磷脂组合物和微囊及使用磷脂组合物和微囊形成的乳剂的制作方法

本发明的技术领域

公开的是磷脂组合物。在某些实施方案中，磷脂组合物可以用作一种超声造影剂(“usca”)，其中所述usca具有改善的有效期和患者耐受性。

发明背景

超声造影剂(usca)用于改善超声成像的诊断准确度。而且，usca也用作治疗中风和心脏病发作的超声溶栓等疗程中的空化核。然而，目前usca主要用于诊断。

目前市场上出售的现有技术超声造影剂商标是definity。definity是一种基于磷脂的超声造影剂，包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(“dppc”)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-peg(5,000)(“dppe-peg5,000”)和二棕榈酰磷脂酸(“dppa”)。

在4-8℃温度条件下，definity的有效期为两年。产品的降解主要是由脂质的水解引起的。已知definity的临床使用会导致背痛，这是一种副作用。definity的处方信息明确表明背痛在约1.2％的患者中发生。当发生背痛时，这种副作用可能对患者造成非常大的困扰，持续至多30分钟或一小时。

发明概述

申请人的组合物包括几种脂质，这些脂质在中性ph值条件(即ph＝7.0)下基本上为电荷中性，可用于稳定乳剂和碳氟化合物的微囊。此种制剂包括：含有peg化脂质的磷脂酰胆碱和第三种脂质，第三种脂质为锥形脂质。在某些实施方案中，锥形脂质为磷脂酰乙醇胺。此种制剂可生成储存稳定性增强且副作用趋于减少的乳剂和微囊。

在某些实施方案中，申请人的组合物还可能包括第四种脂质，这是一种双官能peg化脂质。因为采用申请人的组合物制备的微囊和乳剂纳米颗粒总体上为电荷中性，所以，这些微囊/乳剂在生物靶向相关表位和生物标记方面具有增强的性能。

附图的简要描述

本发明将根据以下而更能明显易懂：阅读以下详细说明结合附图，其中类似的引用指示符指示类似的元素，并且其中：

图1显示了二棕榈酰磷脂酸在不同ph值条件下的离子化现象；

图2显示了锥形脂质和柱形脂质；

图3通过图显示了两(2)种不同制剂的颗粒大小；

图4通过图显示了含胆固醇的组合物的总微囊计数；

图5通过图显示了含棕榈酸的组合物的总微囊计数；

图6通过图显示了mvt-100和definity等效物的颗粒数量与粒径；

图7通过图显示了不同稀释剂比例的总微囊计数与definity等效物；

图8通过图显示了不同稀释剂比例的总微囊计数与definity等效物；

图9通过图显示了不同稀释剂比例的总微囊计数与definity等效物；

图10通过图显示了配有不同稀释剂的三种不同脂质比率的百分比总微囊计数与definity等效物；

图11通过图显示了含有dppa的definity等效物和含有dppe(代替dppa)的mvt-100的稳定性数据；

图12通过图显示了针对两种不同制剂(其中每种制剂均包括一种与锥形脂质结合的阳离子脂质)和第三种制剂(其中阳离子脂质代替dppe作为锥形脂质)测量的总微囊计数；

图13通过图显示了每种所述制剂的微囊计数与激活后四(4)分钟的图示编号(绘制图#)；

图14通过图显示了激活后四(4)分钟82摩尔百分比dppc、10摩尔百分比dstap和8摩尔百分比dppe-mpeg-5k制剂的微囊尺寸数据；

图15通过图显示了每种所述制剂的微囊计数与激活后六十四(64)分钟的图示编号(绘制图#)；

图16通过图显示了激活后六十四(64)分钟82摩尔百分比dppc、10摩尔百分比dstap和8摩尔百分比dppe-mpeg-5k制剂的微囊尺寸数据；及

图17通过图显示了肾皮质中与残留微囊相关的超声成像数据，其中definity等效物在肾皮质中积累的残留微囊比mvt-100在肾皮质中积累的残留微囊多三倍以上。

优选实施方案的详细描述

本发明在下文描述中通过优选实施方案并参考附图进行了描述，在附图中类似数字代表相同或相似的元素。本说明书中对“一个实施方案”，“实施方案”或类似用语的提及是指与本实施方案相关描述的具体特征、结构或特点被包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书的“在一个实施方案中”，“在实施方案中”和类似用语的字句的出现均可能(但不一定)指同一实施方案。

本发明中描述的特征，结构或特点可能以任何合适的方式在一个或多个实施方案中相结合。在下列描述中，许多具体细节被引用以便于提供对本发明实施方案的充分理解。不过，相关领域的技术人员将意识到，在缺乏一个或多个具体细节的情况下，或采用其他方法、成分和材料等可以实施本发明。在其他情况下，熟知的结构，材料或操作并未详细展示或描述，以避免对本发明引起歧义。

在某些实施方案中，申请人的磷脂组合物包含一种或多种电荷基本为中性的磷脂，其中，包含申请人磷脂组合物的脂质包衣的微囊形成乳剂具有增强的储存稳定性，并且，在临床上使用，由申请人的微囊形成乳剂形成的脂质包衣的微囊与生物效应(如背痛)减轻有关。在某些实施方案中，一个或多个申请人的磷脂包含一种整体为电荷中性的两性离子化合物。

在某些实施方案中，申请人的磷脂组合物包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(“dppc”)，磷脂l。dppc是一种两性离子化合物，是一种基本上为电荷中性的磷脂。

在某些实施方案中，申请人的磷脂组合物包含第二种磷脂2，这种磷脂含有多羟基头基和/或大于350道尔顿的头基，其中m⁺选自由以下组成的组：na⁺、k⁺、li⁺和nh4⁺。

在某些实施方案中，申请人的磷脂2包含磷脂3，后者含有钠阳离子和一个连接至磷酰基部分的甘油头基。

磷脂4包含铵平衡离子和连接至磷酰基部分的聚乙二醇(“peg”)头基。在某些实施方案中，申请人的组合物包含peg化脂质。在某些实施方案中，peg基团的分子量(mw)为约1000道尔顿至约10,000道尔顿。在某些实施方案中，peg基团的分子量(mw)为约2000道尔顿至5,000道尔顿。在某些实施方案中，peg基团的分子量(mw)为约5,000道尔顿。

在某些实施方案中，申请人的脂质组合物包含下列peg化脂质的一种或多种：1,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](铵盐)、1,2-二棕榈酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](铵盐)、1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-1000](铵盐)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二棕榈酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1,2-二棕榈酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-3000](铵盐)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1,2-二棕榈酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)和1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)。

磷脂5，如上所述，代表二棕榈酰磷脂酰乙醇胺或dppe。pe，尤其是dppe，是本发明的优选脂质，优选在具有其他脂质的制剂中浓度为5至20摩尔百分比，最优选为10摩尔百分比。

在某些实施方案中，申请人的磷脂组合物不包含磷脂酸6(“dppa”)。

正如本领域的技术人员所理解的，dppa包含两个酸性质子。第二个酸性质子的pka为约7.9。图1描述了作为ph的函数的dppa离子化情况。曲线110表示存在的一价阴离子6的百分比，曲线120表示存在的二价阴离子7的百分比。在ph为约4或更高时，一价阴离子6和二价阴离子7的复合百分比总计为100。

在ph为约7.9时，dppa含有约50％的一价阴离子7和约50％的二价阴离子8。在ph为约7.0时，dppa含有约85％的一价阴离子7和约15％的二价阴离子8。

磷脂酸dppa在细胞功能中发挥若干作用；可以用作其他脂质生物合成中的前体，通过其生物物理特性促进囊泡的分裂/融合，并且用作信号脂质。单酰衍生物溶血磷脂酸(lpa)，通过激活高亲和力g-蛋白耦合受体(lpa1、lpa2和lpa3、原来的edg2、edg4和edg7；和近期发现的lpa4、lpa5和lpa6)，用作强效信号分子。由于现有技术中，含有dppa，如definity，age和dppa的磷脂组合物发生水解，因此，存在的单酰衍生物可能增加，且在临床上的不良生物效应亦会增加。

表1显示了在4-8℃条件下储存时含有dppa的磷脂组合物的稳定性。各个脂质组分的比值是现有技术的definity产品中使用的比值。在低温条件下储存38个月时，dppc依然为其释放水平的86.4％。dppe-peg5,000为其释放水平的81.6％，dppa为其释放水平的78.4％。

不过，在第48个月时，dppa下降至其规格以下，而dppc和dppe-peg保持在其规格范围以内。申请人发现，对于含有与dppa结合的多种磷脂的磷脂组合物低温储存稳定性而言，磷脂酸dppa是一种限制因子。申请人进一步发现，在不含dppa的制剂中，其他脂质更加稳定；似乎dppa催化或加速制剂中脂质的水解。

表1

将dppa加入现有技术的基于磷脂的造影剂中，以预防可能的微囊聚集。dppa的二价阴离子结构导致脂质包衣的微囊的静电排斥增加，因此认为其降低了微囊聚集的可能性。

令人吃奇的是，申请人发现由多种磷脂制备但不含dppa的脂质包衣的微囊不会进行不良聚集。此外，从一种或多种磷脂制备但不含dppa的脂质包衣的微囊与definity具有相似的粒度。

在某些实施方案中，申请人的磷脂组合物包含注射用悬浮液。申请人的一瓶注射用组合物在活化后，可以获得多种囊封氟碳气体的磷脂包衣的微球。此类磷脂包衣的微球含有诊断药物，预期可以在某些所示超声心动图程序中用于对比增强。

申请人的磷脂组合物包含澄清、无色、无菌、非热原、高渗液体，在活化后，其可以提供一种包封氟碳气体的磷脂包衣的微球的均匀、不透明、乳白色注射用悬浮液。在某些实施方案中，通过静脉注射施用上述悬浮液。

按照图2所示，在某些实施方案中，申请人的发明包括一种或多种锥形或六边形hii脂质。本发明中有用的锥形脂质，如脂质210，包括单半乳糖基二酰基甘油(mgdg)、单葡糖基二酰基甘油(mgdg)、二磷脂酰甘油(dpg)(也称为心磷脂)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰乙醇胺(pe)和二酰基甘油。磷脂酸(pa)也是一种锥形脂质，但由于其水解趋向和导致生物效应的潜在作用，因此不是优选脂质。最优选的锥形磷脂是磷脂酰乙醇胺(pe)。

锥形脂质210含有头基212，该头基占有的体积小于从头基212向外延伸的外延基团(侧基(pendentgroup))214占有的体积。

圆柱形脂质220含有头基222，该头基占有的体积类似于由从头基222向外延伸的外延基团224决定的体积。此外，申请人还发现阳离子，即带正电的脂质，在上述阳离子脂质的头基小于尾部时可以用作锥形脂质。

潜在可用的锥形阳离子脂质的示例包括但不限于1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(甲基硫酸盐)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、1,2-二棕榈酰基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、1,2-二硬脂酰基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲铵-丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-二甲铵-丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-二甲铵-丙烷、二甲基双十八烷基铵和1,2-二-o-十八烯基-3-三甲铵-丙烷(氯化物盐)、o,o-二-o-十八烯基-3-tα-三甲基氨酰基二乙醇胺。

如图3所示，发明人发现，与不含第三种脂质的制剂相比，用第三种脂质-一种锥形脂质，尤其是dppe制备的微囊可以提供更好的囊泡计数和微囊稳定性。制剂中优选的锥形脂质浓度为约5-约20摩尔百分比，更优选的浓度为约8-15摩尔百分比，最优选的浓度为制剂中总脂质的约10％。

如图3所示，制剂不含dppa，且不含锥形脂质。例如，含有0.75mg/ml脂质组合物的制剂生成少量微囊。含有1.50mg/ml脂质组合物的制剂无法生成与definity等效物相当的微囊颗粒计数。

在某些实施方案中，申请人的磷脂组合物包含包封在外层脂质壳中的八氟丙烷，由以下组成：(r)-4-羟基-n,n,n-三甲基-10-氧代-7-[(l-氧代十六烷基)氧基]-3,4,9-三氧-4-磷杂二十五烷-l-铵，4-氧化物，内盐，即dppc，和(r)-α-[6-羟基-6-氧化-9-[(1-氧代十六烷基)氧基]5,7,ll-三氧-2-氮杂-6-磷杂二十五烷-l-基]-ω-甲氧基聚(氧基-1,2-乙二基)、一钠盐(即dppepeg5000/含脂质5的磷脂4、dppe。dppe-peg5000的分子量大约为5750道尔顿。

每毫升澄清液体含有0.75mg脂质掺合物(由0.046mgdppe、0.400mgdppc和0.304mgmpeg5000-dppe组成)、103.5mg丙二醇、126.2mg甘油、2.34mg磷酸二氢钠一水合物、2.16mg磷酸氢二钠七水合物和4.87mg注射用水中的氯化钠。其ph值为6.2-6.8。

在活化后，申请人的每毫升包封氟碳气体的磷脂包衣的微球均包含乳白色悬浮液，此悬浮液基本上由最大1.2x10¹⁰脂质包衣的微球和约150μl/ml(1.1mg/ml)八氟丙烷组成。下面列示了微球的粒度参数，与definity的粒度参数相同：

平均粒度1.1-3.3μm

小于10μm的颗粒98％

最大直径20μm

申请人的磷脂组合物和现有技术的definity产品的定量组成比较显示下表2中。

在某些实施方案中，申请人的磷脂组合物与definity相同，但例外情况是申请人的磷脂组合物不含任何dppa，但已经用等摩尔数量的dppe代替了dppa。脂质掺合物其他组分(dppc、dppepeg5000和dppe)成比例增加，以维持0.75mg的总脂质掺合物。

表2

对于第四种脂质，可以使用双官能peg化脂质。

双官能peg化脂质包括但不限于dspe-peg(2000)-琥珀酰基-1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[琥珀酰(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)-pdp-1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[pdp(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)-马来酰亚胺-1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)-生物素-1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)-氰尿酸(cyanur)1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[氰尿酸(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)-胺-1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(5000)-马来酰亚胺，1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[二苯并环辛基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、l,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[叠氮基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[琥珀酰(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[羰基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[pdp(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[生物素基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[氰尿酸(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[叶酸(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-n-[叶酸(聚乙二醇)-5000](铵盐)、n-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)2000]}和n-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)5000]}。

双官能脂质可用于将抗体、肽类、维生素、糖肽类和其他靶向配体附着于微囊上。在第三种脂质中，peg链的mw可以在大约1000道尔顿至约5000道尔顿范围内波动。在某些实施方案中，peg链的mw为约2000道尔顿至约5,000道尔顿。

本发明中使用的脂质的脂质链长度为大约14至约20个碳原子。最优选的链长为约16-约18个碳原子。链可以是饱和链或不饱和链，但优选的是饱和链。胆固醇和胆固醇衍生物也可用于本发明中，其限制性条件是它们为电荷中性，或者，如果带有负电荷，则应在与负电荷邻近位置含有一个分子量大于约350mw的头基，以便从生物环境中屏蔽电荷。

在各种实施方案中，微囊核气体为氮气、氧气、六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷或其混合物。为了成像和给药，理想的微囊核气体具有低水溶性，且其沸点低于体温。这导致微囊具有较长的循环时间，较长的使用寿命和较高的回声质量。

申请人的气态前体包括例如氟化碳、全氟化碳、六氟化硫、全氟醚及其组合。正如本领域的技术人员所理解的情况，当首次制备组合物时，特定的氟化合物，如六氟化硫、全氟化碳或全氟醚，可能以液态形式存在，因此将其用作气态前体。氟化化合物是否为液体一般取决于其液态/气态相转变温度，或沸点。例如，优选的全氟化碳、全氟戊烷的液体/气体相转变温度(沸点)为29.5℃。这表明全氟戊烷在室温(约25℃)条件下通常为液体，但在人体内转化为气体，因为人体的正常体温约为37℃，高于全氟戊烷的相转变温度。因此，在正常情况下，全氟戊烷为气态前体。正如本领域的技术人员所知道的情况，一种物质的有效沸点可能与该物质暴露的压力有关。这种关系通过理想的气体状态方程加以证实：pv＝nrt，其中，p为压力，v为体积，n为物质的摩尔数，r为气体常数，t为温度，单位为°k。理想气体状态方程表明，当压力增加时，有效沸点也增加。相反，当压力降低时，有效沸点降低。

在本发明的组合物中用作气态前体的氟碳化合物包括部分或全部氟化的碳化合物，优选的是饱和、不饱和或环形全氟化碳。优选的全氟化碳包括例如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟环丙烷、全氟丁烷、全氟环丁烷、全氟戊烷、全氟环戊烷、全氟己烷、全氟环己烷及其混合物等。最优选的全氟化碳为全氟己烷、全氟戊烷、全氟丙烷或全氟丁烷。

优选的醚包括部分或全部氟化的醚，更优选的是沸点为约36℃至约60℃的全氟化醚。

氟化醚是其中一个或多个氢原子被氟原子替代的醚。本发明中用作气态前体的优选全氟化醚包括例如全氟四氢吡喃、全氟甲基四氢呋喃、全氟丁基甲醚(例如，全氟叔丁基甲醚、全氟异丁基甲醚、全氟正丁基甲醚)、全氟丙基乙醚(例如，全氟异丙基乙醚、全氟正丙基乙醚)、全氟环丁基甲醚、全氟环丙基乙醚、全氟丙基甲醚(例如，全氟异丙基甲醚，全氟正丙基甲醚)、全氟乙醚、全氟环丙基甲醚、全氟甲基乙醚和全氟甲醚等。

其他优选的全氟醚类似物含有4-6个碳原子，可任选含有一个卤离子，优选br-。例如，将结构为cnfyhxobr的化合物用作气态前体，其中，n为从1到约6的整数，y为从0到约13的整数，x为从0到约13的整数。

在本发明中用作气态前体的其他优选氟化化合物为六氟化硫和七氟丙烷，包括1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷及其异构体，1,1,2,2,3,3,3-七氟丙烷。不同类型化合物的混合物，如氟化化合物(例如，全氟化碳或全氟醚)和其他类型的气体或气态前体的混合物也可用在本发明组合物中。其他气体和气态前体是本领域的技术人员所熟知的。

一般情况下，优选的气态前体在以下温度条件下进行相变而成为气体：高达约57℃温度，优选温度约20℃至约52℃，优选温度约37℃至约50℃，更优选约38℃至约48℃，甚至更优选约38℃至约46℃，依然甚至更优选约38℃至约44℃、甚至依然更优选约38℃至约42℃。气态前体在大约低于40℃温度条件下(最优选的情况下)进行相变。本领域的技术人员承认，用于特定应用的气态前体的最佳相转变温度将取决于下列方面的考量，例如：特定患者、靶向的组织、导致温度升高的生理应激状态(即，疾病、感染或炎症等)的性质、使用的稳定化材料和/或待递送的生物活性剂等。

此外，本领域的技术人员承认，化合物的相转变温度可能会受组织内部的局部状况影响，如局部压力(例如，间质的、界面的或区域内的其他压力)。例如，如果组织内部的压力高于环境压力，则预计相转变温度将升高。可采用标准气体定律预测方法，如查理定律和玻意耳(波义耳)定律来估计此类影响的范围。作为一种近似法，预计压力每增加25mmhg，液体至气体相转变温度在约30℃至约50℃之间的化合物的相转变温度可以增加约1℃。例如，在约为760mmhg的标准压力条件下，全氟戊烷的液体至气体相转变温度(沸点)为29.5℃，但在795mmhg的间质的压力条件下，其沸点为约30.5℃。

在稳定本发明所讨论的气态前体中使用的材料也可能影响气态前体的相转变温度。一般情况下，预计稳定化材料可以增加气态前体的相转变温度。尤其是相对刚性的聚合材料，例如多氰基甲基丙烯酸酯，可能对气态前体的相转变温度具有显著影响。在选择气态前体和稳定化材料时，必须考虑这种影响。

气态前体和/或气体可优先纳入稳定化材料和/或囊泡中，而无须考虑组分的物理性质。因此，预计气态前体和/或气体可以例如纳入稳定化材料(其中稳定化材料随意聚合)中，如乳剂、分散剂或混悬剂(悬浮液)以及纳入囊泡中，包括由脂质制备的囊泡，如微胶粒和脂质体。可以采用多种方法之一使气体和/或气态前体纳入稳定化材料和/或囊泡中。

术语“稳定”或“稳定的”表示囊泡对降解，包括例如，囊泡结构或包封气体、气态前体和/或生物活性剂的损耗(丧失)，在一定的有效时间内实质上都具有耐受性。通常，在正常环境条件下，本发明中使用的囊泡具有适当的有效期，通常可维持其初始结构至少约90％的体积量长达至少约2-3周的时期。在优选形式中，囊泡在以下的时期中是令人称心如意地稳定的：至少约1个月，更优选至少约2个月，甚至更优选至少约6个月，依然更优选至少约18个月，和也更优选至多约3年。此处描述的囊泡包括充满气体和/或气态前体的囊泡，此类囊泡甚至还可能在不利条件下保持稳定，所述不利条件如高于或低于囊泡在正常环境条件下经历的温度和压力。

下表3列示了本发明中的有效气体。

表3

以下实施例旨在向本领域的技术人员进一步证明如何制备和使用本发明。不过，这些实施例无意限制本发明的范围。

实施例1

在丙二醇中悬浮一种含有dppc和dppe-mpeg-5000的脂质混合物，制备脂质掺合物。将脂质悬浮液加热至65±5℃，直至脂质完全溶于丙二醇。然后，将脂质溶液加入含有氯化钠、磷酸盐缓冲液和甘油的水溶液中，轻轻搅拌，以完全混合。每毫升所得脂质掺合物含有0.75mg总脂质(包括0.43mgdppc和0.32mgdppe-mpeg-5000)。每毫升脂质掺合物还含有103.5mg丙二醇、126.2mg甘油、2.34mg磷酸二氢钠一水合物、2.16mg磷酸氢二钠七水合物和4.87mg注射用水中的氯化钠。其ph值为6.2-6.8。在密封小瓶中加入材料，小瓶顶空部位含有八氟丙烷(ofp)气体(>80％)及平衡空气。

采用下列方法测定本发明申请的先前和后续部分中列出的制剂所产生的微囊浓度和粒度分布。采用vialmix改良型补齿混汞器活化小瓶，放置4分钟，然后在适当的容器中用过滤的生理盐水稀释少量微囊悬浮液。活化和稀释(1e-6)微囊溶液后，采用在128个通道中采样的nicomp780(粒度分析仪)测定微囊的粒度分布。将本发明申请中列出的脂质制剂获得的微囊粒度结果与definity等效物标准品进行比较。本标准品含有约82mol％dppc、10mol％dppa和8mol％dppe-mpeg-5000，溶于段落[00058]中列出的中性制剂相同的缓冲共溶剂盐水混合物中。

实施例2-不同制剂的制备

如表4所示，在总量为0.75mg/ml时，将dppc：dppe-mpeg-5k的摩尔百分比从91.16：8.84调整至94.00：6.00，并且摩尔百分比为92.55：7.45时最为稳定，如表4所示。稳定性基于活化后小瓶的不透明度。

表4

此外，还将最稳定的两种脂质掺合物中的丙二醇和甘油的体积百分比从0％调整至20％；这对微囊的稳定性没有影响。

表5和表6显示了含有胆固醇的脂质掺合物。含有胆固醇，dppc和dppe-mpeg-5000的、总脂质水平为0.75和1.50mg/ml的脂质掺合物制剂生成的微囊浓度低于definity标准品制剂(图4)产生的微囊浓度。在含有胆固醇的四种制剂中，含有81mol％dppc、11mol％dppe-mpeg-5000和8％胆固醇的脂质掺合物产生的微囊浓度最高。

如图5所示，与仅含有dppc和dppe-mpeg-5000的制剂相比，含有棕榈酸、dppc和dppe-mpeg-5000的制剂能够始终生产较高浓度的微囊。与definity标准品相比，这些制剂可生产更高浓度的可能导致健康风险的较大尺寸微囊。其它成分加入两种脂质掺合物中，以优化微囊的浓度和粒度分布。这些赋形剂包括：硬脂酸、普流罗尼克f68和1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-甘油磷脂(dspg)。与含有dppc和dppe-mpeg-5000的制剂相比，含dspg和硬脂酸的制剂可生产较高浓度的微囊，但其浓度未达到含dppe的制剂的程度(见实施例3)。在两种脂质掺合物中加入普流罗尼克f68不会明显增加微囊的浓度。

表5

表6

实施例3

mvt-100(含dppe的制剂)的制备采用与实施例1中所示类似方法制备含有dppc、dppe和dppe-mpeg-5000的脂质掺合物。将悬浮在丙二醇中的脂质加热至70±50c，直至其溶解。然后，将脂质溶液加入含氯化钠、磷酸盐缓冲液和甘油的水溶液中，搅拌以完全混合。每毫升所得脂质掺合物含有0.75mg总脂质(包括0.400mgdppc，0.046mgdppe和0.32mgmpeg-5000-dppe)。每毫升脂质掺合物还含有103.5mg丙二醇、126.2mg甘油、2.34mg磷酸二氢钠一水合物、2.16mg磷酸氢二钠七水合物和4.87mg注射用水中的氯化钠。其ph值为6.2-6.8。在密封小瓶中加入材料，小瓶顶空部位含有八氟丙烷(ofp)气体(>80％)及平衡空气。

图6通过图显示了definity等效标准品和mvt-100生产的微囊的粒度分布图。除mvt-100中用dppe代替dppa外，两种制剂具有完全相同的脂质浓度和组分。甚至当悬浮在生理盐水中时，mvt-100制剂生产的微囊在浓度和粒度分布方面随时间逐渐保持稳定。如图7、8、9和10所示，采用不同比例的共溶剂丙二醇(pgoh)、甘油(gloh)和含有磷酸钠缓冲液及氯化钠的水(h2o)，制备含有脂质dppc、dppe和dppe-mpeg-5000的不同混合物的脂质掺合物。所述共溶剂百分比用体积百分比显示，简写为％(v/v)。例如，10：10：80相当于10％(v/v)丙二醇、10％(v/v)甘油和含有磷酸钠缓冲液及氯化钠的80％(v/v)水。脂质掺合物在以下列于表7中。

表7

用磷酸钠缓冲液及组氨酸-谷氨酸缓冲液制备含82mol％dppc、10mol％dppe和8％dppe-mpeg-5000的脂质掺合物。还可采用浓度约为5和25mm的磷酸钠缓冲液制备脂质掺合物。还可使用pka在5.8-7.8范围内、批准用于胃肠外制剂的其他缓冲液(如柠檬酸)。灌装在最终产品中的气体可能是35％的空气与65％的全氟丙烷。但在这些实验中，我们采用歧管灌装的小瓶用于引入全氟丙烷>90％，这是针对所有样品而言的。

图7是含有不同浓度共溶剂和具有相同浓度的脂质(82mol％dppc、10mol％dppe、8mol％dppe-mpeg-5000)的制剂的比较。含有比值为10:10:80和15:5:80％(v/v)的pgoh:gloh:h2o的制剂产生的微囊浓度与含有比值为10:10:80％(v/v)的pgoh:gloh:h2o的definity等效物标准品产生的微囊浓度相似。与含有10:10:80和15:5:80％(v/v)pgoh:gloh:h2o的脂质掺合物和definity等效物标准品相比，含有20:80％(v/v)的pgoh：h2o的制剂产生的微囊浓度较低。

图8是含有不同浓度共溶剂和具有相同浓度的脂质(77mol％dppc、15mol％dppe、8mol％dppe-mpeg-5000)的制剂的比较。改变共溶剂的体积分数不会明显影响脂质掺合物产生的微囊浓度。

图9是含有不同浓度共溶剂和具有相同浓度的脂质(72mol％dppc、20mol％dppe、8mol％dppe-mpeg-5000)的制剂的比较。与10-15摩尔％dppe相比，将dppe百分比增加至20摩尔％，可以降低微囊的数量。改变共溶剂的体积分数不会明显影响脂质掺合物产生的微囊浓度。

图10显示了图7、8和9中所示信息的摘要幻灯片。

实施例4

根据实施例#1和实施例#3中所述制备了definity等效物和mvt-100脂质掺合物的样品。采用hplc来表征dppc、dppe-mpeg-5000、dppa、dppe和棕榈酸(磷脂水解的降解产物)的浓度。在4℃和40℃条件下储存样品，储存31天后进行分析。如表8和表9所示，definity等效物中含有的三种脂质(dppa,dppc和dppe-mpeg-5k)的降解明显高于mvt-100制剂中含有的3种脂质(dppc,dppe,dppe-mpeg-5000)的降解。

如表8底部所示，在40℃条件下储存31天后，definity等效物中的所有脂质效价均未保持在90％以上，仅一种脂质的效价为88％以上。通过比较发现，mvt-100中所有脂质的效价均保持在>95％，如表9底部所示。图11显示了脂质降解率的这种差异。

表8

表9

实施例5

假设肾皮质中补体介导的微囊保留导致了背痛/侧腹痛，其发生作为definity的副作用。采用definity等效物和mvt-100在野生小鼠中进行研究。通过iv注射，给予小鼠剂量为5x10⁵个微囊的definity等效物(n＝10)或mvt–100(n＝10)。注射微囊后8分钟进行超声成像，给予足够的时间来澄清血池中的微囊。如图17所示，通过超声检测肾皮质中的残余微囊。肾皮质中definity等效物的累积量比mvt-100的累积量高三倍多。图17中通过图显示的数据表明，mvt-100的肾保留少于definity等效物，表明mvt-100的背痛/侧腹痛发生率应低于definity。

如图12所示，与mvt–100(mb-neutr)相比，definity可导致更延后的肾脏增强。

实施例6

对5头猪施行超声波心动描记术。向这些动物随机注射definity或mvt-100。超声参数为频率＝2mhz、mi＝0.18或0.35。每个小瓶在100ml的盐水袋中混合。每个小瓶的大约体积为1.5-1.6ml。输注速率均为3.6-5.0ml/分钟。猪的体重约为～27-30kg。

假设1.5ml微囊/100ml＝15ulmb/ml溶液x3.6ml/分钟＝54ul/分钟；除以30kg＝1.8ul/kg/分钟。操作人员通过图像来评估心室和心肌的对比增强。

监测动物的血压、心率和pao2。判断图像对比情况，认为mvt-100和definity相当。注射任何一种试剂后，心率、血压或pao2无变化。mvt-100和definity的影像相当。

实施例7

阳离子脂质用法

根据实施例1所示制备脂质掺合物，其包含特别与一种锥形中性脂质mpeg-5k–dppe相结合的阳离子脂质1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化物9(dstap)。

表10概括了两个时间点(即活化后四(4)分钟和活化后64分钟)的三(3)种组合物的粒度数据。

表10

图12通过图显示了表10中列示的3种制剂和含有62mol％dppc、10mol％dppe、20mol％dstap和8mol％dppe-mpeg-5k的一种制剂所测得的微囊计数。由表10可知，包含82摩尔百分数dppc、10摩尔百分数dstap和8摩尔百分数mpeg-5k-dppe的制剂在活化后四(4)分钟和活化后六十四(64)分钟的微囊数量较多。

预示实施例8

对数千名患者施予了上述实施例1中所述的申请人的微囊组合物。与definity的临床运用相比，采用实施例2中申请人的微囊组合物时，背痛的发生率较低。

预示实施例9

在室温条件下进行稳定性研究。采用hplc监测脂质的分解。在vialmix上定期搅拌样品，使其产生微囊。采用粒度分析仪研究微囊的数量和粒度。在室温条件下，实施例2申请人的微囊组合物的有效期长于definity，与实施例4中证实的结果一致。

预示实施例10

在圆底烧瓶中，将与实施例3相同比例的dppc、dppe–peg(5000)和dppe溶于氯仿中，搅拌、加热、直至溶解。在加热、减压条件下蒸发氯仿，剩下脂质干膜。在含有聚乙二醇4000的水混合物中将脂质再次水化。搅拌材料，直至脂质均匀悬浮为止。将悬浮液置于小瓶中，冻干。小瓶中含有带peg的干脂质饼，在顶空部位充满全氟丁烷(pfb)气体和氮气(65％pfb/35％氮气)。密封小瓶，加热至38℃并保持4小时。为便于临床成像使用，向小瓶中注入生理盐水，用手轻轻振摇，制备微囊。

预示实施例11

除了用dppe–peg(5000)-叶酸代替十分之一的dppe-peg(5000)外，基本重复实施例2。所得的脂质悬浮液含有0.75mg脂质混合物(由0.046mgdppe、0.400mgdppc和0.274mgmpeg5000-dppe组成)和0.030mgdppe(peg5000)叶酸。然后，脂质悬浮液可用于制备微囊，其靶向细胞，例如癌症、其过表达叶酸受体。与含磷脂酸的微囊相比，采用含dppe的上述制剂制备的微囊改善了靶向性和细胞摄取性。

预示实施例12

采用实施例2中使用的脂质来乳化全氟戊烷。全氟戊烷的最终浓度为2％w/vol，脂质为3mg/ml。将冷却材料转移至小瓶中，采用负压将顶空部位的空气从小瓶中移除。密封小瓶。然后，按照实施例2中所述，在vialmix上搅动密封小瓶，以生成微囊。

预示实施例13

在4℃的加压条件下，通过高压均质化作用来均化脂质和ddfp，以便采用dppc/dppe-peg(5,000)/dppe制备全氟戊烷的乳剂。所得乳剂含有2％w/volddfp和0.3％w/vol脂质。采用不含dppe的dppc/dppe-peg制备相似的乳剂。在室温条件下将样品储存在密封小瓶中。粒度分析表明，含有dppe的制剂的颗粒计数增加且粒度维持状况更佳。

尽管针对本发明的优选实施方案进行了具体说明，不过，本领域的技术人员当可在不脱离本文所述本发明范围的情况下对那些实施方案进行变更与修改。