT)细胞或用指定化合物处理的细胞中核圆度(nuclearcircularity)的定量测定(3个独立实验(其中n>212)的均值±s.d.)。G)来自3个独立实验的代表性MNase消化概况(左)和相应的siLMNA细胞的定量测定(右)。H)核面积的定量测定(3个独立实验(其中n>198)的均值±s.d.)。I)用siLMNA转染并用化合物2处理的表达GFP-H2B的U2OS细胞中核形状拯救的实时成像照片。J)通过流式细胞术分析的细胞周期概况。PI：碘化丙锭。比例尺：20μm。图2：小分子化合物2拯救不同核纤层蛋白A/C耗减细胞的核形状缺陷。A)和B)通过核纤层蛋白A/C(siLMNA)耗减并且用不同的KATi处理的HeLa(A)或RPE-1(B)细胞的DAPI染色的核形状显现。比例尺：50μm。C)和D)来自A)和B)所示DAPI染色的HeLa(C)或RPE-1(D)细胞的核圆度的CellProfiler定量测定(3个独立实验(其中n>252)的均值±s.d)。E)通过流式细胞术分析的细胞周期概况。PI：碘化丙锭。F)规定癌细胞系中的核纤层蛋白A/C表达水平的分析。下图：癌细胞中相对于正常RPE-1细胞的核纤层蛋白A/C表达的ImageJ定量测定。G)DAPI染色的代表性照片，其显示在用化合物2处理后表达低核纤层蛋白A/C的癌细胞的核形状改善。比例尺：20μm。图3：在用化合物2处理后核纤层蛋白A/C耗减细胞的核形状拯救不依赖于有丝分裂。在S期通过阿非迪霉素同步然后在阿非迪霉素存在下用化合物2处理以防止有丝分裂进入的细胞中通过DAPI染色观察到的核形状拯救。比例尺：20μm。图4：N-乙酰转移酶NAT10是小分子化合物2的细胞靶。A)可点击类似物(clickableanalogue)化合物3和可点击无活性对照分子参比化合物A的分子结构。B)U2OS核圆度的定量测定(3个独立实验(其中n>224)的均值±s.d.)。C)用于小分子标记的点击化学策略的原理。D)化合物3的生物素化类似物的分子结构。E)小分子生物素化化合物3牵出后蛋白质的银染和在5当量的非可点击分子化合物2存在下降低的特异性条带(参见箭头)的鉴定。对应于NAT10的条带以及其它特异性和非特异性条带被放大在右边(*)。F)在U2OS细胞中预温育的可点击分子化合物3和参比化合物A的牵出和结合的蛋白质的分析。G)通过蛋白质印迹法观察到的对照或NAT10耗减细胞(siNAT10)中NAT10(红色)和荧光标记的化合物3(绿色)的高分辨代表性显微镜照片(下图)。比例尺：10μm。H)通过圆二色谱学(右)分析纯化的(银染，左)NAT10折叠，显示递增浓度的化合物2对NAT10螺旋特征的递增作用。I)Remodelin(化合物1)的分子结构，Remodelin为一种稳定和有效的化合物2的类似物。图5：分子的亚细胞定位和其对NAT10定位的作用的分析。A)与分子化合物3(参见图2)相反，显示非特异性染色的可点击对照分子参比化合物A的荧光标记。比例尺：20μm。B)按规定转染或处理的细胞内核纤层蛋白A/C和NAT10染色的IF照片。比例尺：20μm。图6：筛选化合物2类似物以鉴定核形状拯救的结构要求。A)用指定的化合物2类似物处理的siLMNA细胞中通过DAPI染色的核形状分析。B)通过siLMNA细胞的DAPI染色观察到的剂量依赖性核形状拯救，显示与化合物2相比Remodelin的效能增加约5倍。比例尺：20μm。图7：通过Remodelin抑制NAT10活性介导LMNA耗减细胞的核形状拯救。A)U2OS细胞中NAT10和核纤层蛋白A/C耗减的分析。B)通过DAPI染色显现的核形状(左)和核圆度的定量测定(右)(3个独立实验(其中n>267)的均值±s.d.)。比例尺：20μm。C)NAT10与其已知的结构域的图示。用星号表示在D)中鉴定的G641E突变。D)人NAT10残基10-917的模型化3D结构，显示了乙酰辅酶A结合部位(左)和通过用Swiss-ProtPDB观测仪显现的NAT10突变(G641E，右)破坏Ac-CoA结合。E)体外乙酰化测定法，显示了NAT10对于微管蛋白的乙酰转移酶活性。F)稳定表达siRNA抗性FLAG-NAT10WT或FLAG-NAT10G641E(FLAG-NAT10MUT)的细胞中核圆度的定量测定(左)(3个独立实验(其中n>198)的均值±s.d.)和通过DAPI染色显现的核形状(右)。比例尺：20μm。图8：NAT10突变G641E(MUT)不影响其定位。A)NAT10GNAT(Gcn5相关N-乙酰转移酶)结构域的比对，显示了G641残基的保守性。B)来自人HEK293细胞的纯化的FLAG-NAT10WT或G641E突变体(MUT)的银染。这些蛋白质用于乙酰转移酶活性测定法。C)稳定表达FLAG-NAT10WT和MUT的siRNA抗性构建体的U2OS细胞的表征。通过蛋白质印迹法观察到构建体的表达和对siRNA的抗性，和D)使用抗NAT10抗体或抗FLAG抗体通过IF染色证实两种构建体的正确定位。比例尺：10μm。图9：Remodelin靶向NAT10以改善HGPS细胞的核形状和适合度。A)在相同群体倍增下与匹配的正常成纤维细胞相比HGPS细胞系中核纤层蛋白A/C的代表性免疫荧光(IF)照片。比例尺：10μm。B)在Remodelin处理时畸形核的定量测定(3个独立实验(其中n>213)的均值±s.e.m.)。C)HGPSAG11498细胞中的核纤层蛋白A/C染色(左)和畸形核的定量测定(右；3个独立实验(其中n>176)的均值±s.e.m.)。比例尺：50μm。D)在Remodelin或FTI处理后γH2AX的蛋白质印迹分析。E)在Remodelin或ATM/ATR抑制(ATM/ATRi)时γH2AX染色的免疫荧光分析。F)通过IF观察到的γH2AX阳性细胞的定量测定(3个独立实验(其中n>127)的均值±s.e.m.)。G)在Remodelin或ATM/ATR抑制剂处理时的HGPS增殖(9个重复样品的均值±s.e.m)。H)老化相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的定量测定(3个独立实验(其中n>127)的均值±s.e.m.)。I)在群体倍增12次(PDL12)时在8天Remodelin处理后及在Remodelin处理几周和12次细胞分裂(PDL24)后HGPSAG11498中老化相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的定量测定(2个独立实验(其中n>298)的均值±s.d.)。图10：Remodelin以剂量依赖性方式拯救老化的MRC5细胞而非WS细胞的核形状。A)通过Remodelin拯救在群体倍增44次(PD44)时在培养物中的MRC5老化细胞中通过DAPI染色观察到的畸形核。B)在递增浓度的Remodelin后畸形核的定量测定(3个独立实验的均值±s.e.m.)。C)非核纤层蛋白病理性Werner综合征细胞(WS)的DAPI染色，显示在Remodelin处理时无核形状改善。D)畸形核的CellProfiler定量测定(3个独立实验的均值±s.d.，n>273)。比例尺：50μm。图11：非热原性细胞中Remodelin防止FTI诱导的核形状缺陷。A)在Remodelin或FTI处理后核纤层蛋白A/C加工的分析，显示了Remodelin不是FTI。B)在规定的处理后核纤层蛋白A/CIF染色的代表性照片。箭头表明FTI诱导的正常成纤维细胞的畸形核。比例尺：50μm。C)用规定的细胞系和抑制剂处理的畸形核的定量测定(3个独立实验的均值±s.e.m.，n>178)。D)DAPI染色的代表性照片，显示了FTI和Remodelin对U2OS细胞的核形状的作用。比例尺：20μm。图12：Remodelin改善HGPS细胞的总体细胞适合度。A)通过蛋白质印迹法观察到的正常成纤维细胞和HGPSAG11498细胞的NAT10耗减，并显示siNAT10对核纤层蛋白A/C表达和加工没有作用。B)IF图像，显示在Remodelin处理时HGPS细胞中核形状改善和γH2AX灶的数目减少。比例尺：10μm。C)蛋白质印迹分析，显示Remodelin在受测试的2种HGPS细胞系中降低γH2AX水平。D)IF图像，显示在Remodelin处理时埃-德肌营养不良细胞(EDMD)中核形状改善和γH2AX染色密度降低。比例尺：10μm。E)蛋白质印迹分析，显示Remodelin降低EDMD中的γH2AX水平。F)蛋白质印迹分析，显示在HGPSAG11498细胞中Remodelin对p53和DNA损伤信号转导途径的作用。G)H)中定量测定的H3K9me3或SUN1形式的代表性IF图像。比例尺：20μm。I)IF染色，显示更强和更均一的DAPI染色，以及在Remodelin处理时通过NAT10染色观察到的核结构的重构。比例尺：10μm。J)在Remodelin处理时在EdU掺入HGPS细胞中2小时后的流式细胞术分析，显示了DNA复制速率提高。K)在用p53抑制剂(Pifithrin)或用规定的KAT抑制剂处理后老化相关β-半乳糖苷酶阳性细胞的定量测定，显示了这些化合物无一减缓HGPSAG11498的老化。图13：抑制NAT10乙酰转移酶活性更改微管组构以拯救核形状缺陷。A)α-微管蛋白的反转IF照片的微管网显现。B)在细胞用微管或肌动蛋白细胞骨架破坏剂处理后的核形状显现。C)siLMNA细胞中核形状(DAPI)和Golgi(抗巨蛋白)完整性的显现。D)在Remodelin或诺考达唑(Nocod.)处理时多聚(P)和可溶性(S)微管蛋白的分级分离。E)用siNAT10转染并表达规定siRNA抗性构建体的细胞中的微管再生长测定法。α-微管蛋白IF染色(左)显示成核期：t=5分钟和微管锚定(t=15分钟)。右：具有规定形式的细胞的定量测定(3个独立实验(其中n>103)的均值±s.e.m.)。F)核纤层蛋白病理性细胞具有与无序的染色质结构有关的扩大的畸形核。在Remodelin处理时，NAT10乙酰转移酶活性被抑制，导致中心体上的微管锚定破坏并向核被膜释放出微管力。这种机械应力向核的释放有助于核形状拯救和细胞合适度和染色质组织的总体改善。比例尺：20μm。图14：Remodelin靶向HGPS细胞中的微管网以改善核形状。A)在细胞用微管破坏剂处理后的核形状显现和定量测定。B)用Remodelin处理的HGPSAG11498细胞中的微管再生长测定。α-微管蛋白反转IF染色显示在Remodelin处理时正常的微管解聚(T=0)和成核期(T=5分钟)但微管锚定的缺陷(T=15分钟)。C)B)中的微管再生长测定法，显示了在规定HGPS细胞系中在NAT10耗减(siNAT10)时微管锚定的缺陷(T=15分钟)，并与用对照siRNA转染的细胞(siCT)进行了比较。比例尺：20μm。图15：化合物2抑制具有低核纤层蛋白A/C表达的癌细胞的增殖、迁移和侵袭。A)用或不同50μM化合物2处理1周的规定癌细胞系的群体倍增时间，显示了表达低水平的核纤层蛋白A的细胞对该分子更敏感。B)前列腺22RV1癌细胞的基质胶侵袭测定法的代表性照片，显示了在用50μM化合物2处理时无侵袭。C)在用50μM化合物2处理后来自规定的低表达癌细胞系的跨孔迁移测定和基质胶侵袭测定的量化。图16：化合物2降低核纤层蛋白A/C耗减细胞的蛋白质翻译。A)以相同的密度接种用siRNA对照(siCT)或siRNA核纤层蛋白A/C(siLMNA)转染的U2OS细胞，用环己米特(CHX)处理24小时以抑制蛋白质合成并用DAPI染色。DAPI染色的代表性照片显示siLMNA细胞对CHX有更大抗性。B)蛋白质合成通过定量测定HPG(一种甲硫氨酸的可点击类似物)的掺入来测量。FACS分析显示在增加化合物2的剂量后在表达低核纤层蛋白A的U2OS细胞(B)或正常RPE细胞(C)中定量测定HPG强度。图17：小鼠中Remodelin的药代动力学测定。A)在ICR小鼠中在IV1mg/kg和PO5mg/kg剂量水平后评价了Remodelin的药代动力学。在IV1mg/kg给药后，半寿期(T1/2)为0.915小时，清除率为139mL/分钟/kg。在PO5mg/kg给药后，半寿期(T1/2)为1.81小时，在0.25小时(Tmax)达到最大血浆浓度(Cmax，409ng/mL)，且口服暴露为259ng/小时/mL(AUC0-∞)，生物利用度为43.5%。B)从A)所示曲线获得的结果详情。图18和19：核形状拯救的结构要求的分析。该分析的结果描述于实施例6。图20：化合物2以剂量依赖性方式抑制A431黑素瘤细胞系的生长。该分析的结果描述于实施例7。图21：核纤层蛋白A/C敲除的U2OS细胞比野生型细胞对化合物2和类似物更敏感。该分析的结果描述于实施例8。图22：化合物2在LMNAKO细胞中特异性地抑制整体蛋白质翻译。该分析的结果描述于实施例9。图23：NAT10的耗减导致与用化合物2处理类似的增殖、迁移和侵袭抑制。该分析的结果描述于实施例10。图24：化合物2体内毒性和体外特异性的评价。该分析的结果描述于实施例11。图25：化合物2处理对HutchinsonGilford早老综合征小鼠模型的作用。该分析的结果描述于实施例12。图26：体内化合物2的分子作用。该分析的结果描述于实施例13。图27：作为NAT10抑制的潜在生物标志物的乙酰基微管蛋白的评价。该分析的结果描述于实施例14。图28：工程改造LmnaG609G/G609G/NAT10+/-小鼠用于遗传验证。该分析的结果描述于实施例15。图29：微阵列分析显示化合物2对于HGPS细胞中的基因表达调节有特异性。该分析的结果描述于实施例16。发明详述按照可提及的本发明的一个具体方面，提供下式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症：其中：W、Y和Z各自表示CH或W、Y和Z之一表示氮，而其它两个基团表示CH；环A表示：X表示S、O或NRa；Ra表示氢、羟基、=O、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤代C1-6烷氧基；R5表示氢、羟基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、COH、COOH、COOC1-6烷基、氰基、NH2或NO2；n表示选自0-5的整数；各R1独立表示C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、氰基、羟基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2；R2表示氢、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；R3选自氢或–N=R4基团，使得当环A表示式(i)或(iii)时，R3表示–N=R4，而当环A表示式(ii)时，R3表示氢；R4表示–C(R4a)(R4b)、C3-8环烷基或苄基，其中所述环烷基或苄基被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、氰基、羟基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2任选取代；R4a和R4b独立选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、氰基、羟基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2、NO2、C3-8环烷基或苄基，其中所述环烷基或苄基被C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、氰基、羟基、COH、COOH、COOC1-6烷基、NH2或NO2任选取代。本文所用术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。本文所用术语“氰基”是指其中碳原子与氮原子三键键合的基团(即-C≡N)。本文所用术语“羟基”是指其中氧原子与氢原子键合的基团。本文所用术语“C1-6烷基”作为基团或基团的一部分是指含有1-6个碳原子的线性或支链饱和烃基。所述基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基或己基等。本文所用术语“C2-6烯基”作为基团或基团的一部分是指含有2-6个碳原子和含有碳碳双键的线性或支链烃基。本文所用术语“C2-6炔基”作为基团或基团的一部分是指具有2-6个碳原子和含有碳碳三键的线性或支链烃基。本文所用术语“C1-6烷氧基”作为基团或基团的一部分是指-O-C1-6烷基，其中C1-6烷基如本文定义。所述基团的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。本文所用术语“卤代C1-6烷基”作为基团或基团的一部分是指本文定义的C1-6烷基，其中一个或一个以上的氢原子被卤素置换。因此术语“卤代C1-6烷基”包括一卤代C1-6烷基以及多卤代C1-6烷基。有1、2、3或更多个被卤素置换的氢原子，因此卤代C1-6烷基可具有1、2、3或更多个卤素。所述基团的实例包括氟乙基、氟甲基、三氟甲基或三氟乙基等。本文所用术语“卤代C1-6烷氧基”作为基团或基团的一部分是指本文定义的–O-C1-6烷基，其中一个或一个以上的氢原子被卤素置换。因此术语“卤代C1-6烷氧基”包括一卤代C1-6烷氧基以及多卤代C1-6烷氧基。有1、2、3或更多个被卤素置换的氢原子，因此卤代C1-6烷氧基可具有1、2、3或更多个卤素。所述基团的实例包括氟乙基氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基等。本文所用术语“C3-8环烷基”作为基团或基团的一部分是指含有3-8个碳原子的饱和烃环。所述基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。本文所用术语“苄基”作为基团或基团的一部分是指与CH2基团连接的苯环。为了避免疑惑，除非另有说明，否则术语“取代的”意指被一个或多个规定的基团取代。在其中基团可选自多个备选基团的情况下，所选的基团可相同或不同。为了避免疑惑，术语“独立地”意指其中一个以上取代基选自多个可能的取代基，这些取代基可相同或不同。在一个实施方案中，W、Y和Z各自表示CH。在一个实施方案中，环A表示式(i)或(ii)。在又一个实施方案中，环A表示式(i)。在一个备选实施方案中，环A表示式(ii)。在又一个备选实施方案中，环A表示式(iii)。在一个实施方案中，X表示S或O。在又一个实施方案中，X表示S(即噻唑环)。在一个备选实施方案中，X表示O(即噁唑环)。在一个实施方案中，R5表示氢或卤素(例如溴)。在又一个实施方案中，R5表示氢。在一个实施方案中，n表示0-3的整数。在一个实施方案中，n表示1-2的整数。在又一个实施方案中，n表示1。在一个备选实施方案中，n表示2。在一个实施方案中，R1表示氰基、羟基、卤素(例如氯或溴)、C1-6烷氧基(例如甲氧基)、COOH、NO2、卤代C1-6烷基(例如三氟甲基)或卤代C1-6烷氧基(例如三氟甲氧基)。在又一个实施方案中，R1表示氰基、羟基、卤素(例如氯或溴)、C1-6烷氧基(例如甲氧基)、COOH或NO2。在再一个实施方案中，R1表示氰基、卤素(例如氯或溴)或NO2，例如氰基或卤素。在再一个实施方案中，R1表示氰基。在又一个备选实施方案中，R1表示卤素，例如氯。在又一个备选实施方案中，R1表示卤代C1-6烷基，例如三氟甲基。本领域技术人员应了解，R1基团可在式(I)苯环的对位、邻位或间位上连接。在一个实施方案中，R1位于2、3或4位(即邻位、间位或对位)，特别是间(3)位和/或对(4)位。在又一个实施方案中，R1位于间(3)位，例如当R1为卤素或氰基，特别是卤素时。在一个备选实施方案中，R1位于对(4)位，例如当R1为氰基、氯或三氟甲基时。在一个实施方案中，n表示1，且所述R1基团存在于式(I)的苯环的3或4位上。在一个实施方案中，n表示1，且R1表示氰基、羟基、卤素(例如氯或溴)、C1-6烷氧基(例如甲氧基)、COOH、NO2或卤代C1-6烷基(例如三氟甲基)。在又一个实施方案中，n表示1，且R1表示氰基、羟基、卤素(例如氯或溴)、C1-6烷氧基(例如甲氧基)、COOH或NO2。在一个实施方案中，n表示2，且所述R1基团存在于式(I)的苯环的2和4位或3和4或2和3位上，例如2和4或3和4位。在一个实施方案中，n表示2，且两个R1基团表示氯(即3,4-二氯)或R1表示C1-6烷氧基(例如甲氧基)和羟基(即2-羟基-4-甲氧基)。在一个备选实施方案中，n表示2，且两个R1基团表示羟基(即3,4-二羟基)。在一个实施方案中，R2表示氢或C2-6炔基(例如乙炔基)。在又一个实施方案中，R2表示氢。在又一个备选实施方案中，R2表示乙炔基。在一个实施方案中，R3表示–N=R4。在一个实施方案中，R4表示–C(R4a)(R4b)(例如–C(Me)2)、未取代的C3-8环烷基、未取代的C3-8环烯基或未取代的苄基。在又一个实施方案中，R4表示未取代的C3-8环烷基或未取代的苄基。在一个实施方案中，R4表示C3-8环烷基，例如环戊基或环己基(例如未取代的环戊基或未取代的环己基)。在又一个实施方案中，R4表示C3-8环烷基，例如环戊基(例如未取代的环戊基)。在一个备选实施方案中，R4表示C3-8环烯基，例如环戊烯基或环己烯基(例如未取代的环戊烯基或未取代的环己烯基)。在一个实施方案中，R4被选自C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤素、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基或羟基的1或2个基团任选取代。在一个实施方案中，式(I)的化合物选自化合物1-21或其备选的药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物。在又一个实施方案中，式(I)的化合物选自化合物1-12或其备选的药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物。在再一个实施方案中，式(I)的化合物选自化合物1-11，例如化合物1-8或其备选的药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物。在再一个实施方案中，式(I)的化合物选自化合物1-3或其备选的药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物。在一个备选实施方案中，式(I)化合物是选自以下的化合物：化合物1、3、4、5、6、7和8，例如化合物3或8或其备选的药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物。在一个实施方案中，式(I)化合物为4-(4-氰基苯基)-2-(2-亚环戊基肼基)噻唑(化合物1)或其药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物。在一个备选实施方案中，式(I)化合物为4-(4-氯苯基)-2-(2-亚环戊基肼基)噻唑或其药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物，例如盐酸盐。在一个备选实施方案中，式(I)化合物为4-(4-氯苯基)-2-(2-亚环戊基-1-(丙-2-炔-1-基)肼基)噻唑(化合物3)或其药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物。在一个备选实施方案中，式(I)化合物为4-(4-三氟甲基苯基)-2-(2-亚环戊基肼基)噻唑(化合物13)或其药学上可接受的盐、溶剂合物、游离酸制备物或游离碱制备物，例如氢溴酸盐。按照本发明的又一个方面，提供下式(I)a的化合物用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症：(I)a其中R1、R2、R3、R5、X和n如上文定义。按照本发明的又一个方面，提供下式(I)b的化合物用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症：(I)b其中R1、R2、R3、R5和n如上文定义。按照本发明的又一个方面，提供下式(I)c的化合物用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症：(I)c其中R1、R2和n如上文定义。按照本发明的又一个方面，提供下式(I)d的化合物用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症：(I)d其中R1和n如上文定义。某些式(I)的化合物是新的，因此按照本发明的又一个方面，提供选自以下的式(I)化合物：化合物3、化合物8、化合物11、化合物13-17和化合物19-21；及其任一种的盐和溶剂合物。在一个实施方案中，化合物选自化合物3或8。NAT10抑制更概括地讲，应了解，本发明人发现了NAT10抑制和改善核纤层蛋白A/C耗减细胞或具有LMNA突变的细胞中的核结构和染色质组织之间的新的联系。因此，在本发明的又一个方面，提供NAT10抑制剂用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化和癌症(例如特征在于低水平的LMNA表达的癌症)，特别是核纤层蛋白病和早衰症。N-乙酰转移酶10，亦称为“NAT10”(或最初为hALP)，是一种N-乙酰转移酶，其从细菌到人是高度保守的(参见图8)。曾提出哺乳动物NAT10为赖氨酸乙酰转移酶(KAT)，而其细菌同系物TmcA，是一种已知的RNA胞嘧啶乙酰转移酶(Chimnaronk等(2009)Embo.J.28,1362)。KAT酶具有调节组蛋白和其它蛋白质的乙酰化状态的能力，因此影响整体染色质组织。因此，本文提及术语“NAT10抑制剂”是指能够抑制NAT10的乙酰转移酶活性的分子。哺乳动物NAT10的已知底物是组蛋白和微管蛋白(Shen等(2009)Exp.CellRes.315,1653)。本发明人已鉴定了NAT10的小分子抑制剂，其通过微管网的重构导致核形态拯救。因此，本文公开的经鉴定的NAT10小分子抑制剂为研究有价值的时空分辨率的核纤层蛋白病相关过程提供新的机会，并且可用于缓解核纤层蛋白病或引起早老的疾病。抑制可通过与NAT10直接或间接结合而发生，这对本领域技术人员应是显而易见的。筛选方法按照本发明的又一个方面，提供筛选能够抑制NAT10活性的物质作为NAT10抑制剂的方法及其在治疗中的用途。鉴于本发明人描述了NAT10抑制和治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症之间的联系的事实，还提供筛选旨在预防或治疗受试者的核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症的候选药物的方法，所述方法包括通过测量试验物质对NAT10活性的作用来鉴定能够抑制NAT10活性的所述试验物质。在一个实施方案中，筛选方法包括：a.使核纤层蛋白A和/或核纤层蛋白C耗减细胞与试验物质接触；b.在设定的时间后测量NAT10活性的水平；和c.对测量的NAT10活性的水平与在不加入试验物质时观察到的进行比较。在一个实施方案中，筛选方法在体外进行。在一个实施方案中，通过使用小干扰RNA(siRNA)以干扰LMNA基因的表达，来获得核纤层蛋白A和/或核纤层蛋白C耗减细胞。在又一个实施方案中，通过使用SEQIDNO:1和2的siRNA双链体获得核纤层蛋白A和/或核纤层蛋白C耗减细胞。本领域技术人员应认识到，筛选方法提供用于鉴定能够抑制NAT10活性和拯救核形状缺陷的化合物的具体指导。化合物的制备本文中，术语“药学上可接受的盐”旨在说明对患者无害的盐。所述盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的金属盐和药学上可接受的碱加成盐。酸加成盐包括无机酸以及有机酸的盐。提及式(I)化合物及其分组还包括例如下文所述的离子形式、盐、溶剂合物、异构体(包括几何和立体化学异构体)、互变异构体、N-氧化物、酯、前药、同位素及其受保护的形式；优选其盐或互变异构体或异构体或N-氧化物或溶剂合物；更优选其盐或互变异构体或N-氧化物或溶剂合物，甚至更优选其盐或互变异构体或溶剂合物。下文中，在本发明的任何方面定义的化合物及其离子形式、盐、溶剂合物、异构体(包括几何和立体化学异构体)、互变异构体、N-氧化物、酯、前药、同位素及其受保护的形式(化学过程中的中间化合物除外)称为“本发明的化合物”。本文所述化合物包括其以任何和全部立体异构体(例如适当的非对映异构体和对映异构体)的形式的应用。例如，手性化合物被要求保护或被要求作为单一对映异构体或对映异构体的混合物(例如外消旋混合物)使用。式(I)的许多化合物可以盐(例如酸加成盐，在某些情况下有机或无机碱的盐例如羧酸盐、磺酸盐和磷酸盐)的形式存在。所有这类盐都在本发明的范围内，且提及式(I)化合物包括化合物的盐形式。可通过常规化学方法，例如描述于PharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse,P.HeinrichStahl(编辑),CamilleG.Wermuth(编辑),ISBN:3-90639-026-8,Hardcover,388页,August2002的方法，从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成本发明的盐。总的来讲，可在水或有机溶剂或两者的混合物中，使这些化合物的游离酸或碱形式与合适的碱或酸反应来制备所述盐；总的来讲，可使用非水介质，例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。可与各种酸(无机酸和有机酸两者)形成酸加成盐(单或二盐)。酸加成盐的实例包括与选自以下的酸形成的单盐或二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(例如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸以及酰化氨基酸和离子交换树脂。一组特定的盐包括从以下酸形成的盐：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸(methanesulfonic/mesylate)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、乙酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡糖醛酸和乳糖酸。一种特定的盐是盐酸盐。另一种特定的盐是酸式硫酸盐，亦称半硫酸盐。当式(I)化合物含有胺官能团时，这些可按照技术人员熟知的方法(例如通过与烷化剂反应)形成季铵盐。所述季铵化合物在式(I)的范围内。应了解，本发明的化合物可作为单盐或二盐存在。本发明化合物的盐形式通常是药学上可接受的盐，药学上可接受的盐的实例论述于Berge等,1977,"PharmaceuticallyAcceptableSalts,"J.Pharm.Sci.,第66卷,第1-19页。然而，不是药学上可接受的盐也可作为中间体形式制备，所述中间体形式然后可转化成药学上可接受的盐。可用于例如本发明化合物的纯化或分离的这类非药学上可接受的盐形式，也构成本发明的部分。有机化学领域的技术人员应认识到，许多有机化合物可与它们在其中进行反应或从中沉淀或结晶的溶剂形成复合物。这些复合物称为“溶剂合物”。例如，与水的复合物称为“水合物”。本发明化合物的药学上可接受的溶剂合物在本发明的范围内。在一个实施方案中，本发明化合物的药学上可接受的溶剂合物包括其水合物。本领域技术人员应认识到，某些经保护的式(I)化合物的衍生物(可在最后的脱保护阶段之前制备)本身可能不具有药理活性，但在某些情况下可以口服或胃肠外给药且之后在体内代谢形成有药理活性的本发明化合物。所述衍生物因此可称为“前药”。本发明化合物的所有这类前药包括在本发明的范围内。适于本发明化合物的前药官能团的实例描述于DrugsofToday，第19卷，第9期，1983，第499–538页和TopicsinChemistry，第31章，第306–316页和“DesignofProdrugs”,H.Bundgaard,Elsevier,1985,第1章(所述文献的公开内容通过引用结合到本文中)。本领域的技术人员应进一步认识到，当合适的官能团存在于本发明的化合物中时，可在所述官能团上安置本领域技术人员已知的作为“前药部分”的某些部分(例如H.Bundgaard载于“DesignofProdrugs”所描述的，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中)。本发明的化合物和各种盐的范围还包括其多晶型物。式(I)化合物可以多种不同的几何异构形式和互变异构形式存在，且提及式(I)化合物包括所有这些形式。本发明包括全部药学上可接受的同位素标记的本发明化合物，即式(I)化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常在自然界存在的原子质量或质量数的原子置换。适于包括在本发明化合物中的同位素的实例包括氢(例如2H(D)和3H(T))、碳(例如11C、13C和14C)、氯(例如36Cl)、氟(例如18F)、碘(例如123I、125I和131I)、氮(例如13N和15N)、氧(例如15O、17O和18O)、磷(例如32P)和硫(例如35S)的同位素。某些同位素标记的式(I)化合物，例如掺入放射性同位素的式(I)化合物可用于药物和/或底物组织分布研究。式(I)化合物还可具有有价值的诊断性质，因为它们可用于检测或鉴定标记的化合物和其它分子、肽、蛋白质、酶或受体之间形成的复合物。检测或鉴定方法可使用用标记物质标记的化合物，所述标记物质例如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、水母发光蛋白和萤光素酶)等。放射性同位素氚即3H(T)和碳-14即14C由于其易于掺入和简易的检测手段而特别可用于该目的。用较重的同位素例如氘即2H(D)取代可提供产生于较大代谢稳定性的某些治疗优势，例如体内半寿期延长或剂量要求降低，因此在某些情况下是优选的。用正电子发射同位素例如11C、18F、15O和13N取代可用于正电子发射成像术(PET)研究用于检查靶标占据。一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与随附实施例和制备例所述方法类似的方法使用合适的同位素标记的试剂替换之前使用的未标记的试剂，来制备同位素标记的式(I)化合物。用于制备化合物的方法按照本发明的又一个方面提供用于制备本文定义的式(I)化合物的方法，所述方法包括：(a)当A表示(i)时，使下式(II)的化合物与下式(III)的化合物反应(II)其中W、Y、Z、R1和n如上文定义，L1表示合适的离去基团，例如氯或溴；(III)其中R2和R3如上文定义；(b)使式(I)化合物的受保护的衍生物脱保护；和/或(c)使式(I)化合物或其受保护的衍生物相互转化为其它的式(I)化合物或其受保护的衍生物；和(d)任选形成式(I)化合物的药学上可接受的盐。方法(a)通常包括在合适的溶剂(例如异丙醇)存在下使式(II)化合物与式(III)化合物在合适的温度(例如室温)下反应6至24小时。本领域技术人员应认识到，其中A表示(ii)和(iii)的式(I)化合物的制备可按与方法(a)所述程序类似的方式进行。有机合成技术人员应认识到，上述流程中两个或更多个化学步骤可连续运行而无需分离中间材料。方法(b)通常包括任何合适的脱保护反应，其条件将取决于保护基的性质。当保护基表示tBoc时，所述脱保护反应可通常包括在合适的溶剂中使用合适的酸。例如，酸可适宜地包括三氟乙酸或盐酸，而溶剂可适宜地包括二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4-二噁烷、甲醇或水。任选可使用溶剂的混合物，例如甲醇水溶液或乙酸乙酯/1,4-二噁烷。应认识到，当保护基表示tBoc时，使用上述合适的酸脱保护可得到作为药学上可接受的盐的式(I)化合物，其可直接分离。或者，可采用本领域众所周知的方法分离作为游离碱的式(I)化合物，之后任选按照方法(d)转化成药学上可接受的盐。羟基可作为例如醚(-OR)或酯(-OC(=O)R)而被保护，例如作为：叔丁基醚；四氢吡喃基(THP)醚；苄基、二苯甲基(二苯基甲基)或三苯甲基(三苯基甲基)醚；三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基醚；或乙酰基酯(-OC(=O)CH3)。醛或酮基团可分别作为例如缩醛(R-CH(OR)2)或缩酮(R2C(OR)2)而被保护，其中羰基(>C=O)用例如伯醇处理。醛或酮基团容易在酸存在下使用过量的水通过水解再生。胺基可作为例如酰胺(-NRCO-R)或氨基甲酸酯(-NRCO-OR)而被保护，例如作为：甲基酰胺(-NHCO-CH3)；苄基氨基甲酸酯(-NHCO-OCH2C6H5、-NH-Cbz或NH-Z)；作为叔丁基氨基甲酸酯(-NHCO-OC(CH3)3、-NH-Boc)；2-联苯基-2-丙基氨基甲酸酯(-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5、-NH-Boc)；作为9-芴基甲基氨基甲酸酯(-NH-Fmoc)；作为6-硝基藜芦基氨基甲酸酯(-NH-Nvoc)；作为2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(-NH-Teoc)；作为2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(-NH-Troc)；作为烯丙基氨基甲酸酯(-NH-Alloc)或作为2(-苯基磺酰基)乙基氨基甲酸酯(-NH-Psec)。胺(例如环状胺和杂环N-H基团)的其它保护基包括甲苯磺酰基(toluenesulphonyl/tosyl)和甲磺酰基(methanesulphonyl/mesyl)、苄基例如对甲氧基苄基(PMB)和四氢吡喃基(THP)基团。方法(c)通常包括本领域技术人员已知的相互转化程序。例如，在式(I)化合物中，第一取代基可通过本领域技术人员已知方法转化成第二备选取代基。用于将前体化合物转化成式I化合物的各种众所周知的官能团相互转化是本领域技术人员已知的，描述于JerryMarch，AdvancedOrganicChemistry,第4版，JohnWiley&Sons，1992。例如可能的金属催化的官能化例如使用有机锡试剂(Stille反应)、Grignard试剂和与氮亲核体的反应描述于“PalladiumReagentsandCatalysts”[JiroTsuji,Wiley,ISBN0-470-85032-9]和HandbookofOrganoPalladiumChemistryforOrganicSynthesis[第1卷,Ei-ichiNegishi编辑,Wiley,ISBN0-471-31506-0]。方法(d)可如下进行：通过将溶于合适溶剂中的游离碱形式的式(I)化合物用化学计量的或过量的药学上可接受的有机或无机酸处理，然后通过本领域众所周知的方法，例如溶剂蒸发或结晶，分离所得到的盐。适当时，之前在方法(a)、(b)和(c)描述的反应后于或先于本领域技术人员已知的一个或多个反应并以适当的顺序进行以实现上文定义的R1、R2、R3、R4和R5的必要取代，得到其它的式(I)化合物。所述反应(其条件可存在于文献中)的非限制性实例包括：反应官能团的保护，反应官能团的脱保护，卤化，脱卤，脱烷，胺、苯胺、醇和酚的烷基化和芳化，羟基上的Mitsunobu反应，合适基团上的环加成反应，硝基、酯、氰基、醛的还原，过渡金属催化的偶联反应，酰化，磺酰化/磺酰基的引入，皂化/酯基团的水解，酯基的酰胺化(amidification)或反酯化，羧基的酯化或酰胺化，卤素交换，被胺、硫醇或醇亲核取代，还原性胺化，羰基和羟基胺基团上的肟形成，S-氧化，N-氧化，成盐作用。可按照下列流程1，从式(IV)化合物制备式(II)化合物：流程1其中W、Y、Z、R1、n和L1如上文定义。步骤(i)通常包括使用合适的试剂，例如1.1eqNXS、1.5eqpTSA和MeCN，接着加热至回流2-24小时。本领域技术人员应认识到，下式(III)化合物是已知的或可按已知程序从已知原料制备。例如，式(V)化合物(其中R2表示氢和R3表示–N=环丙基)可按照以下流程2制备：流程2步骤(i)通常包括使式(V)和(VI)化合物在合适的溶剂(例如异丙醇)中反应，接着加热至回流16小时。所需中间体，例如式(IV)、(V)和(VI)化合物是市购可获得的、文献中已知的、通过类似于文献中的方法制备或按照与描述于下面的实施例实验程序的方法类似的方法制备。治疗方法如上文所述，认为本发明的化合物可用于治疗或预防与核纤层蛋白A和/或核纤层蛋白C耗减或LMNA突变有关的病症，例如核纤层蛋白病、早衰症、正常老化和癌症，特别是核纤层蛋白病和早衰症。因此，按照本发明的又一个方面，提供本发明的化合物用作药物，优选人用药物。按照又一个方面，本发明提供本发明的化合物在制备用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症、特别是核纤层蛋白病或早老的药物中的用途。按照本发明的又一个方面，提供治疗或预防有需要的人的核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症的方法，所述方法包括给予所述人治疗有效量的本文定义的化合物。本文提及“核纤层蛋白病”是指由编码核纤层的蛋白质的基因突变(例如核纤层蛋白A/C耗减和/或LMNA基因的缺陷)引起的一组遗传病症。核纤层蛋白病包括营养不良和早衰(即早老)疾病。核纤层蛋白病的实例包括但不限于：非典型Werner综合征；Barraquer-Simons综合征；Buschke-Ollendorff综合征；心肌病；夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Toothdisease)；埃-德肌营养不良(X-连锁的(EDMD)、常染色体显性(EDMD2)或常染色体隐性(EDMD3))；Dunnigan型家族性局部脂质营养不良(FPLD)；Greenberg发育异常；Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)；脱髓鞘性成人起病常染色体显性脑白质营养不良(ADLD)；肢带型肌营养不良1B型(LGMD1B)；脂肪萎缩并糖尿病、肝性脂肪变性、肥厚型心肌病和白黑皮丘疹(LDHCP)；下颌骨肢端发育异常并A型脂肪营养不良(MADA)；下颌骨肢端发育异常并B型脂肪营养不良(MADB)；Pelger-Huet异常(Pelger-Huetanomaly,PHA)；Pelizaeus-Merzbacher病；或限制性皮肤病(RD)。本文提及“早老”是指引起个体加速老化的病症。所述病症可称为“早老症”，包括：Hutchinson-Gilford早老综合征(HGPS)；Werner综合征；Bloom综合征；Rothmund-Thomson综合征；Cockayne综合征；或着色性干皮病。已报告了LMNA在几种类型的癌症中减量调节(参见Zink等(2004)Nat.Rev.；Wu等(2009)J.Exp.Clin.CancerRes.)。在一些癌症中观察到的核纤层蛋白A表达完全丢失表明核纤层蛋白可用作肿瘤抑制物(J.L.Broers等,AmJPathol1993；S.F.Moss等,Gut1999；R.S.Venables等,BrJCancer2001)。重要的是，核纤层蛋白A/C表达的减量调节与癌症侵袭性和预后差相关(E.J.Belt等,Europeanjournalofcancer2011；N.D.Willis等,PLoSOne2008；N.D.Willis等,BiochemSocTrans2008)。内核膜上功能性纤层的丢失显示促进癌细胞的畸形核。然而，核纤层蛋白A/C表达降低与可更容易挤入小血管的较软的核有关，这可能有助于提高这些癌细胞的侵袭潜力。为此，由于本发明的化合物能够改善核纤层蛋白A/C耗减细胞的核形状，故应了解本发明的化合物也可用于治疗这些癌症。实际上，较高剂量的化合物降低癌细胞侵袭和迁移以及细胞增殖，特别在表达低水平的核纤层蛋白A/C的癌细胞中。可通过本文所述化合物治疗的癌症类型的实例包括但不限于乳腺癌、肠癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或黑素瘤。该化合物还可靶向癌干细胞。本文所用术语“药物”是指用于治疗、治愈或改善疾病或治疗、改善或缓解疾病的症状的药物制剂。药物制剂包含对其所给予的受试者是无害形式的药理活性成分和经设计以稳定活性成分并影响其进入循环或靶组织的吸收的其它组分。在一个实施方案中，本文所述药物为人用药物。应认识到本文提及“治疗”延展到复发的预防、防止和症状(不论轻度、中度还是重度)的抑制或改善以及已确诊病况的治疗。药物组合物按照又一个方面，本发明提供包含本发明的化合物以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症。在与组合物的其它成分相容且对其接受者无害的意义上，载体、稀释剂和/或赋形剂必须是“可接受的”。本发明的化合物还可与一种或多种另外的活性成分联用。在又一方面，本发明因此提供包含本发明的化合物或其药学上可接受的衍生物以及一种或多种另外的活性成分的组合。当本发明的化合物或其药学上可接受的衍生物与针对同一疾病状态的一种或多种另外的活性成分联用时，各种化合物的剂量可不同于当单独使用该化合物时的剂量。本领域技术人员应容易地了解合适的剂量。应认识到用于治疗所需的本发明化合物的量将随待治疗的病况的性质和患者的年龄和状态而变化，并且最终将由主治医生或兽医斟酌决定。一种或多种另外的活性成分可为用于治疗或预防核纤层蛋白病、早衰症、正常老化或癌症的活性成分。所述活性成分的合适的非限制性实例包括：普伐他汀、唑来膦酸、雷帕霉素、法呢基转移酶抑制剂例如氯那法尼等。可方便地提供上文提及的组合用于药物制剂的形式中，因此包含上文规定的组合以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物制剂包括本发明的又一个方面。所述组合的各个成分可通过任何方便的途径以单独的或组合的药物制剂序贯或同时给予。当给药是序贯时，可先给予本发明的化合物或一种或多种另外的活性成分。当给药是同时时，可在相同或不同的药物组合物中给予所述组合。当在同一制剂中混合时，应认识到两种化合物必须稳定并且彼此且与制剂的其它组分相容。当单独配制时，它们可以任何合适的制剂、以本领域对于所述化合物是已知的方式方便地提供。给药本发明的化合物可作为未加工的化学品给予，但活性成分优选作为药物制剂提供。本发明的化合物可以常规剂型给予，所述剂型可按照本领域众所周知的常规程序，通过将本发明的化合物与标准药用载体或稀释剂混合来制备。这些程序可包括混合、制粒和适当时将成分压制或溶解成所需制剂。可配制本发明的药物组合物用于通过任何途给药，包括呈适于口服、局部或胃肠外给予哺乳动物(包括人)的形式。组合物可呈片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、锭剂、乳膏剂或液体制剂(例如口服或无菌胃肠外溶液剂或混悬剂)的形式。本发明的局部制剂可作为例如软膏剂、乳膏剂或洗剂、眼用软膏剂和滴眼剂或滴耳剂、浸透敷料剂和气雾剂提供，并且可含有合适的常规添加剂例如防腐剂、促进药物渗透的溶剂及软膏剂和乳膏剂中的软化剂。制剂还可含有相容的常规载体，例如乳膏或软膏基料和用于洗剂的乙醇或油醇。所述载体可以制剂的约1%直到约98%存在。更通常它们可构成高达制剂的约80%。用于口服给药的片剂和胶囊剂可为单位剂量呈现形式，并可含有常规赋形剂例如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨糖醇、西黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂，例如马铃薯淀粉；或可接受的润湿剂例如十二烷基硫酸钠。片剂可按照正常药学实践众所周知的方法包衣。口服液体制剂可呈例如水性或油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式，或可作为干制品提供用于用前与水或其它合适的溶媒复溶。所述液体制剂可含有常规添加剂，例如助悬剂例如山梨糖醇、甲基纤维素、葡萄糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪、乳化剂例如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或阿拉伯树胶；非水性溶媒(其可包括食用油)，例如杏仁油、油性酯例如甘油、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，且需要时，常规矫味剂或着色剂。栓剂可含有常规栓剂基料，例如可可脂或其它甘油酯。对于胃肠外给药，液体单位剂型使用化合物和无菌溶媒(优选为水)制备。根据所用的溶媒和浓度，可将化合物悬浮或溶于溶媒中。在制备溶液剂时，可将化合物溶于注射用水中，过滤除菌后装入合适的小瓶或安瓿中并密封。有利的是，可将例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂等作用剂溶于溶媒中。为了提高稳定性，可将组合物装入小瓶中后冷冻，并真空除水。然后将干的冻干粉在小瓶中密封，并可提供附带的注射用水小瓶以在用前重配液体。胃肠外混悬剂以大致相同的方式制备，只是将化合物悬浮于溶媒而不是溶解，且灭菌不能通过过滤完成。可通过在悬浮于无菌溶媒中之前暴露于环氧乙烷中使化合物灭菌。有利的是，表面活性剂或润湿剂包括在组合物中以促进化合物的均匀分布。根据给药方法，组合物可含有0.1%重量、例如10-60%重量的活性物质。当组合物包含剂量单位时，各单位可含有例如5-1000mg活性成分。根据给药途径和频率，用于成人治疗的剂量的范围可为10-3000mg/天。对于口服给药，典型剂量的范围可为50-1500mg/天，例如120-1000mg/天。本领域技术人员应认识到，本发明化合物的最适量和各剂量的间隔将取决于待治疗的病况的性质和程度、给药的形式、途径和部位及待治疗的具体哺乳动物，且所述最适可通过常规技术确定。本领域技术人员还应认识到，最适疗程，即对于确定的天数，每天给予的本发明化合物的剂量数目可由本领域技术人员采用常规疗程确定试验确定。所有的出版物，包括但不限于本说明书引用的专利和专利申请均通过引用结合到本文中，好像每个个别的出版物具体而单独指明通过引用结合到本文中，就像全文给出一样。实施例通过下面的实施例对本发明进行说明。在下面的程序中，在各起始原料后，通常提供通过编号提及的描述或实例。这仅仅为协助化学技术人员而提供。起始原料不一定从所提及的批次制备。当提及使用“类似”程序时，正如本领域技术人员应了解的，所述程序可包括少量变化，例如反应温度、试剂/溶剂量、反应时间、后处理条件或色谱纯化条件。所有的溶剂和试剂采用标准技术纯化或按市售来源(Sigma-Aldrich)供应的使用。NMR谱使用氘化溶剂以300K在Bruker500MHz仪中获得。1HNMR谱峰裂图样的注释包括：单峰(s)，双峰(d)，三峰(t)，宽峰(br)和多重/重叠峰(m)。信号引述为δ值(单位ppm)，耦合常数(J)引述为赫兹。在Micromass®Q-Tof(ESI)光谱仪中记录质谱。一般程序将合适的酮或醛以0.5M的终浓度溶于异丙醇中，在等摩尔量的氨基硫脲存在下回流24小时。相应的缩氨基硫脲经过滤分离，并从热乙醇中重结晶。将等摩尔量的缩氨基硫脲和所需的卤代酮以0.2M的终浓度在室温下在异丙醇中搅拌过夜。将所得产物从热乙醇中重结晶几次，得到纯产物，无需进一步纯化便可使用。化合物14-(4-氰基苯基)-2-(2-亚环戊基肼基)噻唑(Remodelin)将2-亚环戊基肼-1-硫代甲酰胺(carbothioamide)(其可按上文流程2所述制备)(1g，4.46mmol)和2-溴-4’-氰基乙酰苯(其可按上文流程1所述制备)(700mg，4.45mmol)在12ml异丙醇中在室温下搅拌过夜。沉淀经过滤，并从热乙醇中重结晶，得到所需化合物的氢溴酸盐(559mg，1.98mmol，45%)，为浅黄色针状物。将其以10mg/mL的浓度重悬浮于DMSO中用于细胞测定法。1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ12.11(brs),7.84(d,J=9.0Hz,2H),7.81(d,J=9.0Hz,2H),6.84(s,1H),2.61(t,J=9.0Hz,2H),2.51(t,J=9.0Hz,2H),1.94–1.80(m,4H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)：δ173.8,169.5,138.8,133.5,131.3,126.3,118.0,114.1,103.8,33.7,31.2,25.2,25.0；HRMS(m/z)：[M]+对于C15H15N4S，计算为283.1009；实测为283.1017。化合物24-(4-氯苯基)-2-(2-亚环戊基肼基)噻唑盐酸盐将氨基硫脲(20g，220mmol)和环戊酮(19.43ml，220mmol)在500ml异丙醇中回流24小时。沉淀经过滤，从热乙醇中重结晶，得到相应的缩氨基硫脲(2-亚环戊基肼-1-硫代甲酰胺)，为浅黄色晶体。将2-亚环戊基肼-1-硫代甲酰胺(10g，63mmol)和2,4’-二氯乙酰苯(12g，63mmol)在300ml异丙醇中在室温下搅拌过夜。沉淀经过滤，并从热乙醇中重结晶，得到所需化合物的盐酸盐(16g，48mmol，77%)，为浅黄色针状物。将其以10mg/mL的浓度重悬浮于DMSO中用于细胞测定法。光谱数据与之前描述于文献的数据一致(F.Chimenti等,(2009)J.Med.Chem.52,530)。化合物34-(4-氯苯基)-2-(2-亚环戊基-1-(丙-2-炔-1-基)肼基)噻唑向化合物2(1g，3mmol)在新蒸馏的DMF(75ml)溶液中加入K2CO3(1.375g，10mmol)、三乙胺(1.4ml，10mmol)和炔丙基溴(1.2ml，5mmol，80wt%在甲苯中)。在室温下12小时后溶液变紫。加入炔丙基溴(1.2ml)，再搅拌反应混合物12小时。然后溶剂经减压蒸发，将粗制残余物溶于CH2Cl2中，用NH4Cl和NaCl的饱和溶液洗涤几次，经MgSO4干燥。溶剂经减压蒸发，在常规柱色谱法后得到所需产物(0.35g，1mmol，34%)，为褐色油状物。TLC(己烷：CH2Cl2，80:20)：Rf=0.25；1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ7.78(d,J=8.0Hz,2H),7.32(d,J=8.0Hz,2H),6.86(s,1H),4.65(s,2H),2.64–2.55(m,4H),2.22(s,1H),1.86–1.82(m,4H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)：δ184.9,171.8,150.6,133.4,133.3,128.6(2C),127.3(2C),105.2,78.3,72.5,42.7,33.8,31.5,24.9,24.4；HRMS(m/z)：[M]+对于C17H16ClN3S，计算为329.0758；实测为329.0747。应了解，化合物4-12按与上述化合物1-3类似的方式制备：化合物134-(4-三氟甲基苯基)-2-(2-亚环戊基肼基)噻唑氢溴酸盐将2-亚环戊基肼-1-硫代甲酰胺(3.0g，18.7mmol)和2-溴-4’-(三氟甲基)乙酰苯(5.0g，18.7mmol)在异丙醇(150mL)中在室温下搅拌24小时。沉淀经过滤，从热乙醇中重结晶3次，得到标题化合物的氢溴酸盐，为嫩黄色针状物(1.5g，3.7mmol，20%)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ11.12(brs,2H),7.80(d,J=8.5Hz,2H),7.65(d,J=8.5Hz,2H),6.87(s,1H),2.53(t,J=7.0Hz,2H),2.47(t,J=7.0Hz,2H),1.93–1.75(m,4H)。13CNMR(75MHz,CDCl3)δ171.9,169.4,140.3,131.8(q,J=32.0Hz),131.6,126.5(brq,J=3.5Hz,2C),126.1(2C),123.7(q,J=274.0Hz),103.5,33.5,30.6,25.1,24.9。HRMS(m/z)：[M+H]+对于C15H15F3N3S，计算为326.0933；实测为326.0950。应了解，化合物14-21可按与上述化合物1-3和13类似的方式制备：实验数据材料与方法细胞培养和转染使U2OS和SaOS-2骨肉瘤细胞、HeLa宫颈癌细胞、A431黑素瘤细胞、NCI-SNU5胃癌细胞、MRC-5肺成纤维细胞和Werner综合征患者来源的SV40成纤维细胞在补充10%胎牛血清(BioSera)、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μgml-1链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma-Aldrich)中生长。正常皮肤原代成纤维细胞GM03440和HutchinsonGilford早老综合征(HGPS)皮肤原代成纤维细胞AG11498和AG06297购自CoriellCellRepositories，并分别在传代数9-12和20-23间使用。使细胞在如上补充的DMEM中生长。使RPE-1视网膜色素上皮细胞在如上补充并用碳酸氢钠缓冲的DMEM和HamF12混合培养基中生长。使HMV-II黑素瘤细胞系、22RV1前列腺癌细胞、NCI-H82和NCI-H69肺癌细胞和NCI-N87胃癌细胞系在如上补充的RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich)中生长。使稳定转染的U2OS细胞在含有1mgml-1G418(Invitrogen)的标准培养基中维持。siRNA双链体获自LifeSciences：核纤层蛋白A/CstealthRNAi：CCAUGAAGGAGGAACUGGACUUCCA(SEQIDNO:1)和GCGUGAGGAGUUUAAGGAGCUGAAA(SEQIDNO:2)、NAT10stealthRNAi：GAGCAUGGACCUCUCUGAAUACAUA(SEQIDNO:3)，作为对照siRNA，使用stealthRNAi阴性对照双链体。按照生产商说明书，分别使用Lipofectamine2000和LipofectamineRNAiMax(LifeSciences)进行质粒DNA和siRNA转染。在转染后48-72小时分析细胞。药物处理将下列KAT和KDAC抑制剂用于核形状拯救筛选中，将细胞与所述分子孵育16小时：曲古抑菌素A(1μM)、丁酸钠(5mM)、tubacin(10μM)、SAHA(5μM)、姜黄色素(10μM)、藤黄醇(50μM)、漆树酸(1μM)、MB-3(5μM)、4-(4-氯苯基)-2-(2-亚环戊基肼基)噻唑(化合物2)(50μM)、4-(4-氯苯基)-2-(2-亚环戊基-1-(丙-2-炔-1-基)肼基)噻唑(化合物3)(50μM)和亚环戊基-[4-(4-氰基苯基)噻唑-2-基)肼(化合物1)(Remodelin)(10-50μM)。对于HGPS细胞适合度测定法，使1μM的Remodelin温育1-10天，每3天更新培养基。对于长期老化测定法，使细胞在含有1μMRemodelin或仅DMSO的培养基中保持并传代12次群体倍增。使用来自CellSignaling的老化β-半乳糖苷酶染色试剂盒#9860(Senescenceβ-GalactosidaseStainingKit#9860)，在Remodelin处理8天后当细胞处于群体倍增12时，然后在Remodelin处理几周，当细胞达到群体倍增24时，对老化进行评价。分别使用200ng/ml、1μg/ml和1μM的诺考达唑、秋水仙素和拉春库林A(Sigma-Aldrich)。使用5μg/ml的阿非迪霉素(Sigma-Aldrich)持续16小时。法呢基转移酶抑制剂FTI-277购自TocrisBioscience并以5μM使用。ATMi(KU55933)和ATRi(ATR-45)分别获自TocrisBioscience和OhioStateUniversity，并以10μM和500nM使用。使用10μM的Pifithrinα(Sigma-Aldrich)。GFP-H2B细胞的实时成像将U2OS细胞用siLMNA转染48小时后加入50μM的(化合物2)。用配备100xUPlanSApo/1.40油浸物镜(Olympus)并用SoftWoRx软件(AppliedPrecision)控制的DeltavisionPersonalDV(AppliedPrecision，512x512CoolSNAPHQ2摄影机)，以0.2μm间隔的z-堆栈，每15分钟拍摄照片持续16小时。然后用ImageJ软件从图像中剪辑影片。流式细胞术按指定，使10μMEdU温育2小时。将细胞在4%低聚甲醛(Sigma-Aldrich)中固定。使用Click-iT®EdU流式细胞术测定试剂盒(LifeSciences)，对EdU进行荧光标记。在含有0.1%Triton-X-100和0.5mgml-1无DNA酶的RNA酶A(DNasefreeRNaseA)(Sigma-Aldrich)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，将DNA用50mgml-1碘化丙锭(Sigma-Aldrich)染色。使样品通过配备CellQuest软件的FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson)处理。应用FlowJo软件(TreeStar)分析结果。核圆度和核面积定量测定使用“objectsizeshape”度量，应用CellProfiler软件以量化来自DAPI染色照片的核圆度和核面积。AreaShape度量允许计算相当于圆度的形状因子指数(4×π×面积/周长2)(形状因子为1反映出完整的圆)以及计算核面积。增殖测定法将HGPS细胞以相同数目接种到24孔培养皿中。次日，将Remodelin(1μM)或小分子化合物2(1-10μM)加入孔中，将板转移到IncuCyte显微镜(EssenBioScience)中。在几天内每2小时拍摄相差照片。细胞汇合的百分比通过CellPlayer集成软件(EssenBioScience)计算，并用GraphPadPrism®软件分析。从人细胞中纯化蛋白质HEK293细胞用NAT10构建体瞬时转染，在48小时后收获在PBS中。使细胞在新补充50U/mlbenzonase和无EDTA蛋白酶抑制剂混合剂(Roche)的IP裂解缓冲液(20mMTrispH7.5、40mMNaCl、2mMMgCl2、0.5%NP-40)中在室温下裂解5分钟。在该最初的裂解步骤后，将NaCl浓度调节至450mM，并使样品在4℃下旋转孵育。通过离心使裂解物澄清(13,200rpm，在4℃下20分钟)，在回收后，使NaCl浓度平衡至150mM。在补充蛋白酶抑制剂的IP缓冲液(25mMTrispH7.5、150mMNaCl、1.5mMDTT、10%甘油、0.5%NP-40)中将裂解物用于免疫沉淀反应。靶蛋白用与蛋白A/G-Dynabeads(LifeSciences)偶联的抗FLAG抗体(M2，Sigma-Aldrich)俘获。将复合物用含有递增量的NaCl(250mM、500mM和1M)的IP缓冲液洗涤。之后，将免疫复合物在含有递减量的NaCl(1M、500mM、250mM和150mM)的TBS中洗涤。此时，洗脱使用过量的三重-Flag肽(SigmaAldrich)进行。将洗脱的蛋白质加载至凝胶上，纯化通过银染(SilverQuestkit，LifeSciences)证实。可溶性微管蛋白或多聚化微管蛋白的分析将用5μMRemodelin预处理16小时或用10μM诺考达唑预处理8小时的U2OS细胞在MT稳定缓冲液(MSB)(85mMPIPES[pH6.9]、1mMEGTA、1mMMgCl2、2M甘油、含4μg/ml泰素的0.5%Triton)中裂解。将裂解物保持在4℃下2分钟，然后以13,000rpm离心10分钟。将表示蛋白质的可溶性部分的上清液转移到管中，加入Laemmli缓冲液。将表示蛋白质的多聚化部分的沉淀在不含Triton的MSB中洗涤一次，然后重新悬浮于Laemmli缓冲液中。将等量的裂解物加载到梯度凝胶中。微管再生长测定法在siRNA转染后48小时，通过在用或不用5-10μMRemodelin预处理16小时的细胞中在4℃下冷处理1小时使微管解聚。将冷的培养基用预热的培养基更换，使细胞在37℃下孵育5或15分钟以分别允许微管成核和锚定。按免疫荧光程序中所述将细胞在PFA中固定，并用抗α-微管蛋白抗体染色。免疫印迹如下制备总细胞提取物：通过在SDS裂解缓冲液(4%SDS、20%甘油和120mMTris-HCl，pH6.8)刮擦细胞，在95℃下煮沸5分钟，接着通过25号针10个冲程。在加载前，将裂解物用0.01%溴酚蓝和200mMDTT的溶液稀释，并在95℃下煮沸5分钟。将蛋白质在4-12%梯度凝胶(NUPAGE，LifeSciences)上通过SDS-PAGE分离，并转移到硝基纤维素膜(Protran；Whatman)上。与IRDye荧光团偶联的第二抗体来自LI-CORBiosciences。检测和量化用成像仪(Odyssey；LI-CORBiosciences)进行。免疫荧光细胞用PBS洗涤，并用含2%PFA的PBS固定20分钟。细胞用PBS/0.2%TritonX-100透化5分钟，并用含有5%BSA的PBS/0.2%Tween20(PBS-T)封闭。使盖玻片与第一抗体一起孵育1小时，并与AlexaFluor488或594荧光团(LifeTechnologies)偶联的合适的第二抗体一起孵育30分钟后，用2μg/mlDAPI孵育。用FluoView1000共焦显微镜(Olympus)拍摄照片。对于高分辨成像，用两者都配备了100xUPlanSApo/1.40油浸物镜(Olympus)并用SoftWoRx软件(AppliedPrecision)控制的DeltavisionPersonalDV(AppliedPrecision，1024x1024CoolSNAPHQ2摄影机，0.2μm间隔的z-堆栈)或常规模式的DeltavisionOMXV3(AppliedPrecision，512x512CascadeII摄影机(Photometrics)，0.125μm间隔的z-堆栈)，获取z-堆栈。然后用保守模式的SoftWoRx(AppliedPrecision)进行去卷积。顺序获取不同的信道。可点击分子的荧光标记如上所述，将细胞用可点击分子化合物3或参比化合物A(1-氯-4-乙炔苯(ethynilbenzene)，购自Sigma-Aldrich)一起预孵育2小时后固定并透化。点击反应物使用含Alexafluor488Azide的InvitrogenClick-iT试剂制备，并避光与固定的细胞一起孵育1小时。在用另一种蛋白质共标记的情况下，在抗体孵育前进行点击反应。抗体用于该研究的抗体为：微球菌核酸酶消化敏感性测定法1x106细胞经胰蛋白消化，收获，并用1ml1xRSB缓冲液(10mMTris，pH7.6、15mMNaCl和1.5mMMgCl2)洗涤一次。在离心(3,00xg)后，将细胞沉淀重新悬浮于1ml含1%Triton-X100的1xRSB缓冲液中，通过用松动配备的玻璃杵5个冲程匀浆以释放核。核通过离心(13,000xg)收集，并用1ml缓冲液A(15mMTris，pH7.5、15mMNaCl、60mMKCl、0.34M蔗糖、0.5mM亚精胺、0.15mM精胺、0.25mMPMSF和0.1%β-巯基乙醇)洗涤两次。将核重新悬浮于缓冲液A中，等分成100μl等分试样。将1.2μl0.1MCaCl2加入各等分试样中，核通过加入0.25μl200U/mlMNase(Sigma-Aldrich)来消化，在30℃下孵育。在不同的时间点将各等分试样放回冰上，通过加入3μlEDTA立即终止消化。DNA使用QiagenPCR纯化试剂盒纯化，将1500ngDNA在1.5%琼脂糖凝胶上进行分析。消化概况应用ImageJ分析，并相对于各泳道的总密度调节值以抵销DNA加载变化。赖氨酸乙酰转移酶(KAT)测定法使用自HEK293细胞纯化的NAT10和5μg富含猪微管蛋白(Tebu-bio)的纯化的MAP作为底物，使用荧光HAT测定试剂盒(ActiveMotif)进行KAT测定法。使用50μM的Remodelin和可点击分子2。圆二色(CD)光谱法CD实验采用Chirascan圆二色光谱仪(AppliedPhotophysics，UK)进行。在TBS0.1%NP-40(Sigma-Aldrich)中终浓度为10μM的200μl纯化的FLAG-NAT10装入光程长度为1mm的石英杯中，转移到光谱仪中。在25℃下在180-350nm的波长范围内以1秒钟响应时间、1nm间距(pitch)和1.5-nm带宽记录CD扫描。加入溶于DMSO的化合物2，在记录扫描前，将溶液孵育5分钟。CD光谱是缓冲液扣减的，在300nm下零校正，并归一化(摩尔椭圆率θ以105degcm2dmol−1引用)。DNA操作所有DNA构建体通过DNA测序被证实为没有突变。下面提供用于该研究的DNA寡核苷酸清单。pICE-FLAG通过将退火引物FLAG-S和FLAG-AS克隆至HindIII-和BamHI消化的pICE(一种新的赋予哺乳动物细胞嘌罗霉素抗性的合成质粒)中而产生(BrittonS,CoatesJ,JacksonSP.JCellBiol.2013)。为了产生对NAT10siRNA有抗性的NAT10cDNA，使用引物对NAT10-F和NAT10-siR-R或NAT10-siR-F和NAT10-R，从IMAGE克隆5166101(SourceBioscience)扩增NAT10cDNA。使用引物NAT10-F和NAT10-R，通过PCR使所得PCR产物融合在一起。将所得PCR产物用BamHI和MluI消化并克隆至用相同的限制性内切酶消化的pICE-FLAG中。为了产生pICE-FLAG-NAT10-G641E，按照生产商说明书并使用引物NAT10-G641E-F和NAT10-G641E-R，使用QuickChange位点定向诱变试剂盒(AgilentTechnologies)将G641E突变引入pICE-FLAg-NAT10中。表1:DNA寡核苷酸清单用于蛋白质牵出测定的小分子使用市购可得的O-(2-氨基乙基)-O’-(2-叠氮基乙基)七乙二醇和(+)-生物素N-羟基琥珀酰亚胺，从化合物3(“生物素化化合物3”)合成生物素化衍生物。化合物3(“PEG4生物素化化合物3”)和对照参比化合物A(“PEG4生物素化化合物A”)的其它生物素化衍生物通过在细胞提取物中加入PEG4甲酰胺-6-叠氮基己烷基生物素(LifeSciences)和点击试剂而原位产生。生物素化小分子牵出将细胞收获在PBS中，在补充1mMPMSF和蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液中在4℃下旋转裂解30分钟。通过以16,000xg离心10分钟收集上清液。然后将上清液与40μM生物素化小分子(生物素化化合物3)或用于竞争实验与200μM(化合物2)和40μM(生物素化化合物3)一起孵育2小时。将链霉抗生物素包被的磁珠(DynabeadsM-280Streptavidin，LifeSciences)用结合缓冲液(25mMTris.HCl、150mMNaCl、0.1%Triton)洗涤3次，与上清液在4℃下旋转孵育1小时。磁珠用结合缓冲液洗涤3次，接着在Laemmli缓冲液中煮沸5分钟以洗脱出蛋白质。然后将样品加载到4-12%梯度凝胶(NUPAGE，LifeSciences)上，通过银染(SilverQuest染色试剂盒，LifeSciences)分析，切割特异性条带，并通过LC-MS/MS分析。可点击小分子牵出PEG4生物素化化合物3从化合物2、市购可得的O-(2-氨基乙基)-O’-(2-叠氮基乙基)七乙二醇和(+)-生物素N-羟基琥珀酰亚胺合成，之后与细胞提取物一起孵育(用于牵出和质谱分析)。生物素化化合物3和PEG4生物素化化合物A从化合物2和3原位产生，在活细胞中预孵育2小时后，在细胞提取物中加入市购可得的PEG4甲酰胺-6-叠氮基己烷基生物素和点击试剂(用于点击-牵出和蛋白质印迹验证)。如下将点击反应试剂加入细胞裂解物中：10μM生物素叠氮化物(PEG4甲酰胺-6-叠氮基己烷基生物素，LifeSciences)、10mM抗坏血酸钠(Sigma-Aldrich)、2mMCuSO4(LifeSciences)。将点击反应物在4℃下避光旋转孵育1小时。然后如上所述将链霉抗生物素珠粒孵育1小时，洗脱样品，并加载到凝胶上后，进行免疫印迹法。结果实施例1：通过KAT抑制剂拯救核形状因为核纤层蛋白蛋白质起维持核结构和将染色质锚定在核边缘的支架的作用(J.Gotzmann,R.Foisner(1999)Crit.Rev.Eukaryot.GeneExpr.9,257)，所以小干扰RNA(siRNA)介导的核纤层蛋白A/C的耗减(siLMNA)在不同的人细胞系中引起核形状缺陷(图1A，B和图2A，B)。值得注意的是，发现核纤层蛋白A/C耗减还与总的染色质松弛有关，如通过微球菌核酸酶(MNase)敏感性增强和核面积增加所观察到的(图1B，C)。因此，据推理，核纤层蛋白A/C耗减细胞中染色质的再压实可改善其一些核结构缺陷。赖氨酸乙酰转移酶(KAT)和赖氨酸脱乙酰酶(KDAC)具有调节组蛋白和其它蛋白质的乙酰化状态的能力，因此影响总的染色质组织。因此，在siLMNA细胞的染色质压实和核形状上，对已知抑制各KAT或KDAC酶的活性的各种天然和合成小分子(参见材料与方法)的作用进行了评价。这将KAT抑制剂4-(4-氯苯基)-2-(2-亚环戊基肼基)噻唑(化合物2)(F.Chimenti等,(2009)J.Med.Chem.52,530)(图1D)鉴定为在不同的核纤层蛋白A/C耗减细胞系中完全恢复核形状和圆度(图1E、F和图2A-D)。尽管在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中最初被鉴定为GCN5网抑制剂的小分子化合物2(F.Chimenti等,(2009)J.Med.Chem.52,530)，经典的GCN5抑制剂MB-3(M.Biel等(2004)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.43,3974)不改善siLMNA细胞的核圆度(图1F)，表明了小分子依赖性核形状拯救不依赖于GCN5抑制。分子化合物2还改善siLMNA细胞的总的染色质致密度，如MNase敏感性降低(图1G)和核面积减少(图1H)所观察到的。通过使用表达GFP标记的组蛋白H2B的细胞(GFP-H2B)，通过实时成像观察到，siLMNA细胞的完全核形状拯救发生在用化合物2处理的12小时内，独立于有丝分裂(图1I和图3)且不显著影响细胞周期概况(图1J和图2E)。然而，化合物2改善显示核纤层蛋白A/C表达降低的几个癌细胞系的核形态(图2F，G)，这表明所观察到的作用不是siRNA介导的核纤层蛋白A/C耗减所特有的。实施例2：通过化合物2的化学标记鉴定蛋白质靶标为了鉴定分子化合物2的推定的生物学靶标并阐明改善核形态的机制，建立了基于分子的策略，其包括借助“点击化学”进行分子的细胞官能化以找到并验证药物相关蛋白质复合物。为此，策略性地将炔基引入化合物2的腙部分中，从而产生显示与化合物2(图4B)同等细胞活性的“可点击”类似物化合物3(图4A)，并使用无活性可点击分子参比化合物A作为阴性对照(图4A，B)。虽然炔部分在生物学上是惰性的，但它可在铜暴露时与携带叠氮基的任何分子选择性地反应(V.V.Rostovtsev等(2002)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.41,2596)，因此允许在细胞中标记小分子(图4C)。作为第一步，产生化合物3的生物素化衍生物(生物素化化合物3)(图4D)，并与细胞提取物一起孵育。然后与生物素化化合物3缔合的蛋白质用链霉抗生物素珠粒找回，并通过凝胶电泳分离(图4E)。在进行竞争实验期间，鉴定出其染色强度在过量的竞争化合物2存在下降低的几种蛋白质类别。然后根据此竞争标准从凝胶上切割与生物素化化合物3选择性相互作用的蛋白质，并通过质谱法(LC-MS/MS)鉴定。引人注目地，N-乙酰转移酶10(NAT10)是通过上述程序鉴定的唯一KAT蛋白(参见表2)，因此是化合物2的唯一可能相关的靶标。表2：化合物2的生物素类似物牵出乙酰转移酶蛋白质NAT10。通过小分子生物素化化合物3找回并通过液相色谱法-串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定的具体蛋白质命中(hit)。进一步强调其作为化合物2的生物相关靶标的潜力，注意到之前已将NAT10与SUN1核被膜蛋白关联(Y.H.Chi等(2007)J.Bio.Chem.282,27447)，最近显示其耗减拯救LMNA耗减细胞中的核形状(C.Y.Chen等(2012)Cell149,565)，并且表明NAT10的KAT活性针对微管和组蛋白底物(Shen等(2009)Exp.CellRes.315,1653)。为了证实NAT10和化合物2之间的相互作用，将细胞与可点击生物活性类似物化合物3或非生物活性对照参比化合物A一起预孵育以允许其与活细胞中的蛋白质靶结合。接下来，通过加入含有生物素的接头使分子官能化，然后使用链霉抗生物素珠粒找回结合的蛋白质。该分析显示化合物3但非参比化合物A特异性地找回NAT10(图4F)，从而证实NAT10在活细胞的情况下是化合物2的靶标，并表明这个方案选出特异性蛋白质配偶体而无需使用光交联剂(S.E.Ong等(2009)PNAS106,4617；X.Li,T.M.Kapoor(2010)J.Am.Chem.Soc.132,2504)。在平行研究中，将细胞用化合物3或参比化合物A处理，固定，然后将化合物3用荧光团官能化(R.Rodriguez等(2009)Nat.Chem.Biol.8,301)以允许通过高分辨显微镜术显现其亚细胞分布(图4G)。重要的是，虽然针对无活性的对照参比化合物A几乎没有或没有观察到细胞染色(图5A)，但在核中有主要蓄积的化合物3，以及在核周边和胞质中有一些染色(图4G和图5A)。此外，观察到标记的化合物3和NAT10染色的显著重叠，进一步证实了亲和力牵出研究。与这些观察结果一致，siRNA介导的NAT10耗减(图4G，下图)导致核中分子化合物3蓄积的显著减少(图4G)而不改变核仁构造。总的来说，这些数据证实NAT10在细胞中是化合物2的特异性靶标。为了评价化合物2和NAT10之间的相互作用是否是直接的，将自人HEK293细胞纯化的NAT10(图4H，左图)用化合物2滴定，而NAT10构象通过圆二色谱学监测(图4H，右图)。在不存在化合物时，NAT10谱在210nm处显示特征性负信号，反映出α-螺旋的存在。在加入化合物2时，观察到绝对摩尔椭圆率以浓度依赖性方式明确增加，与通过超分子钉住(supramolecularstapling)(一种使人联想起之前描述的共价分子内钉住(covalentintramolecularstapling)的方法)稳定蛋白质一致(R.E.Moellering等(2009)Nature462,182)。这些数据显示化合物2和NAT10之间的直接物理相互作用，并且表明通过分子稳定的蛋白质折叠可抑制NAT10活性。在我们的分析期间，发现化合物2在暴露于光或空气时快速降解。为此并且为了试图鉴定更有效的分子，研究了化合物2的结构变体以不同的剂量拯救LMNA耗减细胞的核形状的能力。这揭示了虽然中心的噻唑腙核是核形状拯救所必需的，但环戊烷环可大大改变，而仅细微的芳族修饰是容许的(图6A)。因此这些研究鉴定出在对位含有氰基官能团的化合物1(图4I)为该系列最有效和稳定的类似物，与化合物2相比具有5倍的功效改进(图6B)。基于其重塑siLMNA细胞的核结构的能力，该类似物被命名为“Remodelin”，并用于下列实验。实施例3：NAT10抑制介导核形状拯救上述研究表明Remodelin和相关化合物可通过NAT10打靶逆转核纤层蛋白A/C耗减细胞的核形状。为了探索该构思，使人U2OS细胞中的NAT10和核纤层蛋白A/C共耗减(图7A)。这引人注目地揭示了与用Remodelin观察到的作用相当，NAT10耗减完全拯救由核纤层蛋白A/C耗减引起的核形态缺陷(图7B；在RPE-1和HeLa细胞中观察到类似作用)。由于发现分子化合物2(Remodelin的类似物)为KAT抑制剂，因此评估了NAT10乙酰转移酶活性是否被Remodelin改变，以及是否参与核纤层蛋白A/C耗减细胞的核形状拯救。为此，利用Phyre2在线服务器(L.A.Kelley,M.J.Sternberg(2009)Nat.Protoc.4,363)，从其高度保守的细菌同系物TmcA的结构产生人NAT10的区域10-917的3D模型(Chimnaronk等(2009)Embo.J.28,1362)(图7C，D)。然后通过将该模型与同Ac-CoA复合的最初的TmcA结构进行比对，来预测乙酰辅酶A结合的部位(图7D)。然后使保守的Gly641突变成Glu(G641E)(图8A)，预测这将阻断NAT10乙酰转移酶活性(图7D，右)。实际上，从人HEK293细胞表达和纯化的野生型(WT)和G641E突变体(MUT)NAT10蛋白的生物化学测定(图8B)显示G641E突变破坏NAT10KAT活性(图7E)。此外，在这些反应中加入Remodelin或可点击生物活性化合物3破坏NAT10WTKAT活性，揭示了Remodelin是NAT10抑制剂。为了研究NAT10KAT活性在控制核形状中的功能，产生了表达siRNA抗性NAT10WT或G641E构建体的稳定细胞系。鉴于两种蛋白质的正确表达和亚细胞定位(图8C，D)，使核纤层蛋白A/C和内源NAT10蛋白质共耗尽，并对核形状形态学进行了研究。引人注目地，虽然核纤层蛋白A/C耗减在表达NAT10WT的细胞中损害核圆度，但这在表达无催化活性的NAT10MUT的细胞中不是这种情况(图7F)。总的来说，这些数据从而证实通过突变或通过Remodelin作用使NAT10KAT活性钝化恢复siLMNA细胞的正常核形态。实施例4：Remodelin靶向NAT10以改善HGPS细胞的适合度发现了Remodelin拯救核纤层蛋白A/C耗减细胞的核形状缺陷，使用来源于携带杂合显性点突变LMNAc.1824C>,p.G608G的HGPS患者的2个原代成纤维细胞系(AG11498和AG06267)，研究了其对LMNA突变细胞的核形状的作用。由于该突变，HGPS细胞表达核纤层蛋白A的永久法尼基化的截短形式(称为Progerin)，其随细胞传代数在核边缘蓄积。这导致核膜折叠和核起泡(图9A)，并且至少部分是造成HGPS患者的早老表型的原因(K.Cao等(2011)J.Clin.Invest.121,2833)。值得注意的是，Remodelin显著减少具有畸形核的HGPS细胞的数目(图9A，B)，并且对培养中老化的原代MRC5成纤维细胞也具有这种作用(图10A，B)，所述细胞在持续传代时也变得畸形并积累Progerin(P.Scaffidi,T.Misteli(2006)Science312,1059)。相比之下，Remodelin对非核纤层蛋白病理Werner综合征细胞的畸形核没有可测出的作用，表明了核形状拯救对核纤层蛋白相关缺陷是特异性的(图10C，D)。法呢基转移酶抑制剂(FTI)已被用于HGPS细胞以防止法呢基化Progerin在核膜上的毒性蓄积。实际上，非法呢基化Progerin远离核被膜重新定位，因此核起泡减少(B.C.Capell等(2005)PNAS102,12879)。为了确定Remodelin是否导致法呢基转移酶抑制，通过蛋白质印迹法检查了核纤层蛋白A加工(图11A)。重要的是，这证实了Remodelin不阻断前核纤层蛋白A切割和成熟，与引起前核纤层蛋白A中间体蓄积的FTI不同。虽然这表明Remodelin不抑制法呢基转移酶活性，但是发现Remodelin和FTI对于核形状改善不起协同作用，表明了它们影响共同的途径(图11B，C)。值得注意地，与对Remodelin所观察到的不同，根据其提议的作用方式，FTI不改善LMNA耗减细胞的核形态。此外，虽然FTI改善HGPS细胞的核形状，但它可能通过FTI处理对不表达Progerin的正常细胞具有相反作用(图11B，C)，所述FTI处理导致未加工的核纤层蛋白A和B的蓄积和不当定位以及中心体脱离缺陷(V.L.Verstraeten等(2011)PNAS108,4997；M.W.Glynn,T.W.Glover(2005)Hum.Mol.Genet.14,2959；Y.Wang等(2012)Nucleus3,452)。相比之下，Remodelin在正常人成纤维细胞中不诱导核形状缺陷；实际上，它在所述成纤维细胞中防止FTI诱导的核形状缺陷(图11B-D)。关键地，在Remodelin处理或NAT10耗减时在HGPS细胞中观察到相当的畸形核数目的减少(图9C和图12A)，导致我们得出结论(对于siLMNA细胞也是这样)：Remodelin所致NAT10抑制是造成HGPS细胞的核形状改善的原因。虽然核形状改善不总是与HGPS细胞表型的总体改善有关(M.X.Ibrahim等(2013)Science340,1330)，但本发明人发现Remodelin改善整体HGPS细胞适合度(正如通过γH2AX和自身磷酸化ATM(未修复DNA双链断裂的标志物)的稳态水平降低和DNA损伤信号转导降低所观察到的)(图9D和图12B，C，F)、改善染色质和核仁组织(正如通过H3K9me3和NAT10染色评价的)和减少核被膜上SUN1蓄积(图12G-I)。Remodelin无可检出地影响siLMNA细胞中SUN1的表达和定位，这意味着由Remodelin所致核形状拯救的机制截然不同于SUN1耗减时所观察到的(C.Y.Chen等(2012)Cell149,565)。引人关注的是，来源于患有埃-德肌营养不良(EDMD)的患者的细胞还显示在Remodelin处理时γH2AX的水平降低(图12D，E)，表明了Remodelin可能对其它类型的核纤层蛋白病具有更广泛的应用。通过顶端DNA损伤反应激酶ATM和ATR阻断信号转导也降低γH2AX(图9E，F)。然而，与Remodelin(其也改善DNA复制(图12J)、提高细胞增殖能力(图9G)并降低老化(图9H，I；从图12K来看应注意，其它KAT抑制剂不降低老化)不同，抑制ATM和ATR减少增殖和诱导老化(图9G，H)。如图12K所示，在p53途径抑制时观察到类似作用。这些数据因此支持以下构想：Remodelin在HGPS细胞中减少DNA损伤的数量，虽然损伤仍存在，但是在ATM/ATR抑制时不再正确地发出信号，导致细胞生长停滞和老化。另外，Remodelin改善HGPS细胞染色质致密度(如通过DAPI染色强度观察到的)(图12G)和核仁组织，而不改变NAT10定位(图12I)。重要的是，Remodelin的这些作用与HGPS细胞的适合度整体加强(如DNA复制增加所观察到的)(图12J)、细胞增殖能力提高(图9G)和老化细胞的比例降低(图9H)有关。突出显示了其长期受益的潜力，发现了甚至在处理几周后Remodelin仍防止HGPS细胞老化(图9I)。实施例5：NAT10抑制改组微管以恢复核形状NAT10主要定位于核仁(一个核区室)，通过研究证实了其在保持整体核组织和核形状的作用，所述研究显示耗减核仁蛋白核磷蛋白(NPM1)、纤维蛋白或SENP5导致核形状改变(M.A.Amin等(2007)Biochem.Biophys.Res.Commun.360,320；A.DiBacco等(2006)Mol.CellBiol.26,4489；M.A.Amin等(2008)Biochem.J.415,345)。在NPM1的情况下，这已被证实通过微管稳定性的变化而发生(G.Wang等(2010)J.Biol.Chem.285,19060)，所述变化然后通过细胞骨架和核被膜的连接来影响核。因为这种情况，并且因为微管蛋白是已知的NAT10底物，所以通过免疫荧光检查细胞的微管网，并在Remodelin处理时观察到显著的重构。此外，通过使用细胞补体系统，证实了相当的微管重构通过NAT10耗减或通过NAT10催化结构域的突变失活而被触发(图13A)。按照通过Remodelin处理或NAT10抑制在微管改组和核形状拯救之间有功能连接，微管破坏药物诺考达唑和秋水仙素也拯救siLMNA细胞(图13B)和HGPS细胞(图14A)的核形状缺陷，而拉春库林A，一种肌动蛋白聚合的抑制剂，增加核变形(图13B)。这些结果因此表明微管但非肌动蛋白细胞骨架重构在核纤层蛋白A/C耗减的情况下可拯救核形状。重要的是，证实了Remodelin的作用与高尔基体碎片化或微管蛋白解聚无关，因为与诺考达唑或秋水仙素不同，Remodelin不影响高尔基体完整性(图13C)或微管蛋白组装成聚合物(图13D)。这些差异有助于解释为什么与响应诺考达唑或秋水仙素暴露的情况不同，在Remodelin处理时细胞不在有丝分裂时蓄积。为了解NAT10如何修饰微管组织，通过在冷诱导的解聚并释放到温热的培养基中后进行再生长测定法，分析微管动力学。虽然在siLMNA细胞(图13E，t=5分钟)和HGPS细胞(图14B)中在NAT10抑制后最初的微管再生长(成核期)显得正常，但是在siLMNA细胞(图13E)和HGPS细胞(图14B)中通过Remodelin处理或通过NAT10G641E突变(图13E，t=15分钟)，明显影响然微管与中心体的锚定，这表明了NAT10KAT活性促进微管锚定。与此一致，在参与微管锚定的PCM-1蛋白耗减时，在siLMNA细胞中观察到核形状拯救(A.Dammermann,A.Merdes(2002)J.CellBiol.159,255)。因为微管对核施加促成核被膜畸形的外力(M.C.King等(2008)Cell134,427)，因此该结果支持这样的模型，其中在核纤层蛋白病理性细胞中抑制NAT10KAT活性减少微管锚定，从而对核被膜释放外力并促进核形状拯救和细胞适合度的整体加强(图13F)。该模型与之前的研究一致，该研究表明通过修改基质刚度在核上释放微管力使核纤层蛋白病理性细胞的核形状正常化(C.Tamiello等(2013)Nucleus4,61)，并有助于解释为什么Remodelin像其它微管改组剂一样(N.Suzuki等(1998)PNAS95,10499)，在非早衰细胞中纠正FTI诱导的核形状缺陷(图11)。实施例6：核形状拯救的结构要求的分析在U2OS细胞(siLMNA)中通过siRNA使核纤层蛋白A/C耗减以诱导畸形核。然后将细胞用化合物2的不同类似物处理16小时，并通过DAPI染色分析核形状拯救。结果见图18和图19，该图显示了受测分子的结构及其拯救核形状的能力。实施例7：化合物2以剂量依赖性方式抑制A431黑素瘤细胞系的生长将表达低水平的核纤层蛋白A蛋白的A431细胞(参见图2)以低密度接种，并用规定浓度的化合物2处理。采用IncuCyteZOOM®，随时间推移自动监测细胞生长。结果见图20。增殖测定法显示以剂量依赖性方式抑制A431细胞生长。10µMRemodelin的浓度足以降低这些细胞的增殖达约50%，而高达50µMRemodelin不影响表达高水平的核纤层蛋白A/C的细胞(参见图15)。实施例8：核纤层蛋白A/C敲除的U2OS细胞比野生型细胞对化合物2和类似物更敏感采用CripR/Cas9技术，工程改造LMNA敲除(KO)U2OS细胞系。将LMNAKO细胞对化合物2的敏感性与表达野生型LMNA的细胞(LMNAWT)相比。采用IncuCyteZOOM®，随时间推移自动监测细胞生长。结果见图21，将该图分成两个图以更易于读取曲线。上图显示化合物2对于抑制LMNAKO细胞的细胞生长的特异性。下图显示与化合物2相比，化合物13对LMNAKO细胞生长抑制的效能增加。实施例9：化合物2明确在LMNAKO细胞中抑制整体蛋白质翻译将表达野生型或KOLMNA的U2OS细胞用化合物2处理24小时并与可点击甲硫氨酸类似物HPG一起孵育1小时以测量整体蛋白质翻译。然后将HPG用Alexafluor488点击，通过对10000个细胞的FACS定量测定整体荧光强度。图22中的曲线显示在LMNAKO细胞中但非在LMNAWT细胞中在化合物2添加时整体蛋白质翻译强降低，这可说明在之前图中观察到的细胞生长抑制的差异。实施例10：与用化合物2处理相比NAT10的耗减导致对增殖、迁移和侵袭的类似抑制在U2OS细胞(siNAT10)中通过siRNA使NAT10耗减，然后将细胞用化合物2处理16小时后，接种在基质胶上用于迁移/侵袭测定法。平行地，分别接种来自同一板的细胞以评价细胞增殖。结果见图23，并表示为与未处理对照细胞(siCT)相比细胞数的百分比。图示显示用化合物2抑制NAT10或用siRNA使之耗减导致细胞增殖、迁移和侵袭的类似的降低。实施例11：化合物2体内毒性和体外特异性的评价以规定的每日剂量口服给予小鼠化合物2持续14天，结果见图24。图24的左图：体重变化显示高达400mg/kg/天的高剂量化合物是口服极耐受的，不显著减轻体重。图24的右图：用规定剂量治疗的小鼠在14天治疗结束时心脏和肌肉中化合物2浓度的测量。图示显示心脏和肌肉两者中极高浓度的化合物，表明了化合物随时间推移蓄积。图24的下图显示化合物2不抑制主要的赖氨酸乙酰基转移酶蛋白(KAT)体外对其组蛋白底物的活性，表明了对NAT10抑制的高特异性和因此体内潜在的低毒性。实施例12：化合物2处理对HutchinsonGilford早老综合征小鼠模型的作用图25的左图：与野生型小鼠相比，经改造以在两个等位基因上携带G609G突变的HGPS小鼠模型显示较小的尺寸和背部弯曲。图25的中图：HGPS小鼠从3周龄起用每日口服剂量的100mg/kg/天化合物2治疗，直到因>20%体重丢失而被淘汰。在用化合物2治疗几天后，小鼠显示毛发发灰，这可能反映了靶命中(targetengagement)。图25的右图：仅用溶媒(LmnaG609G/G609GV)或用化合物2(LmnaG609G/G609G2)治疗的HGPS小鼠(LmnaG609G/G609G)的整体存活率显示在化合物2处理时小鼠的中值存活率显著增加(+25%)。小鼠数/组n=10。实施例13：体内化合物2的分子作用收获用化合物2治疗的野生型小鼠或LmnaG609G/G609G小鼠的组织，提取蛋白质，加载到蛋白质印迹上，所述蛋白质印迹见图26。LmnaG609G/G609G小鼠的确显示progerin表达(主要在肺组织中易检出)，证实了其基因型。通过DNA双链断裂标志物γH2AX评价了DNA损伤，所述γH2AX采用LicorOdyssey成像系统定量测定。在蛋白质印迹下显示与总H2AX相比γH2AX的相对量，并显示在心脏和肺两者中与未治疗小鼠相比，用化合物2治疗的LmnaG609G/G609G小鼠的组织中DNA损伤明显减少。未在肝提取物中观察到作用，表明化合物2可能不在肝中蓄积。实施例14：作为NAT10抑制的潜在生物标志物的乙酰基微管蛋白的评价由于微管蛋白是NAT10的直接底物，对来源于HGPS患者的细胞(图27的左图和下图)以及LmnaG609G/G609G小鼠(图27的右图)的微管蛋白乙酰化水平进行了评价。在患者细胞和LmnaG609G/G609G小鼠两者中，微管蛋白乙酰化显得较高，表明了NAT10可能过度活化。LmnaG609G/G609G小鼠用化合物2治疗导致微管蛋白乙酰化水平降低(图27的右图)，表明了这种乙酰化标志可为体内NAT10抑制的良好的生物标志物。实施例15：工程改造LmnaG609G/G609G/NAT10+/-小鼠用于遗传验证图28的左上图：肺蛋白质提取物中NAT10表达水平的评价显示与WT或LmnaG609G/G609G(图28的右上图)相比，NAT10+/-小鼠中的NAT10表达降低约50%。图28的下图：规定小鼠基因型的体重，显示了与LmnaG609G/G609G小鼠相比LmnaG609G/G609G/NAT10+/-小鼠中体重的强增加，并表明了NAT10的50%降低足以至少部分地拯救LmnaG609G/G609GHGPS小鼠的表型。实施例16：微阵列分析显示HGPS细胞中化合物2对基因表达调节的特异性将正常成纤维细胞或HGPS成纤维细胞以1µM化合物2慢性处理保持在培养中达12次群体倍增(图29的上图)或用针对NAT10的siRNA转染3天(图29的下图)。提取RNA，通过微阵列分析整体基因表达。火山图(Volcanoplot)显示化合物2对HGPS细胞的基因表达调节的极高特异性，其中约1000个基因受影响超过2倍，而在正常成纤维细胞中只有24个基因受影响。文氏图(图29的组图2)显示与正常成纤维细胞相比，通过化合物2处理拯救约一半的HGPS中错误调节的基因。图29的下组图：火山图和文氏图显示NAT10耗减(对于NAT10耗减效率参见下面的WB)导致与正常成纤维细胞相比HGPS细胞中约2倍基因表达的改变。长期化合物2处理还影响约30%的HGPS细胞中受NAT10耗减影响的基因，表明了这些是受NAT10乙酰转移酶活性调节的基因。综上所述，本发明人鉴定并表征了小分子Remodelin为改善核形状及早衰和核纤层蛋白A/C耗减细胞两者的适合度的新的作用剂。据本发明人所知，Remodelin是还降低HGPS细胞中的γH2AX稳态水平(这被认为是造成其早老表型的原因)的第一个分子。重要的是，通过使用基于无偏的体内和体外点击化学的方法，将NAT10鉴定为通过微管网重构而负责核形态拯救的Remodelin的细胞靶。因此，NAT10的“小分子抑制剂”提供以有价值的时空分辨率研究核纤层蛋白病相关过程的新的机会(T.U.Mayer等(1999)Science286,971)，并且适当时可产生新的药物类别用以缓解营养不良和早老疾病。在整个说明书和随附权利要求书中，除非文中另有要求，否则措词“包含”和变化例如“包括”和“含有”应理解为意指包括所述整数、步骤、整数组群或步骤组群但不排除任何其它整数、步骤、整数组群或步骤组群。本说明书和权利要求书构成其部分的申请相对于任何后续申请可用作优先权的基础。所述后续申请的权利要求可涉及本文所述的任一特征或特征组合。它们可呈产品、组合物、方法或用途权利要求的形式，并可通过举例且非限制地包括随附权利要求。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3