粘土产物减少虾中的细菌性疾病的效果的用途的制作方法

相关申请和通过引用的结合

本申请要求2014年8月1日提交的美国临时专利申请序号62/032,238的权益和优先权。

前述申请，和其中或在它们的执行期间引用的所有文献(“申请引用的文献”)和在该申请引用的文献中引用或参考的所有文献，和在此引用或参考的所有文献(“在此引用的文献”)，以及在此引用的文献中引用或参考的所有文献，与在此或在此通过引用结合的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的指示、描述、产品说明，和产品表格一起，均由此通过引用结合到本文中，并可用于实施本发明。更特别地，所有的参考文献通过引用而结合，如同各个独立的文献被特别地和单独地指明通过引用结合到本文中的程度一样。

发明领域

本发明涉及一种给予粘土或粘土共混物至虾，以减少早期死亡综合征(ems)/急性肝胰腺坏死病(ahpnd)的影响的方法。

发明背景

弧菌是分泌引起家禽、动物、人、鱼和虾的疾病的毒素的细菌属。由副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)产生的一种或多种未知的毒素，已表明会引起虾中的疾病。

引起早期死亡综合征(ems)，一种在东南亚新出现的虾病(更专业地称为急性肝胰腺坏死病(ahpnd)，并且也称为急性肝胰腺坏死综合征(ahpns))的难以捉摸的病原体被鉴定。ems由细菌刺激物(agent)引起，其经口传播，定居在虾的胃肠道并产生造成组织破坏和虾的称为肝胰腺的消化器官功能障碍的毒素，但不影响人。

ems/ahpnd病原体作为相对常见的细菌的独特菌株，副溶血弧菌，可被噬菌体感染，这可能导致其释放强效毒素。一个类似的现象发生在人类疾病霍乱中，其中噬菌体使霍乱弧菌(vibriocholerae)细菌能产生引起霍乱的致命性腹泻的毒素。然而，在虾中的ems的情况下，噬菌体对于从细菌释放的毒素可能是或可能不是必要的。

关于诊断试验发展的研究继续用于快速检测ems/ahpnd病原体，这将能够改进孵卵处和池塘的管理，并帮助产生疾病的长期解决方案。它也将能够更好地评估与从受ems影响的国家进口冷冻虾或其它产品相关的风险。

自从中国于2009年首次报告ems以来，其已经传播至越南、马来西亚和泰国、印度，和墨西哥，并且现在造成超过10亿美元(u.s.$)的年度亏损。ems爆发通常发生在一个新建成的养虾池塘放养后的首个30天内，且死亡率可超过70%。

除了诊断试验外，目前没有治疗这种疾病的可以利用的方法。重要的是，在中国和其它国家已经发现抗生素对ems无效。敏感性试验已表明细菌已对整个范围的抗生素产生了抵抗力。

本申请中任何文献的引用或鉴定并不承认这样的文献可用作本发明的现有技术。

发明概述

存在治疗虾中的ems/ahpnd的需求。在几个体内实验中，申请人已表明粘土和粘土共混物产品有助于缓解由来自产气荚膜梭状芽孢杆菌(cperfringens)的细菌毒素在鸡中引起的坏死性肠炎。本发明还涉及粘土和粘土共混物产品作为食物补充剂以改进生长和饲养效率的用途。

在虾中，ems/ahpnd被发现由副溶血弧菌引起。这些细菌也释放损害肠道的屏障(包括肝胰腺)的毒素。虽然所述毒素仍未被鉴定，它们可应用类似于许多其它损害肠道的毒素，例如来自产气荚膜梭状芽孢杆菌的α-毒素和netb毒素的机制。calibrin^®-z是一种可结合极性和非-极性毒素的广谱多毒素粘合剂。由于calibrin®-z可结合细菌α-毒素和netb毒素，它可能能够结合来自副溶血弧菌的未知的细菌毒素。

这导致了进行这样的研究，以了解粘土或粘土共混物产品是否将减少细菌毒素引起虾中的疾病早期死亡综合征(ems)/急性肝胰腺坏死病(ahpnd)的作用。

该产品的优选的实施方案可以是100%calibrin^®-z，钙蒙脱土粘土，其已被加热至减少水分的温度并被研磨至细粒径。这种处理，加热至400℃-800℃之间，和/或精细研磨(平均粒径32-36µm)，已表明增加粘土的跨多种真菌和细菌毒素的毒素结合能力。

除了优选的实施方案，能够结合毒素的其它材料也可以代替calibrin®-z，如可以使用其它粘土或吸附剂矿物质、硅藻土、硅酸盐，或用其它工艺，包括增加或减少干燥温度或时间或最终水分含量制造的这些材料(包括用于calibrin®-z的基础材料)、煅烧材料、添加表面活性剂的粘土，或研磨成较大或较小粒径的材料。

除了优选的实施方案，具有粘土的其它产品的共混物；如酵母来源，或酵母发酵产物、酵母甘露聚糖，或全酵母或酵母细胞的组分(如酵母细胞壁)或来自其它酵母菌种的酵母或酵母组分也可使用。甘露聚糖寡糖，和/或β葡聚糖的来源，或酵母的其它主要组分也可使用，包括但不限于，其它纤维或碳水化合物来源。除酵母外，任何其它来源如谷物、蘑菇，和可产生β-葡聚糖和甘露聚糖寡糖的细菌也可使用。谷氨酸盐的来源，或其它产生能量的氨基酸(包括但不限于：α-酮戊二酸盐、谷氨酰胺、天冬氨酸盐或支链氨基酸)，其它功能氨基酸或功能蛋白也可使用。

材料的包含百分比可从优选的实施方案中的那些增加或减少。

虽然优选的实施方案已表明具有抵抗由给予用副溶血弧菌培养物污染的饲料食物引起的ems/ahpnd的价值，它可能还具有在任何虾或养殖鱼物种，或其它物种如猪、牛、绵羊、山羊、马，或人中抵抗其它基于弧菌或梭菌或球菌的疾病或其它肠疾病的类似的作用。

因此，本发明的目的是在本发明范围内不涵盖任何先前已知的产品、制备产品的工艺，或使用产品的方法，使得申请人保留权利并由此公开放弃任何先前已知的产品、工艺，或方法。还要注意到，本发明不打算在本发明范围内涵盖不满足uspto(35u.s.c.§112，第一段)或epo(epc的第83条)的书面描述和实施要求的任何产品、工艺，或制备产品或使用产品的方法，使得申请人保留权利并由此公开放弃任何先前描述的产品、制备产品的工艺，或使用产品的方法。

要注意在本公开且特别是在权利要求书和/或各段中，术语如“包含”、“包括”、“含有”等可具有在美国专利法中赋予它的含义；例如，它们可意味着“包括”、“包含”、“包纳”等；并且术语如“基本由…组成”和“基本由…构成”具有在美国专利法中归属于它们的含义，例如，它们允许未明确描述的要素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新的特征的要素。

这些和其它实施方案被公开或从以下的详细描述中变得显而易见并由以下的详细描述涵盖。

附图简述

以下的详细描述(通过举例给出，但不打算将本发明仅仅限制于描述的具体实施方案)在结合附图时可得到最好的理解。

图1描述来自副溶血弧菌的蛋白毒素，其用和不用calibrin®-z培养并使用凝胶电泳以千道尔顿(kda)测量。在凝胶电泳中测量toxa的重的蓝色带(在第6道无calibrin®-z)为17千道尔顿(kda)和toxb为50kda。用calibrin®-z培养毒素减少toxa(如在第4、3、2和1道中所见到的)和toxb(如在第2和1道中所见到的)。

图2描述了从反向填喂(reversegavage)注入单独的ems毒素的上清液(0:1)或用增加的calibrin®-z与毒素的比率的时候开始，按小时记录虾的总死亡率，以百分比计。大多数死亡率发生在反向填喂后头4个小时内。在无毒素(pbs)组中，或当calibrin®-z用毒素按500:1或250:1的比率培养时，在头6个小时观察到没有虾死亡。单独用ems毒素注射给予的虾在4个小时的观察后，虾100%死亡。

发明详述

申请人已表明粘土和粘土共混物产品有助于缓解由来自产气荚膜梭状芽孢杆菌的细菌毒素在鸡中引起的坏死性肠炎。

本发明也涉及粘土和粘土共混物产品作为食物补充剂来改进生长和饲养效率的用途。

该产品的优选的实施方案可以是100%calibrin^®-z，一种钙蒙脱土粘土，其已被加热至减少水分的温度并被研磨至细粒径。这种处理，加热至400℃-800℃之间，和/或精细研磨(平均粒径32-36µm)，已表明增加粘土的跨多种真菌和细菌毒素的毒素结合能力。

除了优选的实施方案，能够结合毒素的其它材料也可以代替calibrin®-z，如可使用其它粘土或吸附剂矿物质、硅藻土、硅酸盐，或用其它工艺，包括增加或减少干燥温度或时间或最终水分含量制造的这些材料(包括用于calibrin®-z的基础材料)、煅烧材料、添加表面活性剂的粘土，或研磨成较大或较小粒径的材料。

除了优选的实施方案，具有粘土的其它产品的共混物；如酵母来源，或酵母发酵产物、酵母甘露聚糖，或全酵母或酵母细胞的组分(如酵母细胞壁)或来自其它酵母菌种的酵母或酵母组分也可使用。甘露聚糖寡糖，和/或β葡聚糖的来源，或酵母的其它主要组分也可使用，包括但不限于，其它纤维或碳水化合物来源。除酵母外，任何其它来源如谷物、蘑菇，和可产生β-葡聚糖和甘露聚糖寡糖的细菌也可使用。谷氨酸盐的来源，或其它产生能量的氨基酸(包括但不限于：α-酮戊二酸盐、谷氨酰胺、天冬氨酸盐或支链氨基酸)，其它功能氨基酸或功能蛋白也可使用。

所述材料的包含百分比可从优选的实施方案中的那些增加或减少。

虽然优选的实施方案已表明具有抵抗由给予用副溶血弧菌培养物污染的饲料食物引起的ems/ahpnd的价值，它可能还具有在任何虾或养殖鱼物种，或其它物种如猪、牛、绵羊、山羊、马，或人中抵抗其它基于弧菌或梭菌或球菌的疾病或其它肠疾病的类似的作用。

本发明涵盖用于治疗ems/ahpnd的抗毒素和任选的酵母，和msg-样材料。其它材料被认为是抗毒素的，例如其它粘土或矿物质、酵母或酵母组分、其它来源的纤维、β葡聚糖，或酶。其它免疫调节剂如酵母或酵母组分，或其它纤维、免疫球蛋白，或免疫球蛋白来源、甲壳素或皮质类固醇。肠道粘膜能量的其它来源例如有功能蛋白、谷氨酸、苏氨酸，或功能蛋白来源如血浆，或功能肽。如在此所用的，肽可以是短链氨基酸，如2-4个分子的谷氨酸盐或不同氨基酸与或不与谷氨酸盐的组合。

本发明也涉及在300和800℃之间加热粘土至多1小时。

本发明也涉及加热粘土，因为它可影响粘土的有效性。这可以使用马弗炉静态进行，或者在回转干燥炉或闪蒸干燥器中动态进行。该产品的优选的实施方案可以是约50-70%(w/w)的抗毒素、约25-45%(w/w)的免疫调节剂，其可以是酵母和约0.01-15%的肠道增强剂如谷氨酸单钠。抗毒素可以是钙蒙脱土粘土，其被有利地加热至100-800℃之间，有利地加热至400-800℃之间的温度，以减少水分并被研磨至细粒径。这种处理，加热至100-800℃之间，和/或精细研磨(具有大约20和50微米之间的平均粒径)已表明增加粘土的跨多种毒素的毒素结合能力。

酵母可以是在产生柠檬酸期间通过控制发酵过程产生的毕赤酵母(pichiayeast)产物并且也称为柠檬酸压滤饼。酵母可以是毕赤酵母。在有利的实施方案中，酵母是季也蒙毕赤酵母(pichiaguilliermondiiyeast)。其它毕赤酵母菌种包括，但不限于，异常毕赤酵母(p.anomala)、解磷毕赤酵母(p.farinose)、黑迪氏毕赤酵母(p.heedii)、克鲁维毕赤酵母(p.kluyveri)、膜璞毕赤酵母(p.membranifaciens)、挪威毕赤酵母(p.norvegensis)、奥默毕赤酵母(p.ohmeri)、巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)、甲醇毕赤酵母(p,methanolica)和亚膜毕赤酵母(p.subpelliculosa)。

谷氨酸单钠是氨基酸谷氨酸盐的一种形式。

除了优选的实施方案，能够结合毒素的其它材料可替代amlan产品，如可使用其它粘土或吸附剂矿物质、硅藻土、硅酸盐、沸石、绿坡缕石、海泡石组，或用其它工艺，包括增加或减少干燥温度或时间或最终水分含量制造的这些材料或这些材料的组合(包括用于amlan产品的基础材料)、煅烧材料，或研磨成较大或较小粒径的材料。除了研磨外，产生较小粒径的任何其它方法包括剥落至纳米尺寸也为本发明所考虑。

粘土可被加热至约100℃、约125℃、约150℃、约175℃、约200℃、约225℃、约250℃、约275℃、约300℃、约325℃、约350℃、约375℃、约400℃、约425℃、约450℃、约475℃、约500℃、约525℃、约550℃、约575℃、约600℃、约625℃、约650℃、约675℃、约700℃、约725℃、约750℃、约775℃、约800℃、约825℃、约850℃、约875℃、约900℃、约925℃、约950℃，或约1000℃。它可被加热1分钟至至多4小时。

粘土的平均粒径可以小至10纳米至高达500微米。平均粒径可有利地在20和50微米之间。

在一些实施方案中，粘土还可包含表面活性剂。表面活性剂可以是泥土表面活性剂或含有烷氧基化多元醇、湿润剂、烷基聚葡萄糖苷酯，和聚羧酸酯、钠盐的表面活性剂。表面活性剂也可包含泥土表面活性剂和湿润剂复合物的组合。

其它酵母来源，或酵母发酵产物、酵母甘露聚糖，或全酵母或酵母细胞的组分(如酵母细胞壁)或它们的混合物，或来自其它酵母菌种的酵母或酵母组分也可采用。甘露聚糖寡糖，和/或β葡聚糖的来源，或酵母的其它主要组分也可使用，包括但不限于，其它纤维或碳水化合物来源。益生元或益生元的共混物的其它来源也可使用。

谷氨酸盐的其它来源、谷氨酸，或任何它们的盐，或其它产生能量的氨基酸(包括但不限于：α-酮戊二酸盐、谷氨酰胺、天冬氨酸盐或支链氨基酸、l-谷氨酸或l-谷氨酰胺)，其它功能氨基酸、功能肽，或功能蛋白，或核苷酸也被考虑用于本发明。

所述材料的包含百分比可从优选的实施方案中的那些增加或减少。

当本发明的粘土、酵母和谷氨酸盐混合物被掺入虾或其它动物的饲料或水或饲养虾或其它水生动物的水中时，这可以本领域技术人员已知的方式进行。在优选的实施方案中，本发明的粘土、酵母和谷氨酸盐混合物被掺入预混料中。预混料将优选地包括粘土、酵母和谷氨酸盐混合物、生理学上可接受的载体和任选的饲料。预混料通常以相对浓缩的形式呈现并适合于用其它材料如一种或多种其它载体、维生素和矿物质补充剂和饲料稀释，以形成最终的动物饲料。预混料优选地包含0.1-70%重量，优选0.5-50%重量的范围内，更优选约0.25%重量的浓度的粘土、酵母和谷氨酸盐混合物。最佳浓度将取决于治疗是否是预防性的、用于控制或补救，以及本发明的粘土、酵母和谷氨酸盐混合物是否是唯一的活性剂或它是否用于与其它材料的伴随疗法，并且取决于受体的物种和年龄或生命阶段。

在优选的实施方案中，粘土、酵母和谷氨酸盐混合物的浓缩组合物以受控释放形式存在。受控释放形式将包含粘土、酵母和谷氨酸盐混合物和聚合材料，用于提供从受控释放体系的粘土、酵母和谷氨酸盐混合物的受控释放并特别用于加入到固体饲料材料中的组合物。由于受控释放制剂，粘土、酵母和谷氨酸盐混合物的释放可以延迟，使得主要发生在十二指肠。受控释放聚合物也可由于味道或用于直肠栓剂而最大限度地减少组合物的排斥反应。

在本发明中，术语"受控释放体系"被用于如在"控制药物递送(controlleddrugdelivery)"(robinson&lee,1987)中引用的相同的上下文中，并且包括如在其中引用的相同范围的实例。本领域(robinsonandlee,1987)已知的许多其它ph敏感性受控释放体系可替代丙烯酸聚合物或丙烯酰胺和丙烯酸的共聚物。例如，可溶性的和阴离子的，或不溶性交联的和阴离子的纤维质体系；或可溶性的和阴离子的，或不溶性交联的和阴离子的聚合物可衍生自任何通用丙烯酸聚合物和/或其衍生物。这样的交联和不溶性聚合物是优选的，因为它们膨胀，并且也不太可能被代谢。

本发明也提供包含本发明的粘土、酵母和谷氨酸盐混合物及饲料的动物饲料组合物。粘土、酵母和谷氨酸盐混合物优选地以全部饲料组合物的0.0001-25%且优选全部饲料组合物的0.0001-5%，更优选全部饲料组合物的约0.25%的量存在。

在另一个优选的实施方案中，本发明的粘土，或粘土、酵母和谷氨酸盐混合物可被配制以加入到其中饲养虾的水中。

本发明的粘土、酵母和谷氨酸盐混合物优选地以0.05-5000mg/kg体重/天，更优选100-1000mg/kg/天的量给予。

用于给予本发明的粘土、酵母和谷氨酸盐混合物的组合物的合适惰性载体的实例包括水、橄榄油、花生油、芝麻油、向日葵油、红花油、落花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯、聚乙烯醇、部分水解的聚醋酸乙烯酯及其混合物。

口服或直肠给予的固体形式可含有药学上或兽医学上可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖或类黄酮苷如新橙皮苷二氢查尔酮(neohesperidinedihydrochalcone)。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸氢二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙子或山莓调味剂。合适的包衣剂包括聚合物或丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的共聚物，和/或它们的酰胺、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或谷蛋白(gluten)。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素e、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石粉。合适的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于给予的悬浮剂还可包括分散剂和/或助悬剂。合适的助悬剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠或鲸蜡醇。合适的分散剂包括卵磷脂、聚氧乙烯酯或脂肪酸如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇单或二油酸酯、单或二硬脂酸酯或单或二月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单或二油酸酯、单或二硬脂酸酯或单或二月桂酸酯等。

粘土、酵母和谷氨酸盐混合物的组合物还可包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上所例举的分散剂或天然树胶如阿拉伯树胶或黄蓍胶。

用于以本发明的方法给予的组合物可通过用于制备组合物的领域(如兽医和药物组合物领域)已知的方式制备，包括共混、研磨、均质化、悬浮、溶解、乳化、分散和在合适时，将所述成分与选择的赋形剂、稀释剂、载体和辅助剂混合在一起。

对于口服给予，药物或兽医组合物可以呈现为片剂、含片、丸剂、糖锭剂、胶囊、酏剂、粉末(包括冻干粉末)、溶液、颗粒、悬浮剂、乳化剂、糖浆剂和酊剂的形式。缓释或延迟释放的形式也可以例如以包衣颗粒、多层片剂或微粒剂的形式制备。

进行研究以检查两种产品对由虾中的ems引起的死亡率的影响。产品是先前已表明可减少鸡中的细菌肠疾病坏死性肠炎的影响的产品。所述产品是：产品a)一种100%的粘土产品，calibrin®-z(a)；和产品b)是粘土、酵母产品，和谷氨酸单钠的共混物(b)。这些产品均以两种浓度0.25%和0.5%的食物进行试验。

喂食补充有粘土或粘土、酵母产品，和谷氨酸单钠的组合的食物并用副溶血弧菌培养物感染以诱导ems/ahpnd的虾表现出降低的死亡率。在研究结束时，喂食0.5%的产品a的虾的存活率是95%，而喂食0.25%的产品a的虾的存活率是85%。喂食0.5%包含率的产品b的那些虾具有52.5%的存活率，而喂食0.25%包含率的产品b的那些虾具有50%的存活率。喂食对照食物且未感染副溶血弧菌的组的存活率是92.5%，而喂食对照食物且被感染的那些组具有7.5%的存活率。组织学检查显示喂食含有产品a的食物的虾未显示出肝胰腺损害。

在口腔暴露于副溶血弧菌(引起急性肝胰腺坏死疾病的刺激物)之前，对幼小凡纳滨对虾(juvenilepenaeus(litopenaeus)vannamei)喂食4种含有由美国oil-dricorporation供应的专有产品的食物之一，持续7天以确定所述产品是否对存活率有影响。

在研究结束时，喂食产品a(0.5%包含率)的组的存活率是95%，而喂食产品a(0.25%包含率)的组的存活率是85%。产品b(0.5%包含率)的组的最终存活率是52.5%，而喂食产品b(0.25%包含率)的组的存活率是50%。在阳性对照组中，喂食对照食物的存活率是7.5%，而在阴性对照组中，也喂食对照食物的存活率是92.5%。

用于这项研究的动物最初从虾改进系统(shrimpimprovementsystems)获得。总共240只spf(无特定病原体)的凡纳滨对虾(p.vannamei)从uaz的西校区spf设施运来并储存在12个90l养鱼缸(aquaria)中，每缸20只动物。

8缸喂食用所述产品配制的食物(每种食物2缸)。2缸被指定为阳性对照和2缸用作阴性环境对照。阳性对照缸被喂食市售丸状虾食(rangen,inc.,40%蛋白)并用副溶血弧菌攻击，以确保攻击方法有作用并作为存活率的比较。阴性对照缸也喂食市售丸状对照食物，但不用副溶血弧菌攻击。对于完整的储存细节见表1。

所有的缸在研究期间喂食它们各自5%体重的食物，一天1次。所有的养鱼缸配备有牡蛎壳滤器、通气装置并用塑料薄膜覆盖，以减少交叉污染的风险。阴性对照缸被单独保持在一个单独的建筑物中并在副溶血弧菌攻击缸之前喂食。

两种产品被用于这项研究。第一种产品被标记为产品a，而第二种被标记为产品b。4种食物包括：

•产品a-0.5%包含率

•产品a-0.25%包含率

•产品b-0.5%包含率

•产品b-0.25%包含率

将试验材料与rangen(rangeninc.,11513ave.so.buhl,idaho)40%蛋白市售虾预混料、40%水，和粘合剂羧甲基纤维素(3%包含率)结合，然后通过绞肉机冷挤出。将产生的饲料在40℃干燥过夜，然后破碎成适当大小的丸料。

在ahpnd攻击之前，每缸喂食适当的食物总共7天。一旦ahpnd研究开始，则对所有的缸每天检查垂死的或死亡的动物。几只垂死的动物被保存在davidson的afa固定剂中并进行常规组织学处理。不是所有的死亡动物都通过固定保存，而是将所有的死亡的动物从缸中取出并冷冻。在研究结束时，将每缸中的2只活动物保存在davidson的afa固定剂中并将所有的剩余的动物冷冻。研究在最初暴露于ahpnd后15天结束。

在研究的ahpnd攻击部分的第0天，所有的攻击养鱼缸均喂食适当的食物(产品a或b或者对照食物)，所述食物已被浸泡在具有1.57光密度的诱导ahpnd的副溶血弧菌的肉汤中。到感染后(p.i.)第1天尚未在任何缸中注意到有死亡，因而在p.i.第2天，以在第0天的相同方式再次攻击所有的缸，但这次使用1.26光密度的肉汤。

到p.i.第7天，除了一个阳性对照缸外，在任何缸中未注意到有死亡，因此再次重新攻击缸，但这次它们在一天内被给予两种饲料。在ahpnd攻击的p.i.第8天，所有的ahpnd攻击养鱼缸喂食市售丸状虾食(rangeninc.,35%蛋白)，其已被浸泡在具有1.88光密度的诱导ahpnd的副溶血弧菌的肉汤中。在p.i.第8天下午，所有的ahpnd攻击养鱼缸喂食第二剂量的相同副溶血弧菌肉汤，但这次将肉汤在喂食前加入到各自的oil-dri食物中。

在研究期间，在阴性对照缸未注意到死亡或垂死的动物，虽然注意到数目减少，而丢失的动物被归因于同类相食。在感染后第15天(总共22天)研究结束时，从第一个缸收集在第0天储存20只动物中的总共20只活动物，而从第二个缸收集20只动物中的17只活动物。组合的最终存活率是92.5%，其单独的存活率分别是100%和85%。对于阴性对照缸二者的完整的存活率数据，请参阅表2。

食物1(0.5%包含率的产品a)：在ems暴露后第9天，一个喂食食物1的攻击缸中注意到1只垂死的动物。在这组缸中未注意到其它死亡或垂死的动物，虽然到感染后的第13天在一个缸中注意到数目减少。在感染后的第15天研究结束时，从第一个缸收集到总共18只活动物，而从第二个缸收集到20只活动物，导致存活率分别为90%和100%。该组的组合存活率是95%。对于每缸的存活率和死亡率值，请参阅表2和3。

食物2(0.25%包含率的产品a)：在研究期间，在喂食食物2的任一缸中未注意到死亡或垂死的动物，虽然在感染后的第13天注意到数目减少。丢失的动物可能是体弱的和在它们能从缸中取出前被完全同类相食。在研究结束时，从第一个缸收集到18只活动物，而从第二个缸收集到16只活动物，导致缸的存活率分别为90%和80%。对于该组的组合存活率是85%。对于每缸的存活率和死亡率值，请参阅表2和3。

食物3(0.5%包含率的产品b)：在暴露后第10天(最终暴露后第2天)，在喂食食物3的一个缸中注意到第一只死亡和垂死的动物。每天从第一个缸收集死亡和垂死的动物，直至p.i.第12天死亡终止时。在研究期间，从第二个缸未收集到死亡或垂死的动物，虽然在感染后第13天注意到数目减少。在研究结束时，从第一个缸收集到3只活动物，导致15%的存活率，而从第二个缸收集到18只活动物，导致90%的存活率。对于该组的组合最终存活率是52.5%。对于每缸的存活率和死亡率值，请参阅表2和3。

食物4(0.25%包含率的产品b)：在ems暴露后的第9天，在喂食食物4的两个缸中注意到第一只死亡和垂死的动物。每天收集死亡的动物，直至在暴露后第11天死亡终止。在研究结束时，从一个缸收集到4只活动物，导致20%的存活率，而从第二个缸收集到16只动物，导致80%的存活率。对于该组的组合最终存活率是50%。对于每缸的存活率和死亡率值，请参阅表2和3。

ahpnd阳性对照组(对照食物)：在感染后第3天，在一个凡纳滨对虾(p.vannamei)ahpnd阳性对照缸中注意到第一只死亡的动物。每天从第一个缸收集死亡和垂死的动物，直至在感染后第9天死亡停止。在感染后第9天，在第二个缸中注意到第一只死亡的动物，且继续直至第10天死亡停止时。在研究结束时，从第一个缸收集到总共2只活动物，导致5%的存活率，而从第二个缸收集到2只活动物，导致10%的存活率。在阳性对照组中的组合存活率是7.5%(见表2和3)。

代表性垂死的或存活的动物的组织学检查示于表4中，其从这个实例概述了组织学结果。

表1.用于ahpnd攻击的所有缸的定义

表2.ahpnd攻击的存活率结果

表3.ahpnd攻击的缸的每日死亡率

注释：第1天=引入副溶血弧菌至所有的攻击缸后1天.

表4.来自ahpnd攻击的组织学发现的概述

注释：

1)ahpnd/ems=急性肝胰腺坏死疾病，也称为早期死亡综合征的损害诊断。

2)g-痕迹至g4=感染/损害的严重性等级，依据所附的严重性等级表。在括号左侧的数字表示受影响的虾的数目。

附表1

使用calibrin®-z重复研究，因为在先前的研究中，已表明它对由虾中的早期死亡综合征(ems)或急性肝胰腺坏死病(ahpnd)引起的死亡率具有最有益作用。在食物的两个浓度(0.25%和0.5%)下对这种产品进行试验。

喂食补充有calibrin®-z的食物且用副溶血弧菌培养物感染以诱导ems/ahpnd的虾与未喂食calibrin®-z的攻击组比较，显示出减少的死亡率。在研究结束时，喂食0.25%包含率的calibrin®-z组的存活率是66.7%，而在喂食0.5%包含率的calibrin®-z的组中，存活率是39.8%。阳性对照组(用副溶血弧菌攻击且喂食对照食物的组)的存活率是1.5%，而也喂食对照食物的阴性(未攻击的)对照组的存活率是100%。组织学检查显示，喂食含有calibrin®-z的食物的虾未显示出肝胰腺损害。

在口腔暴露于副溶血弧菌(引起ahpnd的刺激物)之前，对幼小凡纳滨对虾(juvenilepenaeus(litopenaeus)vannamei)喂食含有由美国oil-dricorporation供应的专有产品的两种食物(0.25或0.5%包含率)之一达7天，以确定该产品是否将对存活率具有影响。

在研究结束时，喂食0.25%包含率的calibrin®-z的组的存活率是66.7%，而喂食0.5%包含率的calibrin®-z的那些组具有39.8%的存活率。阳性对照组(喂食对照食物)的存活率是1.5%，而也喂食对照食物的阴性对照组(唯一未攻击的组)的存活率是100%。

用于这项研究的动物最初从虾改进系统(shrimpimprovementsystems)获得。总共264只spf(无特定病原体)的凡纳滨对虾(p.vannamei)从arizona大学西校区spf设施(universityofarizona’swestcampusspffacility)运来并储存在12个90l养鱼缸中，每缸22只动物。

6缸喂食用所述产品配制的食物(每种食物3缸)。3缸被指定为阳性对照和3缸用作阴性环境对照。阳性对照缸被喂食市售丸状虾食并用副溶血弧菌攻击，以确保攻击方法有作用并作为存活率的比较。阴性对照缸也喂食市售丸状对照食物，但不用副溶血弧菌攻击。一个阴性对照缸放置在ahpnd攻击缸旁边，而余下的两个缸被单独保持在一个单独的建筑物中。对于完整的储存细节见表5。

所有的缸在研究期间喂食它们各自5%体重的食物，一天1次。所有的养鱼缸配备有牡蛎壳滤器、通气装置并用塑料薄膜覆盖，以减少交叉污染的风险。所有的阴性对照缸被单独保持在一个单独的建筑物中并在副溶血弧菌攻击鱼缸之前喂食。

产品calibrin®-z被用于这项研究。制得的3种食物包括：食物1-0.25%包含率的calibrin®-z，食物2-0.50%包含率的calibrin®-z和食物3-对照食物(无calibrin®z)。

将试验材料与rangen(rangeninc.,11513ave.so.buhl,idaho)40%蛋白市售虾预混料、40%水，和粘合剂羧甲基纤维素(3%包含率)结合，然后通过绞肉机冷挤出。将产生的饲料在40℃干燥过夜，然后破碎成适当大小的丸料。

在ahpnd攻击之前，每缸喂食适当的食物总共7天。一旦ahpnd研究开始，则对所有的缸每天检查垂死的或死亡的动物。几只垂死的动物被保存在davidson的afa固定剂中并进行常规组织学处理。不是所有的死亡动物都通过固定保存，而是将所有的死亡的动物从缸中取出并冷冻。在研究结束时，将每缸中的1-2只活的幸存者保存在davidson的afa固定剂中并将任何剩余的动物冷冻。研究在最初暴露于ahpnd后7天结束。

与先前的研究不同，造成ahpnd的副溶血弧菌(越南分离株)(具有减少的1.5光密度)的18-20小时培养物被用于这项研究。在研究的ahpnd攻击部分的第0天，所有的攻击养鱼缸均喂食市售丸状虾食(rangeninc.,40%蛋白)，其已被浸泡在含有0.071光密度的诱导ahpnd的副溶血弧菌(具有5.0x10⁵菌落形成单位)的肉汤中。到感染后的(第0天)下午，所有的ahpnd攻击养鱼缸喂食第二剂量的相同的副溶血弧菌肉汤，但这次将肉汤在喂食前加入到各自的食物中。同一天，对每缸中的所有动物计数，以获得ahpnd攻击当天(0天)的实际最初数目(见表6)。

到感染后第2天，尚未在任何攻击缸中注意到有死亡，因而在感染后第3天，以在第0天的相同方式再次攻击所有的缸，但这次使用1.75光密度的肉汤(具有1.1x10⁹菌落形成单位)。

在研究期间，在阴性对照缸中未注意到死亡或垂死的动物。在研究结束时，即感染后第10天，从所有的3个阴性对照缸收集到在感染后第0天计数的21只动物的总共21只活动物，导致单独和组合存活率均为100%。对于关于所有3个阴性对照缸的完整的存活率数据，请参考表6。

食物1(0.25%包含率的calibrin®z)：在初始攻击后的第4天开始，在喂食食物1的攻击缸之一注意到第一只死亡的动物。每天从该缸收集死亡和垂死的动物，直至最后的动物在感染后第6天死亡。在攻击研究期间，在剩余的两个缸中未注意到死亡或垂死的动物。在研究结束时，在感染后第10天，从第一个缸未收集到幸存者，而从剩余的两个缸中收集到19和20只幸存者，导致存活率分别为0%和100%。该组的组合存活率是66.7%。对于每缸的存活率和死亡率值，请参阅表2和3。

食物2(0.5%包含率的calibrin®z)：在感染后第3天开始，在喂食食物2的两个缸中注意到第一只死亡和垂死的动物。从这两个缸每天收集死亡和垂死的动物，直至在感染后第7天死亡停止。在攻击研究期间，在该组的最后一缸中未注意到死亡或垂死的动物。在研究结束时，从第一个缸收集到3只活动物，从第二个缸收集到1只动物，而从最后一缸中收集到20只活动物。各缸的存活率分别是14%、5%和100%。该组的组合存活率是39.8%。对于每缸的存活率和死亡率值，请参阅表6和7。

ahpnd攻击组(对照食物)：在感染后第3天，在一个ahpnd阳性对照缸中注意到第一只死亡的动物。在感染后第4天在第二个缸和在感染后第5天在第三个缸中注意到第一只死亡的动物。从所有3个缸中每天收集死亡和垂死的动物，直至在感染后第8天后死亡停止。在研究结束时，从两个缸中未收集到活动物，而从最后一缸收集到1只活动物，导致两个缸的0%存活率和最后一缸的4%存活率。阳性对照组的组合存活率是1.5%(见表6和7)。

代表性的垂死的或存活的动物的组织学检查示于表8中，其从这个实例概述了组织学结果。

表5.用于amlanindustriesahpnd攻击的所有的缸的定义.

进行另一项研究以检查calibrin®-z对副溶血弧菌体外产生毒素的结合作用和通过反向填喂体内注入对虾的毒性。用导致虾中的早期死亡综合征(ems)或急性肝胰腺坏死病(ahpnd)的两种毒素培养calibrin®-z减少在溶液中游离的毒素的量。当在将上清液反向填喂注入虾之前用毒素培养calibrin®-z时，死亡率从95%(对照)减少至5%(calibrin®-z)。

在体外研究中，用1mg诱导ems的副溶血弧菌的细菌毒素部分培养不同浓度(500、250、125、62.5和31.25mg)的calibrin®-z。从60%硫酸铵沉淀的诱导ems的副溶血弧菌的培养肉汤制备毒素部分，所述毒素在用calibrin®-z培养之前进行透析。

在室温下，在伴有温和搅拌30min的培养后，将混合的溶液离心(在4℃、6000rpm下持续15min)，且收集上清液并分成两份。将1份上清液(约20µg总蛋白)用于体外研究，使用凝胶电泳(12%sds-page)，测出在上清液中剩余的毒素的量，且通过cbb-g250染色使图案可视化。第二份(约40µg总蛋白)通过将上清液反向填喂注入活虾内而用于进行体内研究。以相同方式制备对照组的上清液，但不加入calibrin-z。

用于体内研究的白虾具有2-4克鲜重。对于每一治疗的10只虾被用于毒素注入，该研究重复两次。经由反向填喂注入来自体外研究的上清液(用在非-calibrin®-z处理的上清液中给出10µg总蛋白/每克体重的相同体积)。在注入后首个6小时内的每小时观察虾死亡率，然后在24小时观察。在实验结束时，收集垂死的虾并在davidson固定剂中固定用于组织学检查，以证实死亡确由ems毒素引起。

体外：细菌毒素制剂含有称为toxa和toxb的两种毒素蛋白。toxa具有约17kda(千道尔顿)的重量，而toxb具有约50kda的重量。这可通过观察图1的第6道来发现并将在那里见到的蓝带与在最左边见到的运行的标准重量比较。17kda的toxa带在1mg毒素用125mgcalibrin®-z(第3道)培养后消失。toxb的减少和toxa带的消失可在第2道中发现，其为当毒素用250mgcalibrin®-z培养的时候。当毒素制剂用500mgcalibrin®-z(第1道)培养时，毒素a和毒素b两条带完全消失。当重复该试验时，发现类似的结果。

体内：在反向填喂注入后，在首个6小时内，每小时记录虾死亡率(exp1)，数据呈现于图2中。死亡主要发生在注入后首个4小时内。死亡的虾的肝胰腺检查确定ems是死亡的原因。

不含毒素(pbs)的缓冲溶液，或500:1或250:1的calibrin®-z:毒素比率的治疗组在观察的6小时内没有死亡。250:1和更高比率的calibrin®-z:毒素完全防止在这一期间ems诱导的死亡。对两项研究在注入后24h所见到的死亡率示于表1中。只有来自毒素制剂用125、250和500mgcalibrin®-z培养和对照组的结果表示于表中，因为较低量的calibrin®-z未表现出有益的作用。结果的模式类似于体外研究的那些。500mg量的calibrin®-z是在治疗中最有效的浓度。当calibrin®-z未加入时，死亡率高达95%，但当加入500:1的calibrin®-z:毒素时，死亡率仅为5%。这提示calibrin®-z可减少由引起ems的细菌毒素(toxa和toxb)诱导的死亡。

在家畜、家禽和水产养殖业中，细菌毒素是对全球动物蛋白生产的一种严重威胁。在这些研究中，calibrin®-z减少副溶血弧菌毒素(toxa和toxb)的量，该毒素是ems/ahpnd的病因。这可使用凝胶电泳和活虾二者发现。总之，calibrin®-z提供毒素控制的层以减少由ems引起的死亡。

虽然本发明及其优点已得到详细描述，应该理解各种改变、取代和变更可在此进行，而不偏离如在所附权利要求书中限定的本发明的精神和范围。

如此详细描述了本发明的优选实施方案，要理解由以上段落定义的本发明并不限于以上说明书中阐述的具体细节，因为其不偏离本发明的精神和范围的许多明显的变化是可能的。